JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

Özet

Ca 2 + görüntüleme, aksiyon potansiyelleri ve Ca 2 + sitoplazmaya girişi veya hücre içi Ca 2 + depolarının salınımını içeren çeşitli sinyal mekanizmaları dahil olmak üzere hücresel aktivite için bir proxy olarak kullanılabilir. Farelerde dorsal kök ganglionunun (DRG) birincil duyusal nöronlarının Pirt-GCaMP3 tabanlı Ca2+ görüntülemesi, çok sayıda hücrenin aynı anda ölçülmesinin avantajını sunar. 1.800'e kadar nöron izlenebilir, bu da nöronal ağların ve somatosensoriyel süreçlerin in vivo popülasyon düzeyinde normal fizyolojik bağlamlarında bir topluluk olarak incelenmesine izin verir. İzlenen çok sayıda nöron, diğer yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olacak aktivite kalıplarının tespit edilmesini sağlar. Uyaranlar, fare arka pençesine uygulanabilir ve uyaranların DRG nöron topluluğu üzerindeki doğrudan etkilerinin incelenmesine izin verir. Ca2+ geçicilerini üreten nöronların sayısı veCa2+ geçicilerinin genliği, spesifik duyusal modalitelere duyarlılığı gösterir. Nöronların çapı, aktif lif tiplerinin (zararlı olmayan mekanolara karşı zararlı ağrı lifleri, Aβ, Aδ ve C lifleri) kanıtını sağlar. Spesifik reseptörleri eksprese eden nöronlar, Pirt-GCaMP ile birlikte td-Domates ve spesifik Cre rekombinazları ile genetik olarak etiketlenebilir. Bu nedenle, DRG'nin Pirt-GCaMP3 Ca2 + görüntülemesi, ağrı, kaşıntı, dokunma ve diğer somatosensoriyel sinyalleri incelemek için popülasyon düzeyinde bir topluluk görevi gören spesifik duyusal modalitelerin ve nöron alt tiplerinin analizi için güçlü bir araç ve model sağlar.

Giriş

Primer duyusal nöronlar doğrudan cildi innerve eder ve somatosensoriyel bilgiyi merkezi sinir sistemine geri taşır 1,2. Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), 10.000-15.000 birincil duyusal nöronunhücre gövdesi kümeleridir 3,4. DRG nöronları farklı boyutlarda, miyelinasyon düzeylerinde ve gen ve reseptör ekspresyon paternleri sunar. Daha küçük çaplı nöronlar ağrıyı algılayan nöronları içerir ve daha büyük çaplı nöronlar tipik olarak ağrılı olmayan mekanik uyaranlara cevap verir 5,6. Yaralanma, kronik inflamasyon ve periferik nöropatiler gibi birincil duyusal nöronlardaki bozukluklar, bu nöronları çeşitli uyaranlara duyarlı hale getirebilir ve kronik ağrı, allodini ve ağrı aşırı duyarlılığına katkıda bulunabilir 7,8. Bu nedenle, DRG nöronlarının incelenmesi hem genel olarak somatosensation hem de birçok ağrı ve kaşıntı bozukluğunu anlamada önemlidir.

İn vivo ateşlenen nöronlar somatosensitasyon için gereklidir, ancak yakın zamana kadar, in vivo bozulmamış gangliyonları incelemek için kullanılan araçlar nispeten azsayıda hücre 9 ile sınırlıydı. Burada, nöronların aksiyon potansiyellerini veya aktivitelerini in vivo olarak popülasyon düzeyinde bir topluluk olarak incelemek için güçlü bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, sitoplazmikCa2 + dinamiklerine dayanan görüntüleme kullanır. Ca 2 + hassas floresan göstergeleri, normalde düşük sitoplazmik Ca2 + konsantrasyonu nedeniyle hücresel aktiviteyi ölçmek için iyi proxy'lerdir. Bu göstergeler, farelerde 9,10,11,12,13,14,15,16 vesıçanlarda 17 olmak üzere yüzlerce ila birkaç bin birincil duyusal nöronun aynı anda izlenmesine izin vermiştir. Bu çalışmada açıklanan in vivo Ca2+ görüntüleme yöntemi, mekanik, soğuk, termal ve kimyasal uyaranlara karşı popülasyon düzeyindeki tepkileri doğrudan gözlemlemek için kullanılabilir.

