İnmenin Geçici Orta Serebral Arter Oklüzyon Modeli

Özet

Bu protokol, orta serebral arterin intraluminal oklüzyonu yoluyla farelerde geçici fokal serebral iskemi modelini açıklar. Ek olarak, manyetik rezonans görüntüleme ve davranış testleri kullanılarak sonuç değerlendirme örnekleri gösterilmiştir.

Özet

İnme, küresel olarak önemli bir ölüm veya kronik sakatlık nedeni olarak durmaktadır. Bununla birlikte, mevcut optimal tedaviler iskemik inmenin akut fazında reperfüzyon tedavileri ile sınırlıdır. İnme fizyopatolojisi hakkında bilgi edinmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımlar geliştirmek için, in vivo kemirgen inme modelleri temel bir rol oynamaktadır. Genetiği değiştirilmiş hayvanların mevcudiyeti, farelerin deneysel inme modelleri olarak kullanılmasını özellikle teşvik etmiştir.

İnme hastalarında orta serebral arter (MCA) tıkanması sık görülen bir durumdur. Sonuç olarak, en yaygın deneysel model, kraniektomi gerektirmeyen minimal invaziv bir teknik olan MCA'nın intraluminal oklüzyonunu içerir. Bu prosedür, dış karotis arterden (ECA) bir monofilament yerleştirmeyi ve MCA'nın dallanma noktasına ulaşana kadar iç karotis arter (ICA) boyunca ilerletmeyi içerir. 45 dakikalık bir arteriyel tıkanıklıktan sonra, reperfüzyona izin vermek için monofilament çıkarılır. İşlem boyunca, oklüzyon sırasında azalmayı ve ardından reperfüzyon üzerine iyileşmeyi doğrulamak için serebral kan akışı izlenir. Nörolojik ve doku sonuçları, davranışsal testler ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) çalışmaları kullanılarak değerlendirilir.

Giriş

Dünya Sağlık Örgütü'ne göre inme, dünya çapında yılda yaklaşık 15 milyon insanı etkileyen yıkıcı bir hastalıktır. Hastaların yaklaşık üçte biri bu duruma yenik düşerken, üçte biri kalıcı sakatlık yaşar. İnme, nöral ve periferik immün hücreler, damar sistemi ve sistemik yanıtlar gibi çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık bir patolojidir¹. Sistem düzeyinde inme ile tetiklenen karmaşık reaksiyon ağı, şu anda in vitro modeller kullanılarak çoğaltılamamaktadır. Bu nedenle, deneysel hayvan modelleri, hastalığın mekanizmalarını araştırmak ve yeni tedaviler geliştirmek ve test etmek için gereklidir. Şu anda, erken doku reperfüzyonu, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ile tromboliz veya endovasküler trombektomi¹ yoluyla onaylanmış tek müdahaledir.

İnme hastalarında orta serebral arter (MCA) tıkanıklıkları sık görülür. Sonuç olarak, geçici MCA oklüzyonunun (tMCAo) kemirgen modelleri başlangıçta sıçanlarda^{geliştirilmiştir 2,3,4}. Günümüzde, genetiği değiştirilmiş fareler, deneysel inme modellerinde en yaygın kullanılan hayvanlardır. Bu çalışmada, farelerde minimal invaziv bir intraluminal tMCAo modeli tanımlanmıştır. Yaklaşım, kraniektomi yapılmadan boyun seviyesindeki karotis arter yoluyla gerçekleştirilir.

Oklüzyon süresinin süresi, iskemik lezyonun yaygınlığını belirleyen kritik bir faktördür. 10 dakikalık kısa tıkanıklıklar bile belirgin bir enfarktüs olmadan seçici nöronal ölüme neden olabilirken, tipik olarak 30 ila 60 dakika süren daha uzun tıkanıklıklar bir dereceye kadar serebral enfarktüse neden olur. MCA'nın korteksi besleyen ve kollateralleri olan proksimal ve distal dallarının aksine, striatuma kan sağlayan lentikülo-striatal arterlerde teminat yoktur⁵. Sonuç olarak, striatumdaki kan akışında tMCAo'dan sonra kortekse göre daha fazla azalma olur. Bu nedenle, 30 dakika veya daha kısa oklüzyonlar genellikle striatumu etkiler, ancak korteksi etkilemezken, 45 dakikadan itibaren daha uzun oklüzyonlar genellikle striatum ve dorsolateral korteks dahil olmak üzere tüm MCA bölgesinde iskemik bir lezyon oluşturur.

