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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit le modèle d’ischémie cérébrale focale transitoire chez la souris par occlusion intraluminale de l’artère cérébrale moyenne. De plus, des exemples d’évaluation des résultats sont présentés à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique et de tests comportementaux.

Résumé

L’AVC est l’une des principales causes de décès ou d’invalidité chronique dans le monde. Néanmoins, les traitements optimaux existants se limitent aux thérapies de reperfusion pendant la phase aiguë de l’AVC ischémique. Pour mieux comprendre la physiopathologie de l’AVC et développer des approches thérapeutiques innovantes, les modèles in vivo d’AVC chez les rongeurs jouent un rôle fondamental. La disponibilité d’animaux génétiquement modifiés a particulièrement favorisé l’utilisation de souris comme modèles expérimentaux d’AVC.

Chez les patients victimes d’un AVC, l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) est un phénomène fréquent. Par conséquent, le modèle expérimental le plus répandu implique l’occlusion intraluminale de l’ACM, une technique peu invasive qui ne nécessite pas de craniectomie. Cette procédure consiste à insérer un monofilament à travers l’artère carotide externe (ECA) et à le faire progresser à travers l’artère carotide interne (ICA) jusqu’à ce qu’il atteigne le point de ramification de l’ACM. Après une occlusion artérielle de 45 min, le monofilament est retiré pour permettre la reperfusion. Tout au long du processus, le flux sanguin cérébral est surveillé pour confirmer la réduction lors de l’occlusion et la récupération ultérieure lors de la reperfusion. Les résultats neurologiques et tissulaires sont évalués à l’aide de tests comportementaux et d’études d’imagerie par résonance magnétique (IRM).

Introduction

L’accident vasculaire cérébral est une maladie dévastatrice qui touche environ 15 millions de personnes dans le monde chaque année, selon l’OMS. Environ un tiers des patients succombent à la maladie, tandis qu’un autre tiers souffre d’une invalidité permanente. L’accident vasculaire cérébral est une pathologie complexe impliquant divers types de cellules, telles que les cellules immunitaires neurales et périphériques, le système vasculaire et les réponses systémiques1. Le réseau complexe de réactions déclenchées par un accident vasculaire cérébral au niveau du système ne peut actuellement pas être reproduit à l’aide de modèles in vitro . Ainsi, les modèles animaux expérimentaux sont essentiels pour approfondir les mécanismes de la maladie et pour développer et tester de nouvelles thérapies. À l’heure actuelle, la reperfusion tissulaire précoce est la seule intervention approuvée, soit par thrombolyse avec activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA), soit par thrombectomieendovasculaire 1.

Les occlusions de l’artère cérébrale moyenne (ACM) sont fréquentes chez les patients victimes d’un AVC. Par conséquent, des modèles d’occlusion transitoire de MCA (tMCAo) chez les rongeurs ont été initialement développés chez le rat 2,3,4. De nos jours, les souris génétiquement modifiées sont les animaux les plus couramment utilisés dans les modèles expérimentaux d’AVC. Dans cette étude, nous décrivons un modèle mini-invasif de tMCAo intraluminal chez la souris. L’approche est réalisée par l’artère carotide au niveau du cou, sans craniectomie.

La durée de la période d’occlusion est un facteur critique qui détermine l’étendue de la lésion ischémique. Même de courtes occlusions de 10 minutes peuvent provoquer une mort neuronale sélective sans infarctus apparent, tandis que des occlusions plus longues, généralement d’une durée de 30 à 60 minutes, entraînent un certain degré d’infarctus cérébral. Contrairement aux branches proximales et distales de l’ACM qui alimentent le cortex et possèdent des collatérales, les artères lenticulo-striatales qui irriguent le striatum n’ont pas de collatérales5. En conséquence, il y a une plus grande réduction du flux sanguin dans le striatum que dans le cortex après tMCAo. Ainsi, les occlusions de 30 min ou moins affectent généralement le striatum mais pas le cortex, tandis que les occlusions plus longues, à partir de 45 min, génèrent souvent une lésion ischémique dans l’ensemble du territoire de l’ACM, y compris le striatum et le cortex dorsolatéral.

