Модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии при инсульте

Резюме

Данный протокол описывает модель транзиторной фокальной ишемии головного мозга у мышей через внутрипросветную окклюзию средней мозговой артерии. Кроме того, показаны примеры оценки результатов с использованием магнитно-резонансной томографии и поведенческих тестов.

Аннотация

Инсульт является одной из основных причин смерти или хронической инвалидности во всем мире. Тем не менее, существующие оптимальные методы лечения ограничиваются реперфузионной терапией во время острой фазы ишемического инсульта. Для получения информации о физиопатологии инсульта и разработки инновационных терапевтических подходов фундаментальную роль играют модели инсульта у грызунов in vivo . Доступность генетически модифицированных животных особенно стимулировала использование мышей в качестве экспериментальных моделей инсульта.

У пациентов, перенесших инсульт, окклюзия средней мозговой артерии (МЦА) является распространенным явлением. Следовательно, наиболее распространенная экспериментальная модель включает внутрипросветную окклюзию MCA, минимально инвазивный метод, который не требует краниэктомии. Эта процедура включает в себя введение мононити через внешнюю сонную артерию (ЭКА) и продвижение ее через внутреннюю сонную артерию (ВСА) до тех пор, пока она не достигнет точки разветвления МКА. После 45-минутной артериальной окклюзии монофиламент удаляют для проведения реперфузии. На протяжении всего процесса контролируется мозговой кровоток для подтверждения уменьшения во время окклюзии и последующего восстановления после реперфузии. Неврологические и тканевые исходы оцениваются с помощью поведенческих тестов и магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Введение

По данным ВОЗ, инсульт является разрушительным заболеванием, от которого ежегодно страдают около 15 миллионов человек во всем мире. Около трети пациентов умирают от этого заболевания, в то время как другая треть испытывает постоянную инвалидность. Инсульт — это сложная патология, в которой участвуют различные типы клеток, такие как нейронные и периферические иммунные клетки, сосудистая сеть и системные реакции¹. Сложная сеть реакций, вызванных инсультом на системном уровне, в настоящее время не может быть воспроизведена с помощью моделей in vitro . Таким образом, экспериментальные модели на животных необходимы для изучения механизмов заболевания, а также для разработки и тестирования новых методов лечения. В настоящее время ранняя тканевая реперфузия является единственным одобренным вмешательством, либо путем тромболизиса тканевым активатором плазминогена (tPA), либо путем эндоваскулярной тромбэктомии¹.

Окклюзии средней мозговой артерии (МЦА) часто встречаются у пациентов, перенесших инсульт. В связи с этим на крысах ^2,3,4 были первоначально разработаны модели транзиторной окклюзии MCA (tMCAo) на грызунах. В настоящее время генетически модифицированные мыши являются наиболее часто используемыми животными в экспериментальных моделях инсульта. В данном исследовании мы описываем минимально инвазивную модель внутрипросветного tMCAo у мышей. Доступ осуществляется через сонную артерию на уровне шеи, без краниэктомии.

Продолжительность окклюзионного периода является критическим фактором, определяющим степень ишемического поражения. Даже короткие окклюзии продолжительностью 10 минут могут вызвать селективную гибель нейронов без явного инфаркта, в то время как более длительные окклюзии, обычно длящиеся от 30 до 60 минут, приводят к некоторой степени инфаркта мозга. В отличие от проксимальной и дистальной ветвей MCA, которые снабжают кору головного мозга и имеют коллатерали, лентикуло-стриарные артерии, снабжающие кровью полосатое тело, не имеют коллатералей^. Как следствие, после tMCAo происходит большее снижение кровотока в стриатуме, чем в коре. Таким образом, окклюзии продолжительностью 30 минут или менее обычно влияют на стриатум, но не на кору, в то время как более длительные окклюзии, начиная с 45 минут, часто приводят к ишемическому поражению всей территории MCA, включая стриатум и дорсолатеральную кору.

Чтобы обеспечить хорошее самочувствие мышей, перед процедурой мы вводим анальгетики и используем анестезию во время операции. Тем не менее, анестезия потенциально может внести искусственные изменения в физиологию мыши и повлиять на некоторые критерии исхода⁶. Хирургическое вмешательство, выполняемое опытным персоналом, обычно длится около 15 минут для индуцирования MCAo. В дальнейшем общее время под наркозом зависит от периода окклюзии. Для экспериментов, где минимизация анестезии имеет решающее значение, альтернативным этапом процедуры является прекращение анестезии в период окклюзии и ограничение ее только хирургическими этапами введения и извлечения нити, окклюзирующей MCA. Такой подход сокращает продолжительность анестезии и минимизирует ее потенциальное артефактное воздействие на экспериментальную модель ^7,8. Таким образом, метод индуцирования транзиторной очаговой ишемии представлен внутрипросветной окклюзией МКА с двумя вариантами: с обезболиванием мыши в течение всего периода окклюзии или с бодрствованием мыши в этот период. В любом случае, параллельно с вмешательством, проводимым на ишемизированных мышах, должна быть проведена фиктивная операция. Кроме того, предоставляются данные об оценке исходов, измеренные с помощью поведенческих тестов и МРТ в различные моменты времени после реперфузии. Наконец, обсуждаются основные факторы, которые следует учитывать при реализации экспериментальной процедуры.