Farelerin refahını sağlamak için işlemden önce analjezik uyguluyoruz ve ameliyat sırasında anestezi kullanıyoruz. Bununla birlikte, anestezi potansiyel olarak farenin fizyolojisinde yapay değişiklikler getirebilir ve bazı sonuç ölçütlerini etkileyebilir⁶. Cerrahi müdahale, deneyimli personel tarafından yapıldığında, MCAo'yu indüklemek için genellikle yaklaşık 15 dakika sürer. Daha sonra, anestezi altındaki toplam süre oklüzyon süresine bağlıdır. Anestezinin en aza indirilmesinin çok önemli olduğu deneyler için, prosedürdeki alternatif bir adım, oklüzyon döneminde anestezinin kesilmesini ve sadece MCA'yı tıkayan filamentin yerleştirilmesi ve geri çekilmesi için cerrahi adımlarla sınırlandırılmasını içerir. Bu yaklaşım anestezi süresini azaltır ve deneysel model ^7,8 üzerindeki potansiyel artefaktsal etkilerini en aza indirir. Bu nedenle, geçici fokal iskemiyi indükleme yöntemi, MCA'nın intraluminal oklüzyonu ile iki varyantla sunulur: tüm oklüzyon süresi boyunca fare uyuşturularak veya bu süre boyunca fare uyanıkken. Her iki durumda da, iskemik fareler üzerinde gerçekleştirilen müdahaleye paralel olarak sahte bir ameliyat yapılmalıdır. Ek olarak, sonuç değerlendirmesine ilişkin veriler, reperfüzyondan sonra çeşitli zaman noktalarında davranış testleri ve MRG ile ölçüldüğü şekilde sağlanır. Son olarak, deneysel prosedürü uygularken göz önünde bulundurulması gereken ana faktörler tartışılmaktadır.

Protokol

Hayvan çalışmaları, Katalan ve İspanyol yasalarına (Real Decreto 53/2013) ve Avrupa Direktiflerine uygun olarak, Barselona Üniversitesi etik komitesinin (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) ve Generalitat de Catalunya'nın yerel düzenleyici kurumlarının onayı ile yürütülmüştür. Çalışmalar ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak raporlanmaktadır. Bu prosedür, yaş sınırı olmaksızın 8 haftalıktan başlayarak yetişkin farelerde gerçekleştirilmek üzere tasarlanmıştır. 10-12 haftalık C57BL/6 farelerde geliştirilen cerrahi prosedür örnekleri burada verilmiştir. Fare suşuna bağlı anatomik farklılıklar göz önünde bulundurulmalıdır.

1. Hayvan hazırlama

1. Cerrahi işleme başlamadan önce, gerekli tüm malzemeleri ve aletleri toplayın ve sterilize edin. Ameliyat masasını gerekli tüm cerrahi malzemelerle kurun ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir).
2. Oksijen ve nitröz oksit (% 30 /% 70) karışımı içinde izofluran inhalasyonu kullanarak hayvanı uyuşturun.
3. Analjezi sağlamak ve herhangi bir ağrı ve rahatsızlığı hafifletmek için buprenorfini (bkz. Malzeme Tablosu) 0.05 mg / kg vücut ağırlığı dozunda deri altından uygulayın.
   NOT: Analjezi zorunludur, ancak farklı protokoller kabul edilir. MCAo'dan sonraki ilk günlerde ağrı ve rahatsızlık belirtileri de kontrol edilmelidir (bkz. adım 4). Gerektiğinde düzeltici çözümler uygular.
4. Hayvanı, derin anestezi durumuna ulaşana kadar (pençe ponksiyonunda refleks kaybı ve oküler refleks) %5 izofluran içeren bir anestezi indüksiyon kutusuna (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
5. Fareyi ameliyat masasına yerleştirin ve yüz maskesi ile verilen izofluran seviyesini% 1,5'e düşürün. İşlem sırasında göz kuruluğunu önlemek için veteriner merhemi sürün.
6. Vücut ısısını bir ısıtma yastığına bağlı bir rektal prob tarafından kontrol edilen 37 ± 0.5 °C'de tutun (Malzeme Tablosuna bakınız).
7. Boynun ventral kısmını ve başını (calvaria) elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin. Kürk kalıntılarını dikkatlice temizleyin ve cilt bölgelerini iyot bazlı dezenfektan ve% 70 alkol ile dairesel hareketlerle üç kez dezenfekte edin.
   .

2. Lazer Doppler flowmetri (LDF) ile serebral kan akımı (CBF) değerlendirmesi

1. Makasla, başın derisinde, sagital sütür yönünde, kulaklardan gözler arasındaki alana kadar bir kesi yapın.
2. Cildi geri çekin ve kafatasının sağ tarafındaki periosteuumu çıkarın.
3. Koordinatları bulun (Bregma'dan 2,5 mm yanal) ve siyanoakrilat kullanarak Doppler tutucuyu (Malzeme Tablosuna bakınız) takın. Yapıştırıcı kuruduktan sonra Doppler probunu bağlayın ve doğru sinyal okumasını kontrol edin.