Fosfoinositid bağlayıcı membran proteini Pirt, hemen hemen tüm (% >95) birincil duyusal nöronlarda yüksek seviyelerde eksprese edilir 18,19 ve in vivo20 nöron aktivitesini izlemek için Ca2 + sensörü GCaMP3'ün ekspresyonunu sürmek için kullanılabilir. Bu protokolde, in vivo DRG cerrahisi, Ca2+ görüntüleme ve Pirt-GCaMP3 farelerinin sağ taraf lomber 5 (L5) DRG'sinde analiz yapmak için teknikler tanımlanmıştır14 konfokal lazer tarama mikroskobu (LSM) kullanarak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada açıklanan tüm prosedürler, San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Bir kez başladıktan sonra, hayvan cerrahisi (adım 1) ve görüntüleme (adım 2) sürekli olarak tamamlanmalıdır. Veri analizi (adım 3) daha sonra yapılabilir.

1. Sağ taraf L5 DRG görüntüleme için hayvanın ameliyatı ve emniyeti

NOT: Bu çalışmada 8 haftalık ve daha büyük hem erkek hem de dişi Pirt-GCaMP3 C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Her iki cinsiyet de eşit derecede iyi görüntülenebilirken, genç farelerde zayıf veya aralıklı Pirt ifadesi nedeniyle fareler en az 8 haftalık olmalıdır. Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J fareler Johns Hopkins Üniversitesi14'te üretildi. Her iki taraf DRG de görüntülenebilir ve diğer lomber DRG'ler (örneğin, lomber 4) görüntülenebilir. Verilen süreler deneyimli bir cerrah için tahminidir. Artan kanama gibi ara sıra ortaya çıkan teknik sorunlar gereken süreyi artırabilir.

  1. 40 mg / mL ketamin ve 6 mg / mL ksilazin içeren steril bir salin çözeltisi hazırlayın. Görüntüleme sonrası hem cerrahi hem de ötenazi için toplam hacim en az 9 μL / g vücut kütlesi olmalıdır.
    DİKKAT: Ketamin enjekte edildiğinde, yutulduğunda veya gözle temas ettiğinde zararlıdır. Dikkatli kullanın.
  2. Tüm cerrahi aletlerin otoklavlama veya Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu onaylı yöntemle temiz ve sterilize edildiğinden emin olun.
  3. Ameliyattan 15 ila 25 dakika önce, her gram vücut ağırlığı için ~ 2.25 μL ketamin / ksilazin (90 mg / kg ketamin, 13.5 mg / kg ksilazin) ile intraperitoneal olarak (yani bir Pirt-GCaMP3 faresi) enjekte edin. 120 mg/kg ketamini aşmayın.
  4. Anestezi enjeksiyonundan sonraki 15 ila 25 dakika içinde (adım 1.3), kontralateral arka pençeyi (ipsilateral / sağ arka pençeyi değil) sıkıştırarak farenin anestezinin cerrahi düzlemine ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin. Arka bacak çekilme refleksinin yokluğu, cerrahi bir anestezi düzleminin elde edilmesini sağlar.
    NOT: Arka bacak çekilme refleksi, anesteziyi izlemek için deney boyunca kullanılır. Her zaman kontralateral arka pençeyi kullanın.
  5. Vücut ısısını 37 °C'de tutmak için fareyi ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin.
    NOT: Farenin kafasını stereotaksik bir çerçeve (bkz. Malzeme Tablosu) veya araştırmacının tercihine göre başka bir çerçeve ile yerinde tutmak yararlı olabilir.
  6. Farenin pelvik kemiğini hissederek bel genişlemesini bulun. Farenin arkasını bel genişleme alanının üzerinde tıraş edin. Bu adım ~ 90 s sürmelidir.
    NOT: Fare, tıraş için ısıtılmış pedden kısa bir süre çıkarılabilir.
  7. Makas kullanarak bel genişlemesinin üzerinde üç taraflı dikdörtgen bir kesi (8 mm x 20 mm) yapın ve cildi forseps ile katlayın (Şekil 1A). Bu adım ~ 2 dakika sürer.
    NOT: Araştırmacılar ayrıca insizyonu açık tutmak için hemostat forseps veya bir retraktör kullanabilirler. Bu bir sağkalım ameliyatı değildir, bu nedenle cerrahi alanın ek temizliği gerekli değildir; Bununla birlikte, povidon-iyot kullanılarak yapılabilir. Kabul edilebilir en büyük kesi boyutu burada verilir. Daha küçük bir insizyon, daha büyük bir insizyona tercih edilir.
  8. Omurganın sağ tarafında 3-4 mm'lik kesikler yapmak için 13 mm'lik yaylı diseksiyon makasını kullanın. Omurgayı açığa çıkarmak için cildi ve kasları yanlara doğru kesmek için makas kullanın (Şekil 1B). Bu adım ~ 3 dakika sürer.
  9. Kanamayı en aza indirmeye çalışırken kas ve bağ dokusunu keserek sağ taraftaki L5 DRG'nin enine sürecini temizlemek için 8 mm makas kullanın. Kanı emmek için pamuk ve / veya jel köpük kullanın. L5 vertebrası, pelvik kemiğine giden ilk vertebra rostralidir.
    NOT: Bu adım ~ 3 dakika sürer ve hayvan normalden fazla kanarsa fazladan zaman alabilir.
  10. Friedman-Pearson rongeurs veya güçlü ince forsepsler kullanarak sağ taraftaki L5 enine prosesini kesin. DRG'ye dokunmamaya dikkat edin (Şekil 1C).
    NOT: Bu adım ~ 2 dakika sürer, ancak hayvan normalden daha fazla kanarsa fazladan zaman alabilir.
  11. Kanama tamamen durana kadar devam etmeyin. Jel köpük veya pamuk kullanarak DRG yüzeyine kanamayı önleyin. Bu adım 1-4 dakika sürer.
  12. Fareyi ve ısıtma yastığını özel sahne üzerine getirin (Şekil 2A,B). Hayvanı ve ısıtma yastığını yerine sabitlemek için sahne bandı kullanın. Hayvanın burnunu burun konisine yerleştirin, böylece hayvan sürekli izofluran anestezisi alabilir. Sağ arka pençeyi sahneden dışarı çıkararak sabitleyin, böylece uyaranlar pençeye kolayca uygulanabilir. Bu adım 3 dakika sürer.
  13. Omurgayı, omurlardaki deri üzerindeki sahne kelepçeleri ve / veya pelvik kemiğin L5 DRG'ye sadece rostral ve kaudal olarak yerine sabitleyin. DRG'nin yüzeyini mümkün olduğunca düz hale getirmek için kelepçeleri ve sahneyi ayarlayın (Şekil 2B, C).
    NOT: DRG ile hedef arasında kalan dokunun kesilmesi gerekebilir.
  14. Aşamayı mikroskopun altına, hedef indirildiğinde DRG'nin hemen üzerinde 8 mm olacak şekilde yerleştirin (Şekil 3A, B). Rektal termometreyi takın.
    NOT: DRG'den hedefe olan mesafe nesneye, mikroskopa ve hayvana bağlı olarak değişebilir.
  15. Güç hatlarını ısıtma yastığına ve rektal termometreye bağlayın. Burun konisini izofluran gaz hatlarına bağlayın.