Pour assurer le bien-être des souris, nous administrons des analgésiques avant l’intervention et utilisons l’anesthésie pendant la chirurgie. Néanmoins, l’anesthésie peut potentiellement introduire des altérations artificielles dans la physiologie de la souris et affecter certaines mesures de résultats6. L’intervention chirurgicale, lorsqu’elle est effectuée par du personnel expérimenté, dure généralement environ 15 minutes pour induire le MCAo. Par la suite, la durée totale sous anesthésie dépend de la période d’occlusion. Pour les expériences où la minimisation de l’anesthésie est cruciale, une étape alternative de la procédure consiste à arrêter l’anesthésie pendant la période d’occlusion et à la limiter uniquement aux étapes chirurgicales d’insertion et de retrait du filament occlusant le MCA. Cette approche permet de réduire la durée de l’anesthésie et de minimiser ses effets artifiques potentiels sur le modèle expérimental 7,8. Par conséquent, la méthode d’induction de l’ischémie focale transitoire est présentée par occlusion intraluminale du MCA avec deux variantes : avec la souris anesthésiée pendant toute la période d’occlusion ou avec la souris éveillée pendant cette période. Dans les deux cas, une chirurgie simulée doit être réalisée en parallèle de l’intervention effectuée sur les souris ischémiques. De plus, des données sur l’évaluation des résultats sont fournies, mesurées par des tests comportementaux et une IRM à différents moments après la reperfusion. Enfin, les principaux facteurs à prendre en compte lors de la mise en œuvre de la procédure expérimentale sont discutés.

Protocole

Le travail sur les animaux a été réalisé conformément aux lois catalane et espagnole (Real Decreto 53/2013) et aux directives européennes, avec l’approbation du Comité Esthétique d’Expérimentation Animale (CEEA) de l’Université de Barcelone et des organismes de réglementation locaux de la Generalitat de Catalunya. Les études sont rapportées conformément aux lignes directrices d’ARRIVE. Cette procédure est conçue pour être réalisée chez des souris adultes, à partir de l’âge de 8 semaines, sans limite d’âge. Des exemples d’intervention chirurgicale développée chez des souris C57BL/6 âgées de 10 à 12 semaines sont fournis ici. Les différences anatomiques en fonction de la souche de la souris doivent être prises en compte.

1. Préparation des animaux

  1. Avant de commencer l’intervention chirurgicale, rassemblez et stérilisez tout le matériel et les outils nécessaires. Installez la table d’opération avec tout le matériel chirurgical nécessaire (répertorié dans le tableau des matériaux).
  2. Anesthésier l’animal par inhalation d’isoflurane dans un mélange d’oxygène et de protoxyde d’azote (30%/70%).
  3. Administrer de la buprénorphine (voir le tableau des matériaux) par voie sous-cutanée à une dose de 0,05 mg/kg de poids corporel pour procurer une analgésie et soulager la douleur et l’inconfort.
    REMARQUE : L’analgésie est obligatoire, mais différents protocoles sont acceptés. Les signes de douleur et d’inconfort doivent également être contrôlés pendant les premiers jours suivant l’ACM (voir étape 4). Appliquer des solutions correctives si nécessaire.
  4. Placer l’animal dans une boîte d’induction d’anesthésie (voir le tableau des matériaux) avec 5 % d’isoflurane jusqu’à ce qu’il atteigne un état d’anesthésie profonde (perte de réflexe lors de la ponction de la patte et du réflexe oculaire).
  5. Positionnez la souris sur la table d’opération et diminuez le taux d’isoflurane à 1,5 %, délivré par le masque facial. Appliquez une pommade vétérinaire pour éviter la sécheresse oculaire pendant la procédure.
  6. Maintenir la température corporelle à 37 ± 0,5 °C contrôlée par une sonde rectale reliée à un coussin chauffant (voir le tableau des matériaux).
  7. Rasez la partie ventrale du cou et la tête (calvaria) avec un rasoir électrique. Enlevez soigneusement les débris de fourrure et désinfectez les zones de la peau trois fois en mouvements circulaires avec un désinfectant à base d’iode et d’alcool à 70%.
    .

2. Évaluation du débit sanguin cérébral (CBF) avec débitmétrie laser Doppler (LDF)

  1. À l’aide de ciseaux, faites une incision sur la peau de la tête, en direction de la suture sagittale, des oreilles jusqu’à la zone entre les yeux.
  2. Rétractez la peau et retirez le périoste sur le côté droit du crâne.
  3. Trouvez les coordonnées (2,5 mm latérales de Bregma) et fixez le support Doppler (voir tableau des matériaux) à l’aide de cyanoacrylate. Une fois la colle sèche, connectez la sonde Doppler et vérifiez que la lecture du signal est correcte.

3. Occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (tMCAo)

  1. Retournez la souris en position couchée sur le dos et fixez-la à la table d’opération avec du ruban adhésif médical.
  2. Faites une incision médiane sur le cou. Tirez latéralement la peau et les glandes salivaires vers l’arrière à l’aide d’écarteurs (voir le tableau des matériaux) pour exposer le territoire carotidien.
  3. Identifier l’anatomie vasculaire de l’artère carotide commune (ACC), de l’ICA et de l’ECA, ainsi que les différentes artères qui en sont dérivées (maxillaire et linguale, thyroïde supérieure, occipitale et ptérygopalatine) (Figure 1A).
  4. Détachez les artères principales du tissu conjonctif adjacent afin qu’elles puissent être manipulées.
    REMARQUE : Faites particulièrement attention à ne pas endommager les nerfs, en particulier le nerf vague, qui est parallèle à l’ACC.
  5. Enroulez une suture de soie 6-0 (voir le tableau des matériaux) autour de l’ECA au niveau de la bifurcation maxillaire/linguale. Fixez fermement un nœud pour interrompre définitivement la circulation.
  6. Passez une deuxième suture autour de la même artère, entre le premier nœud et la bifurcation de l’ACC, et gardez ce nœud lâche.
  7. Placez un troisième fil autour du CCA et faites un nœud coulant qui peut être facilement dénoué.
    REMARQUE : Cela peut également être effectué avec un clip vasculaire, mais le fil permet plus de mouvement et de flexibilité. A ce stade, il est possible d’observer une première diminution du CBF dans le signal LDF.
  8. Placez une pince vasculaire (voir le tableau des matériaux) en interrompant la circulation sanguine de l’ICA.
  9. Faites une petite incision dans l’ECA, près de la zone où se trouve le nœud serré.
  10. Insérez le monofilament jusqu’à ce que le revêtement épais ait complètement pénétré dans la lumière artérielle.
  11. Serrez le deuxième nœud pour maintenir le monofilament à l’intérieur de l’artère et éviter que la pression exercée par le sang ne le pousse vers l’extérieur (Figure 1B).
  12. Retirez le clip vasculaire de l’ICA.
  13. Coupez l’ECA sous le premier nœud et faites pivoter la souche pour l’orienter dans la direction de l’ICA (Figure 1C).
  14. Faites avancer le monofilament via l’ICA jusqu’au point où le MCA se ramifie.
    REMARQUE : L’occlusion se traduit par une chute brutale du flux sanguin dans la lecture du LDF. On considère qu’une occlusion est réussie lorsque la baisse du CBF est supérieure à 70 % par rapport à la valeur basale. Si les systèmes de mesure du CBF ne sont pas disponibles, le point d’occlusion peut être noté par la résistance à l’avancement, qui chez les souris adultes est généralement d’environ 11 mm de la bifurcation de l’ACC.
    1. Si l’anesthésie est poursuivie pendant la période d’occlusion, surveillez la souris et gardez-la sous observation constante pendant 45 min.
    2. Dans le cas où la souris est réveillée pendant la période d’occlusion, suturez la peau du cou avec plusieurs points de suture. Sans débrancher la sonde LDF, placez la souris dans la boîte à température contrôlée, permettant la récupération après l’anesthésie.
      REMARQUE : Il est courant que la souris présente un comportement d’encerclement spontané pendant cette période, ce qui indique une occlusion réussie.
    3. Après 40 min, anesthésier à nouveau la souris en suivant les mêmes procédures d’anesthésie et de désinfection que celles indiquées aux points 1.4, 1.5 et 1.7. Replacez-le sur la table d’opération et retirez les points de suture du cou.
  15. Après 45 min d’occlusion, desserrez le nœud qui maintient le monofilament en place. Tirez lentement et doucement sur le filament et vérifiez que la recanalisation tissulaire se produit.
  16. Retirez le filament et serrez le nœud pour éviter la perte de sang.
  17. Défaire le nœud de l’ACC. Assurez-vous qu’il n’y a pas de dommages à la paroi artérielle.
  18. Retirez les écarteurs et repositionnez les muscles, les glandes et la peau. Suturez la peau (6-0) et appliquez un désinfectant.
  19. Débranchez la sonde Doppler et détachez le support. Suturer et désinfecter la peau de la tête.
  20. Pendant la période de récupération de l’anesthésie, laissez la souris dans une cage munie d’un chauffage pour maintenir la température. Gardez-le sous observation constante jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli de l’anesthésie. Une fois récupérée, la souris peut être replacée dans sa cage.
    NOTE : Il est fortement recommandé d’utiliser un logement à enrichissement social. Cependant, ne mélangez jamais des souris opérées avec des souris non opérées dans la même cage sans aucune séparation physique afin d’éviter toute agression.