протокол

Работа с животными проводилась в соответствии с законами Каталонии и Испании (Real Decreto 53/2013) и Европейскими директивами, с одобрения этического комитета (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) Университета Барселоны и местных регулирующих органов Женералитата Каталонии. Результаты исследований публикуются в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Эта процедура предназначена для проведения у взрослых мышей, начиная с 8-недельного возраста, без возрастных ограничений. Примеры хирургического вмешательства, разработанного на мышах C57BL/6 в возрасте 10-12 недель, приведены здесь. Следует учитывать анатомические различия в зависимости от штамма мышей.

1. Подготовка животных

1. Перед началом хирургической процедуры соберите и простерилизуйте все необходимые материалы и инструменты. Установите операционный стол со всеми необходимыми хирургическими материалами (перечислены в Таблице материалов).
2. Обезболивайте животное с помощью ингаляций изофлурана в смеси кислорода и закиси азота (30%/70%).
3. Вводят бупренорфин (см. Таблицу материалов) подкожно в дозировке 0,05 мг/кг массы тела для обезболивания и облегчения боли и дискомфорта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивание является обязательным, но принимаются другие протоколы. Симптомы боли и дискомфорта также необходимо контролировать в течение первых дней после MCAo (см. шаг 4). При необходимости применяйте корректирующие решения.
4. Поместите животное в индукционный бокс для анестезии (см. таблицу материалов) с 5% изофлураном до тех пор, пока оно не достигнет состояния глубокой анестезии (потеря рефлекса при пункции лапы и глазного рефлекса).
5. Поместите мышь на операционный стол и уменьшите уровень изофлурана до 1,5%, доставляемого маской для лица. Нанесите ветеринарную мазь, чтобы избежать сухости глаз во время процедуры.
6. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 ± 0,5 °C, контролируемую ректальным зондом, подключенным к грелке (см. Таблицу материалов).
7. Брюшную часть шеи и голову (кальварию) побрить электробритвой. Тщательно удалите остатки шерсти и продезинфицируйте участки кожи три раза круговыми движениями дезинфицирующим средством на основе йода и 70% спиртом.
   .

2. Оценка мозгового кровотока (ОЦК) с помощью лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ)

1. Ножницами сделайте надрез на коже головы, по направлению сагиттального шва, от ушей до области между глазами.
2. Втяните кожу и удалите надкостницу с правой стороны черепа.
3. Найдите координаты (2,5 мм латеральнее Брегмы) и прикрепите доплеровский держатель (см. Таблицу материалов) с помощью цианоакрилата. После того, как клей высохнет, подключите доплеровский зонд и проверьте правильность считывания сигнала.

3. Транзиторная окклюзия средней мозговой артерии (tMCAo)

1. Переверните мышь в положение лежа на спине и зафиксируйте ее на операционном столе медицинским скотчем.
2. Сделайте разрез по средней линии на шее. Оттяните латерально кожу и слюнные железы с помощью ретракторов (см. Таблицу материалов), чтобы обнажить сонную артерию.
3. Определите сосудистую анатомию общей сонной артерии (CCA), ICA и ECA, а также различных артерий, происходящих от них (верхнечелюстной и язычной, верхней щитовидной, затылочной и крыловидно-небной) (рис. 1A).
4. Отделите основные артерии от соседней соединительной ткани, чтобы с ними можно было работать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны, чтобы не повредить нервы, особенно блуждающий нерв, который проходит параллельно CCA.
5. Оберните шелковый шов 6-0 (см. Таблицу материалов) вокруг ЭХА в области верхнечелюстной/лингвальной бифуркации. Плотно закрепите узел, чтобы навсегда прервать кровообращение.
6. Пропустите второй шов вокруг той же артерии, между первым узлом и бифуркацией CCA, и держите этот узел свободным.
7. Наденьте третью нить на CCA и завяжите скользящий узел, который можно легко развязать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно выполнять с помощью сосудистого зажима, но нить обеспечивает большую подвижность и гибкость. На этом этапе можно наблюдать первое снижение КБФ в сигнале ЛДФ.
8. Установите сосудистый зажим (см. Таблицу материалов), прерывающий кровообращение из ВСА.
9. Сделайте небольшой надрез в ЭХА, близко к месту, где находится тугой узел.
10. Вводите мононить до тех пор, пока толстая оболочка полностью не войдет в просвет артерии.
11. Затяните второй узел, чтобы удержать мононить внутри артерии и не допустить, чтобы давление, оказываемое кровью, выталкивало ее наружу (рис. 1B).
12. Извлеките сосудистый зажим из ВСА.
13. Разрежьте ЭХА ниже первого узла и поверните пень, чтобы сориентировать его в направлении ВКА (Рисунок 1C).
14. Продвигайте мононить через ICA до точки, где MCA разветвляется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окклюзия отражается в резком падении кровотока в показаниях ЛДФ. Мы считаем успешной окклюзию, когда падение КБВ превышает 70% от базального значения. Если системы измерения КБВ недоступны, точка окклюзии может быть отмечена по сопротивлению продвижению, которое у взрослых мышей обычно составляет около 11 мм от бифуркации КЦА.
    1. Если анестезия продолжается в период окклюзии, наблюдайте за мышью и держите ее под постоянным наблюдением в течение 45 минут.
    2. В случае, если мышь проснулась в период окклюзии, зашить кожу шеи несколькими швами. Не отсоединяя датчик LDF, поместите мышь в коробку с регулируемой температурой, чтобы можно было восстановиться после анестезии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В этот период мышь обычно проявляет спонтанное круговое поведение, что свидетельствует об успешной окклюзии.
    3. Через 40 мин снова обезболить мышь, выполнив те же процедуры анестезии и дезинфекции, которые указаны в пунктах 1.4, 1.5 и 1.7. Положите его обратно на операционный стол и снимите швы с шеи.
15. Через 45 минут окклюзии ослабьте узел, удерживающий мононить на месте. Медленно и осторожно потяните за нить и убедитесь, что происходит реканализация тканей.
16. Вытащите нить и затяните узел, чтобы предотвратить кровопотерю.
17. Развяжите узел CCA. Убедитесь в отсутствии повреждений артериальной стенки.
18. Снимите ретракторы и переместите мышцы, железы и кожу. Зашить кожу (6-0) и нанести дезинфицирующее средство.
19. Отсоедините доплеровский зонд и отсоедините держатель. Зашить и продезинфицировать кожу головы.
20. В период восстановления после наркоза оставьте мышь в клетке, снабженной обогревателем для поддержания температуры. Держите его под постоянным наблюдением до тех пор, пока он полностью не оправится от наркоза. После выздоровления мышь можно вернуть в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется жилье с социальным обогащением. Тем не менее, никогда не смешивайте оперированных мышей с неоперированными мышами в одной клетке без какого-либо физического разделения, чтобы предотвратить агрессию.