figure-protocol-5788
Şekil 1: DRG maruziyet cerrahisi örneği . (A) Küçük bir alan traş edildi ve cilt kesilip geriye doğru katlandı. Kesi rostral-kaudal eksende ~10 mm'dir. (B) Omurganın sağ tarafında bir kesi yapıldı ve kas ve bağ dokusu kesilerek L5 sağ taraf enine süreci ortaya çıkarıldı. Kan jel köpük ile emildi. (C) Enine işlem temizlendi ve DRG üzerindeki kemik çıkarıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-6569
Şekil 2: DRG görüntüleme için fareyi özel bir sahne alanına bağlama . (A) Özel sahne alanı gösterilir. Bir taban plakası ve hayvan için bir plakadan oluşur. Hayvan montaj plakası bir kilitleme bilyesi ve soket döner eklemi üzerindedir. Oksijen / izofluran karışımını iletmek için hatlara sahip bir burun konisi ve alüminyum folyo sarılı bir ısıtma yastığı ile birlikte bir atık gaz hattı hayvan montaj plakasına bantlanır. Her biri üç kilitleme bilyasından ve soket döner bağlantılarından yapılmış iki kol, taban plakasına cıvatalanır. Her kolun sıkma ve gevşetme için vidalı forsepslerden yapılmış bir kelepçesi vardır. (B) Hayvan, hayvan montaj plakasına monte edilir. Burnu burun konisine yerleştirilir. Kelepçeler, omurga ve pelvik kemiği tutan cildin üzerine yerleştirilir. Sağ (ipsilateral) arka pençe, uyaranları uygulamak için kolay erişim için yapışacak şekilde bantlanır. (C) Kelepçeli omurga kolonu ve pelvik kemiğin yakın çekim görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-7941
Şekil 3: Özel sahnedeki hayvan, mikroskop hedefinin altına yerleştirilmiştir . (A) Sahnenin, hayvanın ve mikroskobun geniş açılı görünümü. DC sıcaklık kontrolörüne giden teller ve oksijen / izofluran girişine ve atık gaz hattına giden hatlar solda görülebilir. (B) Mikroskop hedefinin altındaki hayvanın yakından görünümü. DRG, hedefin ~ 8 mm altındadır. Rektal termometre yerleştirilir ve burun burun konisinin içindedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. DRG görüntüleme