4. Soins postopératoires

  1. Surveillez périodiquement les animaux en suivant les procédures et les règlements établis conformément à la réglementation locale. Fournir un traitement analgésique selon le calendrier approprié pour minimiser la douleur après la chirurgie.
    NOTA : Dans la présente étude, le même analgésique qu’au début de l’intervention (buprénorphine 0,05 mg/kg de poids corporel) a été appliqué 6 h et 24 h après la chirurgie.
  2. Pratiquer l’euthanasie lorsque les paramètres de supervision l’indiquent, en suivant les protocoles approuvés par l’établissement.
  3. Surveillez quotidiennement le poids des animaux. Fournir de la nourriture molle aux animaux pendant les premiers jours suivant la chirurgie. De plus, hydratez-les par injection sous-cutanée de solution saline (200 μL) immédiatement après la chirurgie et périodiquement par la suite s’il est observé que la souris ne s’hydrate pas d’elle-même. Disposez la nourriture et l’eau de manière à ce qu’elles soient facilement accessibles à l’animal.
  4. Une fois l’étude in vivo terminée, anesthésiez les souris, euthanasiez-les et retirez le tissu cérébral pour une analyse histopathologique plus approfondie (si nécessaire).

Résultats

Il existe différentes approches pour évaluer le résultat de la procédure tMCAo. Des méthodes de neuroimagerie (IRM) in vivo et des tests comportementaux sont utilisés ici.

Les souris développent des lésions ischémiques dans le cerveau, affectant principalement le territoire alimenté par le MCA ipsilatéral à l’occlusion, comme le striatum et le cortex dorsolatéral. Plusieurs méthodes existent pour déterminer l’étendue de la lésion, notamment la coloration tissulair...

Discussion

La procédure tMCAo intraluminale est le modèle le plus couramment utilisé d’ischémie cérébrale focale avec reperfusion dans la recherche fondamentale. À l’heure actuelle, les souris sont le modèle animal privilégié en raison de la disponibilité de souches génétiquement modifiées. Cependant, il est essentiel de reconnaître que les souris génétiquement modifiées et leurs antécédents génétiques peuvent avoir un impact sur la vascularisation du cerveau. La présence d’une circulation collatérale ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Etude financée par la subvention PID2020-113202RB-I00 financée par le Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 et le Fonds européen de développement régional (FEDER). Une façon de faire l’Europe ». NCC et MAR ont bénéficié de bourses prédoctorales (PRE2021-099481 et PRE2018-085737, respectivement) financées par MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 et par le Fonds social européen (FSE) Investir dans votre avenir. Nous remercions Francisca Ruiz-Jaén et Leonardo Márquez-Kisinousky pour leur soutien technique. Nous remercions le soutien de l’installation d’imagerie IRM de l’Institut d’Investigation Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Le programme des Centres de Conscience de Catalogne (CERCA) de la Generalitat de Catalunya soutient l’IDIBAPS.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
6/0 suture AragoVascular ligatures
6/0 suture with curved needleAragoSkin sutures
9 mg/mL SalineFresenius KabiCN616003 ECFor hydration
Anaesthesia systemSurgiVet
Blunt retractors, 1 mm wideFine Science Tools18200-09
BuprenorfineBuprexFor pain relief
Clamp applying forcepsFine Science ToolsS&T CAF4
Dumont mini forcepsFine Science ToolsM3S 11200-10
ForcepsFine Science Tools91106-12
GlueLoctiteTo stick LDF probe to the skull
Grip Strength MeterIITC Life Science Inc.#2200
IsofluraneB-BraunCN571105.8
LDF PerimedPerimedPeriflux System 5000
LDF Probe HoldersPerimedPH 07-4
Medical tape
MRI magnetBruker BioSpin, Ettlingen, GermanyBioSpec 70/30 horizontal animal scanner 
Needle Holder with Suture CutterFine Science Tools12002-14
Nylon filamentDoccol701912PK5Re
Recovery cage with heating pad
Sirgical scissorsFine Science Tools91401-12
Small vessel cauterizer kitFine Science Tools18000-00
Stereomicroscope and cold lightLeicaM60
Suture tying forcepsFine Science Tools18025-10
Thermostat, rectal probe and mouse padLetica Science InstrumentsLE 13206
Vannas spring scissors (4mm cutting edge)Fine Science Tools15019-10
Vascular clampsFine Science Tools00396-01

Références

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