4. Послеоперационный уход

1. Периодически наблюдайте за животными в соответствии с процедурами и правилами, установленными в соответствии с местными правилами. Обеспечьте обезболивающее лечение по соответствующему графику, чтобы свести к минимуму боль после операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании применяли тот же анальгетик, что и в начале вмешательства (бупренорфин 0,05 мг/кг массы тела) через 6 ч и 24 ч после операции.
2. Проводите эвтаназию, когда это указано параметрами супервизии, в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами.
3. Ежедневно контролируйте вес животных. Обеспечьте животных мягким кормом в течение первых нескольких дней после операции. Кроме того, увлажняйте их путем подкожной инъекции физиологического раствора (200 мкл) сразу после операции и периодически после этого, если замечено, что мышь не гидратируется самостоятельно. Разложите корм и воду таким образом, чтобы животное было легко доступно.
4. После завершения исследования in vivo мышей обезболивают, усыпляют их и удаляют ткань мозга для дальнейшего гистопатологического анализа (при необходимости).

Результаты

Существуют различные подходы к оценке результатов процедуры tMCAo. Здесь используются методы нейровизуализации in vivo (МРТ) и поведенческое тестирование.

У мышей развиваются ишемические поражения в головном мозге, в основном затрагивающие территорию, поставляемую MCA и?...

Обсуждение

Внутрипросветная процедура tMCAo является наиболее часто используемой моделью фокальной ишемии головного мозга с реперфузией в фундаментальных исследованиях. В настоящее время мыши являются предпочтительной животной моделью из-за наличия генетически модифицированных штаммов. Тем не ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 suture	Arago		Vascular ligatures
6/0 suture with curved needle	Arago		Skin sutures
9 mg/mL Saline	Fresenius Kabi	CN616003 EC	For hydration
Anaesthesia system	SurgiVet
Blunt retractors, 1 mm wide	Fine Science Tools	18200-09
Buprenorfine	Buprex		For pain relief
Clamp applying forceps	Fine Science Tools	S&T CAF4
Dumont mini forceps	Fine Science Tools	M3S 11200-10
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Glue	Loctite		To stick LDF probe to the skull
Grip Strength Meter	IITC Life Science Inc.	#2200
Isoflurane	B-Braun	CN571105.8
LDF Perimed	Perimed	Periflux System 5000
LDF Probe Holders	Perimed	PH 07-4
Medical tape
MRI magnet	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany		BioSpec 70/30 horizontal animal scanner
Needle Holder with Suture Cutter	Fine Science Tools	12002-14
Nylon filament	Doccol	701912PK5Re
Recovery cage with heating pad
Sirgical scissors	Fine Science Tools	91401-12
Small vessel cauterizer kit	Fine Science Tools	18000-00
Stereomicroscope and cold light	Leica	M60
Suture tying forceps	Fine Science Tools	18025-10
Thermostat, rectal probe and mouse pad	Letica Science Instruments	LE 13206
Vannas spring scissors (4mm cutting edge)	Fine Science Tools	15019-10
Vascular clamps	Fine Science Tools	00396-01