  1. Görüntüleme için dik bir konfokal mikroskop 10x/0.4 DIC hedefi ve ilgili yazılımı (bkz. Yeşil filtre (FITC) ayarlarını kullanın: uyarma 495 nm, emisyon 519 nm, algılama dalga boyu 500-580 nm, GaAsP-Pmt1 görüntüleme cihazı, GaAsP-PMT dedektörü.
    NOT: Diğer mikroskoplar için üreticinin önerdiği ayarları kullanın.
  2. DRG'nin yüzeyini mikroskopla bulun. Sahne alanındaki kelepçeleri, DRG yüzeyi mümkün olduğunca düz olacak ve maksimum yüzey alanı odak düzleminde görselleştirilecek şekilde ayarlayın.
    NOT: Hedef seçimi, kullanılan mikroskopa ve kullanıcı tercihine bağlı olarak değişebilir. Yazılım seçimi mikroskopa bağlıdır. Bir seviye DRG daha net görüntülerle sonuçlanır, yazılımın daha net filmler oluşturmasına izin verir, daha fazla nöronun görüntülenmesine izin verir ve analizi daha kolay ve daha doğru hale getirir.
  3. Farenin anestezi altında kalmasını sağlamak için burun konisine oksijen akışında% 1 -% 1.5 izofluran sağlayın. Doz aşımı olmadan izofluran anestezisini korumak için prosedür boyunca hayvanı dikkatlice izleyin.
    NOT: Anesteziyi sürdürmek için gerekli izofluran miktarı bireysel hayvana ve uyarana göre değişebilir. Genellikle,% 1.5 yeterlidir. Hayvan uyaran sırasında hareket ederse, izofluran arttırılmalıdır. Solunum sığlaşırsa, izofluran azaltılmalıdır. Her uyarandan önce, arka bacak çekilme refleksini kontralateral arka pençe üzerinde test edin.
    DİKKAT: İzofluran zararlı olabilir veya solunduğunda baş dönmesine veya uyuşukluğa neden olabilir. Solumaktan kaçının ve sadece iyi havalandırılan bir alanda kullanın.
  4. Mikroskop hızlı tarama protokolünü yükleyin.
    1. Hızlı tarama için tipik ayarları kullanın: voksel boyutu 2,496 μm x 2,496 μm x 16 μm, 512 x 512 piksel, 10 optik dilim Z yığını, 1 havadar birim (AU)/32 μm, %1 488 nm lazer gücü 5 mW, piksel süresi 1,52 μs, satır süresi 0,91 ms, kare süresi 465 ms, LSM tarama hızı 8, çift yönlü tarama, GaAsP-PMT dedektörü kazanç 650 V, dijital kazanç 1. En uygun ayarlar mikroskop ve hayvana göre değişebilir.
    2. Hızlı bir tarama protokolü ayarlamak için, Edinme sekmesine tıklayın. Alma Parametreleri altında, Çerçeveler sekmesine tıklayın. Mikroskobu 512 piksel x 512 piksel görüntü kaydedecek şekilde ayarlamak için 512 x 512 > Ön Ayarlar'a tıklayın. Bu da, mikroskop yazılımı tarafından belirlenen görüntü boyutuna bağlı olarak voksel boyutunun X ve Y değerlerini ayarlayacaktır.
    3. Edinme Parametreleri altında, Kanallar sekmesine tıklayın. Track2 kutusuna tıklayın. Yeşil (FITC) seçeneğini belirlemek için Track2 kutusunun yanındaki açılır menüyü kullanın. Track2'nin altında yeni bir sekme açılacaktır.
    4. Lazerler'in yanında, 488 kutusuna tıklayın. Bu, uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayacaktır.
    5. 488 nm kaydırıcının yanında, Lazer Gücü'nü %1'e ayarlayın. 1 Airy ünitesi için aperatürü ayarlamak üzere 1 AU düğmesine tıklayın. FITC altında, Ana Kazanç'ı 650 V, Dijital Ofset'i 0 ve Dijital Kazanç'ı 1 olarak ayarlayın.
    6. Edinme sekmesi altında, Z-Stack kutusunu işaretleyin. Ganglion'un canlı görüntüsünü görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın. Odak düzlemi düğmesini yalnızca küçük bir nöron arkı görünene kadar yukarı çevirin.
    7. Edinme Parametreleri altında, Z-Stack sekmesine tıklayın > Son Ayarla düğmesine basın. Odak düzlemi düğmesini yalnızca küçük bir nöron arkı görünene kadar aşağı çevirin. Edinme Parametreleri altında, Z-Stack sekmesine tıklayın > İlk Ayarla düğmesine basın. Canlı görüntüyü kapatmak için Canlı düğmesine tıklayın.
    8. Edinme Parametreleri altında, Z-Stack sekmesine tıklayın. Dilimler alanını 10 ile doldurun. Bu, 10 optik dilim ayarlayacak ve voksel derinliğini otomatik olarak belirleyecektir.
    9. Edinme sekmesi altında, Zaman Serisi kutusuna tıklayın. Alma Parametreleri altında yeni bir Zaman Serisi sekmesi görünecektir. Zaman Serileri sekmesine > Döngüler alanına bir sonraki adımda yapmak istediğiniz döngü sayısını tıklayın. Bu durumda, 8'dir.
    10. Tarama hızını ve yönünü ayarlayın. Alma Parametreleri altında, Edinme Modu sekmesi tek yönlü tarama için Yön > Çift Başlı Ok'u > >. Frame > Scan Speed Slider > 8 > Edinme Modu sekmesini seçin.