3. Geçici orta serebral arter tıkanıklığı (tMCAo)

1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve tıbbi bantla ameliyat masasına sabitleyin.
2. Boyunda orta hat kesisi yapın. Karotis bölgesini ortaya çıkarmak için ekartörler kullanarak cildi ve tükürük bezlerini yanal olarak geri çekin (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Ortak karotis arter (CCA), ICA ve ECA'nın vasküler anatomisini ve bunlardan türetilen farklı arterleri (maksiller ve lingual, superior tiroid, oksipital ve pterygopalatin) tanımlayın (Şekil 1A).
4. Ana arterleri, ele alınabilmeleri için bitişik bağ dokusundan ayırın.
   NOT: Sinirlere, özellikle CCA'ya paralel uzanan vagus sinirine zarar vermemeye özellikle dikkat edin.
5. Maksiller/lingual çatallanmada ECA'nın etrafına 6-0 ipek sütür (Malzeme Tablosuna bakınız) sarın. Dolaşımı kalıcı olarak kesmek için bir düğümü sıkıca sabitleyin.
6. Aynı arterin etrafında, ilk düğüm ile CCA çatallanması arasında ikinci bir dikiş atın ve bu düğümü gevşek tutun.
7. CCA'nın etrafına üçüncü bir iplik yerleştirin ve kolayca çözülebilen bir kayma düğümü bağlayın.
   NOT: Bu, vasküler bir klipsle de gerçekleştirilebilir, ancak iplik daha fazla hareket ve esneklik sağlar. Bu aşamada, LDF sinyalinde CBF'de ilk azalmayı gözlemlemek mümkündür.
8. ICA'dan kan dolaşımını kesen bir vasküler klips yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
9. ECA'da, sıkı düğümün bulunduğu bölgeye yakın küçük bir kesi yapın.
10. Monofilamenti, kalın kaplama arteriyel lümene tamamen girene kadar yerleştirin.
11. Monofilamenti arterin içinde tutmak için ikinci düğümü sıkın ve kanın uyguladığı basıncın onu dışarı itmesini önleyin (Şekil 1B).
12. Vasküler klipsi ICA'dan çıkarın.
13. ECA'yı ilk düğümün altından kesin ve kütüğü ICA yönünde yönlendirmek için döndürün (Şekil 1C).
14. Monofilamenti, MCA'nın dallandığı noktaya kadar ICA aracılığıyla ilerletin.
    NOT: Oklüzyon, LDF okumasında ani bir kan akışı düşüşüne yansır. CBF'deki düşüş bazal değerden% 70'ten fazla olduğunda başarılı bir oklüzyon olarak kabul edilir. CBF ölçüm sistemleri mevcut değilse, tıkanma noktası, yetişkin farelerde genellikle CCA'nın çatallanmasından yaklaşık 11 mm olan ilerlemeye karşı direnç ile not edilebilir.
    1. Oklüzyon döneminde anesteziye devam edilirse fareyi monitörize edin ve 45 dakika boyunca sürekli gözlem altında tutun.
    2. Oklüzyon döneminde farenin uyanması durumunda, boyun derisini birkaç dikişle dikin. LDF probunun bağlantısını kesmeden, fareyi sıcaklık kontrollü kutuya yerleştirin ve anesteziden kurtulmayı sağlayın.
       NOT: Farenin bu dönemde başarılı oklüzyonun göstergesi olarak spontan daire çizme davranışı sergilemesi yaygındır.
    3. 40 dakika sonra, 1.4, 1.5 ve 1.7 maddelerinde belirtilen anestezi ve dezenfeksiyon prosedürlerini izleyerek fareyi tekrar uyuşturun. Ameliyat masasına geri yerleştirin ve dikişleri boyundan alın.
15. 45 dakikalık oklüzyondan sonra, monofilamenti yerinde tutan düğümü gevşetin. Filamenti yavaşça ve nazikçe çekin ve doku rekanalizasyonunun gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol edin.
16. Filamenti dışarı çekin ve kan kaybını önlemek için düğümü sıkın.
17. CCA düğümünü çözün. Arteriyel duvar hasarı olmadığından emin olun.
18. Ekartörleri çıkarın ve kasları, bezleri ve cildi yeniden konumlandırın. Cildi dikin (6-0) ve dezenfektan uygulayın.
19. Doppler probunu ayırın ve tutucuyu ayırın. Başın cildini dikin ve dezenfekte edin.
20. Anesteziden iyileşme döneminde, fareyi sıcaklığı korumak için ısıtıcı bulunan bir kafeste bırakın. Anesteziden tamamen iyileşene kadar sürekli gözlem altında tutun. İyileştikten sonra, fare kafesine geri dönebilir.
    NOT: Sosyal zenginleştirme ile konut şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, saldırganlığı önlemek için ameliyatlı fareleri ameliyatlı farelerle aynı kafeste herhangi bir fiziksel ayrım olmadan asla karıştırmayın.