      NOT: Normalde önceki bir denemenin ayarları yüklenebilir ve lazer gücünü yalnızca görüntü çok parlak veya loşsa ayarlamanız ve Z-Stack Set Last ve Set First'ü ayarlamanız gerekir.
  5. Edinme sekmesinin altındaki Denemeyi Başlat'a tıklayarak DRG'nin 8 döngülük kısa bir taramasını yapın. Zaman içinde taramaların ortogonal projeksiyonunu (kare başına bir tarama) yaparak bir film oluşturun ve DRG'yi geçen parlaklığın "dalgaları" gibi görüntü netliğini ve görüntüleme yapıtlarını manuel olarak kontrol edin. Kelepçe konumunu ve optik bölüm kalınlığını ayarlayın ve net, yüksek kaliteli bir film elde edilene kadar bu adımı tekrarlayın.
    NOT: Bu adım, hayvan araştırmacı tarafından hareket ettirilirse veya hareket ettirilirse tekrarlanmalıdır. Aranması gereken problemler, ganglion alanlarının (sadece tek nöronların değil) deney boyunca daha açık ve daha koyu hale geldiği, dalgalı bir görünüm yarattığı veya alanların kaybolmasına veya daha parlak hale gelmesine neden olduğu alanları içerir. Küçük bir nöronun çapının yaklaşık yarısından (<20 μm) daha büyük hareket başka bir önemli sorundur. Dalgalılık genellikle Z-Stack'in ilk ve son konumunu birbirine yaklaştırarak (yukarıdaki adım 2.4.4'e bakın) ve optik dilim kalınlığını daraltarak düzeltilebilir. Film 1 , doğru optik dilim kalınlığını tesviye etmeden ve ayarlamadan önce dalgalı bir ganglion örneği sunar. Film 2 , tesviye ve optik dilim kalınlığını düzelttikten sonradır. Aradaki fark incedir, ancak analiz üzerinde muazzam bir etkisi vardır.
  6. Mikroskop yüksek çözünürlüklü tarama protokolünü yükleyin.
    1. Yüksek çözünürlüklü tarama için tipik ayarları kullanın: voksel boyutu 1,248 μm x 1,248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 piksel, 6 optik dilim Z-yığını, 1,2 havadar birim (AU)/39 μm, %5 488 nm lazer gücü/25 mW, piksel süresi 2,06 μs, çizgi süresi 4,95 ms, kare süresi 5,06 sn, LSM tarama hızı 6, çift yönlü tarama, GaAsP-PMT dedektörü kazanç 650 V, dijital kazanç 1. En uygun ayarlar mikroskop ve hayvana göre değişebilir.
    2. Yüksek çözünürlüklü bir tarama protokolü ayarlamak için, Edinme sekmesine tıklayın. Alma Parametreleri altında, Çerçeveler sekmesine tıklayın. Mikroskobu 1024 piksel x 1024 piksel görüntü kaydedecek şekilde ayarlamak için 1024 x 1024 x 1024 > Ön Ayarlar'a tıklayın. Bu da, mikroskop yazılımı tarafından belirlenen görüntü boyutuna bağlı olarak voksel boyutunun X ve Y değerlerini ayarlayacaktır.
    3. Edinme Parametreleri altında, Kanallar sekmesine tıklayın. Track2 kutusuna tıklayın. Yeşil (FITC) seçeneğini belirlemek için Track2 kutusunun yanındaki açılır menüyü kullanın. Track2'nin altında yeni bir sekme açılacaktır.
    4. Lazerler'in yanında, 488 kutusuna tıklayın. Bu, uyarma ve emisyon dalga boylarını ayarlayacaktır. Yüksek Yoğunluklu Lazer Aralığı kutusuna tıklayın.
    5. 488 nm kaydırıcının yanında, Lazer Gücü'nü %5'e ayarlayın. 1 Airy ünitesi için aperatürü ayarlamak üzere 1 AU düğmesine tıklayın. FITC altında Ana Kazancı 650 V, Dijital Ofseti 0 ve Dijital Kazancı 1 olarak ayarlayın.
    6. Edinme sekmesi altında, Z-Stack kutusunu işaretleyin. Ganglion'un canlı görüntüsünü görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın. Odak düzlemi düğmesini yalnızca küçük bir nöron arkı görünene kadar yukarı çevirin.
    7. Edinme Parametreleri altında, Son Ayarla düğmesini > Z-Stack sekmesine tıklayın. Odak düzlemi düğmesini yalnızca küçük bir nöron arkı görünene kadar aşağı çevirin. Edinme Parametreleri altında, Z-Stack sekmesine tıklayın > Önce Ayarla düğmesine basın. Canlı görüntüyü kapatmak için Canlı düğmesine tıklayın.
    8. Edinme Parametreleri altında, Z-Stack sekmesine tıklayın. Dilimler alanını 6 ile doldurun. Bu, 6 optik dilim ayarlayacak ve voksel derinliğini otomatik olarak belirleyecektir.
    9. Edinme sekmesi altında, Zaman Serisi kutusunun işaretli olmadığından emin olun (zaman serisi yok).
    10. Tarama hızını ve yönünü ayarlayın. Edinme Parametreleri altında, 1024 x 1024 > Çerçeve > Ön Ayarları > Edinme Modu sekmesine tıklayın. Çift yönlü tarama için Çerçeve > Yönü >> Çift Başlı Ok Edinme Modu sekmesini seçin. Frame > Scan Speed Slider > 6> Edinme Modu sekmesini seçin.
    11. Hücreler td-Domates ile etiketlenmişse, mikroskobu yeşil kanala ek olarak kırmızı kanal 592 nm uyarma / 614 nm emisyon, algılama dalga boyu 600-700 nm taramak üzere ayarlayın. Bunu Edinme Parametreleri'ne giderek ayarlayın ve Kanallar sekmesine > Track1 kutusuna tıklayın. Kırmızı (Teksas Kırmızısı) öğesini seçmek için Track1 kutusunun yanındaki açılır menüyü kullanın. Adım 2.6.3'teki ile aynı işlemi uygulayın, ancak 488 kutusu yerine 561 kutusuna tıklayın. Lazer Gücü'nü %1'e ayarlayın. Td-Domates, GCaMP3'ten çok daha parlaktır ve daha düşük lazer gücü gerektirir.
  7. Edinme sekmesinin altındaki Denemeyi Başlat düğmesine tıklayarak DRG'nin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü oluşturun.
  8. Mikroskop hızlı tarama protokolünü yükleyin (bkz. adım 2.4). DRG'de spontan aktiviteyi 80 döngü boyunca kaydedin (yaklaşık 10 dakika). Ortogonal bir projeksiyon filmi oluşturun ve görüntünün analiz için yeterli kalitede olduğunu doğrulayın.
    NOT: Kalite hususları, adım 2.5'teki ile aynıdır.
  9. Uyaranları uygulamak için, mikroskobu 15-20 tarama yapacak şekilde ayarlayın. Taban çizgisini oluşturmak için 1-5 arası taramaların tamamlanmasını bekleyin. 6-10 taramaları sırasında uyaranı uygulayın. Duyarsızlaşmayı önlemek için bir sonraki uyaranı uygulamadan önce her uyarandan sonra en az 5 dakika bekleyin.
    NOT: Önce mekanik uyaranlar, sonra soğuk, termal ve kimyasal uyaranlar uygulanmalıdır. Daha güçlü uyaranlardan önce daha zayıf uyaranlar (örneğin, düşük mekanik kuvvet, oda sıcaklığına yakın sıcaklıklar) uygulanmalıdır (örneğin, daha yüksek mekanik kuvvet, oda sıcaklığından daha uzak sıcaklıklar). Uyaranları uygularken, DRG'nin herhangi bir hareketine neden olmadığından emin olun. Özellikle güçlü termal uyaranlar için, uyarana başlamadan önce 1-2 dakika boyunca% 2 izofluran uygulamak genellikle gereklidir. Bu çalışmada kullanılan mikroskopta, her tarama net bir şekilde duyulabilir, böylece araştırmacı taramanın sonunu kolayca tanımlayabilir ve tarama 5'ten hemen sonra uyaran uygulamasına izin verebilir. Bununla birlikte, uyaranların tutarlı bir zaman noktasında uygulanmasını kolaylaştıran herhangi bir yöntem işe yarayacaktır.
  10. Mekanik bir pres için, algometrenin kıskaçını, pençeye dokunmadan pençe kürekler arasında olacak şekilde tutun ve tarama 5'in bitiminden hemen sonra başlayıp tarama 10'dan hemen sonra durarak sıkıştırın. Pres kuvvetini bir algometre ile izleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Pres kuvvetini istenen kuvvete mümkün olduğunca yakın tutun (burada 100 g'lık bir pres uyarıcısı kullanıyoruz) ve istenen kuvvetin üzerinde 10 g'ı geçmediğinden emin olun.
    NOT: 0,07 g von Frey filamentleri ve 600 g pres kuvveti kadar uyaranlar tespit edilebilir.
  11. Soğuk ve termal uyaranlar için, bir su kabını istenen sıcaklığın hemen altına (soğuk için) veya üstüne (termal için) soğutun veya ısıtın ve taramaya başlayın. Burada, 45 ° C'lik bir uyaran kullanın. Su doğru sıcaklıkta olduğunda, pençeyi suya batırarak 5 taramadan hemen sonra uyaranı uygulayın. 10 taramasından hemen sonra beheri çekin.
    NOT: Sıcaklık, tarama 5'te istenen sıcaklığın 1 °C içinde olmalıdır. Beher sıcaklığı yanlışsa, uyaranı uygulamayın, çünkü bu nöronları duyarsızlaştırabilir. Bunun yerine suyu yeniden soğutun veya ısıtın ve tekrar deneyin. 0 °C (buzlu su) kadar düşük ve 95 °C kadar yüksek sıcaklıkları ölçtük. Bununla birlikte, 50 ° C'nin üzerindeki sıcaklıkların dokulara zarar verebileceğini ve daha sonraki deneyleri karıştırabileceğini unutmayın. Benzer şekilde, bazı kimyasallar (örneğin tetrodotoksin, kapsaisin) geri dönüşümsüzdür veya yıkanamaz ve hayvan üzerinde daha fazla deney yapılmasını önleyebilir.
  12. Tüm uyaranlar uygulandıktan ve kaydedildikten sonra, ketamin / ksilazin (200 mg / kg ketamin, 30 mg / kg ksilazin veya adım 1.1'de hazırlanan çözeltinin gram vücut kütlesi başına 5 μL) ile aşırı dozda doz aşımı yaparak hayvanı ötenazi yapın ve ardından kafa kesme.