4. Ameliyat sonrası bakım

1. Yerel yönetmeliklere göre belirlenen prosedür ve yönetmeliklere uyarak hayvanları periyodik olarak denetleyin. Ameliyattan sonra ağrıyı en aza indirmek için uygun programda analjezik tedavi sağlayın.
   NOT: Bu çalışmada, girişimin başlangıcında olduğu gibi aynı analjezik (Buprenorfin 0.05 mg / kg vücut ağırlığı) ameliyattan 6 saat ve 24 saat sonra uygulandı.
2. Denetim parametreleri bunu gösterdiğinde, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek ötenazi gerçekleştirin.
3. Günlük olarak hayvanların ağırlığını izleyin. Ameliyattan sonraki ilk birkaç gün boyunca hayvanlara yumuşak yiyecekler verin. Ek olarak, ameliyattan hemen sonra deri altı salin (200 μL) enjeksiyonu ile ve farenin kendi kendine hidratasyon yapmadığı gözlemlenirse periyodik olarak nemlendirin. Yiyecek ve suyu hayvanın kolayca erişebileceği şekilde düzenleyin.
4. İn vivo çalışma tamamlandıktan sonra, fareleri uyuşturun, ötenazi yapın ve daha fazla histopatolojik analiz için (gerekirse) beyin dokusunu çıkarın.

Sonuçlar

tMCAo prosedürünün sonucunu değerlendirmek için farklı yaklaşımlar vardır. Burada in vivo nörogörüntüleme yöntemleri (MRI) ve davranışsal testler kullanılmaktadır.

Fareler beyinde iskemik lezyonlar geliştirir ve esas olarak striatum ve dorsolateral korteks gibi MCA ipsilateral tarafından oklüzyona sağlanan bölgeyi etkiler. Lezyonun yaygınlığını belirlemek için 2,3,5-trifeniltetrazolyum klorür (TTC) doku boyama, histolojik boyama (hematoksilen/eozin, tioni...

Tartışmalar

İntraluminal tMCAo prosedürü, temel araştırmalarda reperfüzyonlu fokal beyin iskemisinin en sık kullanılan modelidir. Şu anda, genetiği değiştirilmiş suşların mevcudiyeti nedeniyle fareler tercih edilen hayvan modelidir. Bununla birlikte, genetiği değiştirilmiş farelerin ve genetik geçmişlerinin beyin vaskülarizasyonunu etkileyebileceğini kabul etmek önemlidir. Farklı arter bölgeleri arasında kollateral dolaşım ve anastomozların varlığı, deneysel prosedürlerin sonuçlarını önemli öl?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 suture	Arago		Vascular ligatures
6/0 suture with curved needle	Arago		Skin sutures
9 mg/mL Saline	Fresenius Kabi	CN616003 EC	For hydration
Anaesthesia system	SurgiVet
Blunt retractors, 1 mm wide	Fine Science Tools	18200-09
Buprenorfine	Buprex		For pain relief
Clamp applying forceps	Fine Science Tools	S&T CAF4
Dumont mini forceps	Fine Science Tools	M3S 11200-10
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Glue	Loctite		To stick LDF probe to the skull
Grip Strength Meter	IITC Life Science Inc.	#2200
Isoflurane	B-Braun	CN571105.8
LDF Perimed	Perimed	Periflux System 5000
LDF Probe Holders	Perimed	PH 07-4
Medical tape
MRI magnet	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany		BioSpec 70/30 horizontal animal scanner
Needle Holder with Suture Cutter	Fine Science Tools	12002-14
Nylon filament	Doccol	701912PK5Re
Recovery cage with heating pad
Sirgical scissors	Fine Science Tools	91401-12
Small vessel cauterizer kit	Fine Science Tools	18000-00
Stereomicroscope and cold light	Leica	M60
Suture tying forceps	Fine Science Tools	18025-10
Thermostat, rectal probe and mouse pad	Letica Science Instruments	LE 13206
Vannas spring scissors (4mm cutting edge)	Fine Science Tools	15019-10
Vascular clamps	Fine Science Tools	00396-01