3. Veri analizi

  1. ImageJ'ye sürükleyip bırakarak görüntü dosyalarını açın. Dosyayı açtıktan sonra, Görüntü > RGB rengi > türü altında görüntü türünü seçin.
    NOT: Eklentiler > StackReg altındaki StackReg 21 eklentisi, hareket yapıtlarını düzeltmek ve hizalamak için kullanışlıdır. ImageJ çoğu mikroskop yazılım dosyası formatını okuyabilir. Görüntü türü seçimi kullanıcı tercihine bağlıdır. RGB, yayınlanmak üzere renkli görüntüler üretmeyi basitleştirir. Mikroskop üreticisinden veya cytoNet22'den yazılım paketleri de analize yardımcı olabilir. StackReg'i indirmek, yüklemek ve kullanmak gerekli değildir, ancak önerilir.
  2. Yatırım Getirisi Yöneticisi >> Analiz Aracı altında etkin nöronları seçmek için ilgi alanı (ROI) aracını kullanın. Araç çubuğundaki elips veya dikdörtgen araçlarını kullanarak YG'leri çizin ve YG yöneticisi penceresinde Ekle altındaki Ekle düğmesine basarak veya "t" tuşuna basarak YG dosyasına yerleştirin.
    NOT: ROI dosyasını sık sık kaydettiğinizden emin olun. Kullanıcılar, bir YG dosyasını ImageJ'ye sürükleyip bırakarak ve YG Yöneticisi penceresinin altındaki Tümünü Göster kutusunu tıklatarak YG'leri her zaman geri yükleyebilir. Bindirme olarak kaydetmeniz önerilmez. Deneyimlere göre, ROI .zip dosyası olarak kaydetmek, analizi basitleştirir.
  3. Ölçümleri Analiz Et > Ayarla altında, ortalama gri değer seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun; Ölçüleri Ayarla altındaki diğer tüm kutuların işaretini kaldırın. YG'ler içindeki yoğunluğu hesaplamak için YG yöneticisi menüsündeki çoklu ölçüm aracını kullanın. Daha fazla > Çoklu Ölçüm altındaki YG penceresini kullanarak yoğunluğu ölçün.
    NOT: Bazen bitişik nöronlar, ayrı yatırım getirileri çekmek için birbirine çok yakın olacaktır. Bu nöronlar geçici yoğunluğu ölçmek için kullanılamaz, ancak aktive edici nöronların sayısına dahil edilebilir.
  4. Multimeasure tarafından oluşturulan CSV dosyasını kaydedin ve CSV dosyasını herhangi bir elektronik tablo yazılımıyla açın.
    NOT: Analize yardımcı olacak örnek bir elektronik tablo şablonu için Ek Dosya 1'e bakın.
  5. Ca 2+ geçici yoğunluğunu ΔF / F 0 = (F t- F 0) / F 0 olarak hesaplayın, burada Ft, ilgilenilen zaman noktasında bir YG'deki piksel yoğunluğudur ve F 0, spontan aktivite için Ca 2+ geçicisinden önceki 2-4 karenin veya Ca 2+ için YG'nin ilk 1-5 karesinin yoğunluklarının ortalamasının alınmasıyla belirlenen temel yoğunluktur stimülasyon sırasında meydana gelen geçiciler. Uyarandan önce Ca2+ zirveleri üreten nöronları hariç tutun ve uyaran sona erdikten sonra aktiviteyi analiz etmeyin.
  6. Ca2 + geçici yoğunluk analizi için, verilerin en fazla sayıda yanıt veren nöron üreten ganglionlara doğru çarpıtılmasını önlemek için her gangliondan yaklaşık eşit sayıda nöronu rastgele örnekleyin. ΔF / F 0 < 0,15 olduğu zirveleri hariç tutun.
    NOT: 11,12,23,24,25,26,27,28 nöronlarının analizi ve dahil edilmesi / dışlanması için yayınlanmış alternatif yöntemler vardır.
  7. ImageJ'deki araç çubuğundaki çizgi aracını kullanarak nöron çaplarını ölçün. En uzun ve en kısa çaplar boyunca çizilen çizgilerden ortalama çapı hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

figure-results-68
Şekil 4: Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının temsili görüntüleri. (A,D) Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının tek kareli yüksek çözünürlüklü taramaları gösterilmiştir. (B,E) . Uyaranların yokluğunda, sırasıyla panel A ve panel D'den 15 kare P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kalıcı ağrı, çok çeşitli bozukluklarda mevcuttur, insanların yaklaşık% 8'i için yaşam kalitesini zayıflatır ve / veya azaltır29. Birincil duyusal nöronlar ciltteki zararlı uyaranları tespit eder ve plastisiteleri kalıcı ağrıya katkıda bulunur8. Nöronlar hücre kültüründe ve eksplantlarda incelenebilirken, bunu yapmak onları normal fizyolojik bağlamlarından uzaklaştırır. DRG'nin cerrahi maruziyeti, ardından Pirt-GCaMP3 Ca2 + gör?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleri R01DE026677 ve R01DE031477 (Y.S.K.'ye), UTHSCSA başlangıç fonu (YSK) ve Teksas Üniversitesi sisteminden (YSK) Yükselen STAR Ödülü ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anased Injection (Xylazine)Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DICCal Zeiss422642-9900-000
Cotton Tipped ApplicatorsMcKesson24-106-1S
Curved HemostatFine Science Tools13007-12
DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
DC Temperature Controller Heating PadFHC40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated ForcepsFine Science Tools11252-50
FHC DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
Ketaset (Ketamine)ZoetisKET-00002R2
Luminescent Green Stage TapeJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane VaporizerMidmark91305430
Micro dissecting scissorsRobozRS-5882
Micro dissecting spring scissorsFine Science Tools15023-10
Micro dissecting spring scissorsRobozRS-5677
Mini Rectal Thermistor ProbeFHC40-90-5D-02
Operating scissorsRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J miceJohns Hopkins UniversityN/AEither sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometerBioseb In vivo Research InstrumentsBIO-SMALGO
Stereotaxic frameKopf Model 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J miceJackson Laboratory7909
Top Plate, 6 in x 10 inNewport290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J miceJackson Laboratory17769
Zeiss LSM 800 confocal microscopeCal ZeissLSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6

Referanslar

  1. Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
  2. Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
  3. Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
  4. Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
  5. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
  6. Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).
  10. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).
  11. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  12. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).
  13. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  14. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  15. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  16. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  17. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  18. Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
  19. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  21. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  22. Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).
  23. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  24. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  25. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450(2016).
  26. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171(2015).
  27. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  28. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  29. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
  30. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  31. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  32. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  33. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).
  34. Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
  35. Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
  36. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
  37. Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  38. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  39. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  40. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  41. Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır