Transienter mittlerer Hirnarterienverschluss Modell des Schlaganfalls

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Modell der transienten fokalen zerebralen Ischämie bei Mäusen durch intraluminalen Verschluss der mittleren Hirnarterie. Darüber hinaus werden Beispiele für die Ergebnisbewertung mit Hilfe von Magnetresonanztomographie und Verhaltenstests gezeigt.

Zusammenfassung

Schlaganfälle sind weltweit eine der Hauptursachen für Tod oder chronische Behinderungen. Nichtsdestotrotz beschränken sich die bestehenden optimalen Behandlungen auf Reperfusionstherapien während der akuten Phase des ischämischen Schlaganfalls. Um Einblicke in die Schlaganfallphysiopathologie zu gewinnen und innovative Therapieansätze zu entwickeln, spielen in vivo Nagetiermodelle des Schlaganfalls eine grundlegende Rolle. Die Verfügbarkeit von genetisch veränderten Tieren hat insbesondere den Einsatz von Mäusen als experimentelle Schlaganfallmodelle vorangetrieben.

Bei Schlaganfallpatienten ist ein Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA) ein häufiges Ereignis. Folglich ist das am weitesten verbreitete experimentelle Modell die intraluminale Okklusion des MCA, eine minimalinvasive Technik, die keine Kraniektomie erfordert. Bei diesem Verfahren wird ein Monofilament durch die Arteria carotis externa (ECA) eingeführt und durch die Arteria carotis interna (ICA) vorgeschoben, bis es den Verzweigungspunkt des MCA erreicht. Nach einem 45-minütigen arteriellen Verschluss wird das Monofilament entfernt, um eine Reperfusion zu ermöglichen. Während des gesamten Prozesses wird der zerebrale Blutfluss überwacht, um die Verringerung während der Okklusion und die anschließende Erholung nach der Reperfusion zu bestätigen. Die neurologischen und gewebebezogenen Ergebnisse werden mit Hilfe von Verhaltenstests und Magnetresonanztomographie (MRT) bewertet.

Einleitung

Der Schlaganfall ist eine verheerende Krankheit, von der nach Angaben der WHO jährlich etwa 15 Millionen Menschen weltweit betroffen sind. Etwa ein Drittel der Patienten erliegt der Erkrankung, ein weiteres Drittel erleidet eine dauerhafte Behinderung. Der Schlaganfall ist eine komplexe Pathologie, an der verschiedene Zelltypen beteiligt sind, wie z. B. neuronale und periphere Immunzellen, Gefäße und systemische Reaktionen¹. Das komplizierte Netzwerk von Reaktionen, die durch Schlaganfälle auf Systemebene ausgelöst werden, kann derzeit nicht mit In-vitro-Modellen repliziert werden. Daher sind experimentelle Tiermodelle unerlässlich, um die Mechanismen der Krankheit zu erforschen und neue Therapien zu entwickeln und zu testen. Derzeit ist die frühe Gewebereperfusion die einzige zugelassene Intervention, entweder durch Thrombolyse mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA) oder endovaskuläre Thrombektomie¹.

Verschlüsse der mittleren Hirnarterie (MCA) sind bei Schlaganfallpatienten häufig. Folglich wurden zunächst Nagetiermodelle für transiente MCA-Okklusion (tMCAo) bei Ratten entwickelt ^2,3,4. Genetisch veränderte Mäuse sind heute die am häufigsten verwendeten Tiere in experimentellen Schlaganfallmodellen. In dieser Studie beschreiben wir ein minimal-invasives Modell des intraluminalen tMCAo in Mäusen. Der Zugang erfolgt über die Halsschlagader auf Höhe des Halses, ohne Kraniektomie.

Die Dauer der Okklusionsperiode ist ein kritischer Faktor, der das Ausmaß der ischämischen Läsion bestimmt. Selbst kurze Okklusionen von 10 Minuten können einen selektiven neuronalen Tod ohne offensichtlichen Infarkt verursachen, während längere Okklusionen, die typischerweise 30 bis 60 Minuten dauern, zu einem gewissen Grad an Hirninfarkt führen. Im Gegensatz zu den proximalen und distalen Ästen des MCA, die den Kortex versorgen und Kollateralen haben, fehlen den lentikulo-striatalen Arterien, die das Striatum mit Blut versorgen, Kollateralarterien⁵. In der Folge kommt es nach tMCAo zu einer stärkeren Verminderung des Blutflusses im Striatum als im Kortex. So betreffen Okklusionen von 30 Minuten oder weniger in der Regel das Striatum, aber nicht den Kortex, während längere Okklusionen ab 45 Minuten oft eine ischämische Läsion im gesamten MCA-Territorium, einschließlich des Striatums und des dorsolateralen Kortex, hervorrufen.

Um das Wohlbefinden der Mäuse zu gewährleisten, verabreichen wir vor dem Eingriff Analgetika und verwenden während der Operation eine Narkose. Nichtsdestotrotz kann die Anästhesie möglicherweise künstliche Veränderungen in der Physiologie der Maus bewirken und einige Ergebnismaße beeinflussen⁶. Der chirurgische Eingriff, wenn er von erfahrenem Personal durchgeführt wird, dauert in der Regel etwa 15 Minuten, um MCAo zu induzieren. Anschließend hängt die Gesamtdauer unter Narkose von der Okklusionszeit ab. Bei Experimenten, bei denen die Minimierung der Anästhesie von entscheidender Bedeutung ist, besteht ein alternativer Schritt des Verfahrens darin, die Anästhesie während der Okklusionsperiode abzubrechen und sie nur auf die chirurgischen Schritte zum Einführen und Herausziehen des Filaments zu beschränken, das den MCA verschließt. Dieser Ansatz verkürzt die Dauer der Anästhesie und minimiert ihre potenziellen artifaktischen Auswirkungen auf das experimentelle Modell ^7,8. Daher wird die Methode zur Induktion einer transienten fokalen Ischämie durch intraluminalen Verschluss des MCA mit zwei Varianten vorgestellt: mit der Maus während der gesamten Okklusionsperiode anästhesiert oder mit der Maus wach während dieser Periode. In beiden Fällen sollte parallel zu dem Eingriff an den ischämischen Mäusen eine Scheinoperation durchgeführt werden. Darüber hinaus werden Daten zur Ergebnisbewertung bereitgestellt, die durch Verhaltenstests und MRT zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Reperfusion gemessen werden. Abschließend werden die wichtigsten Faktoren diskutiert, die bei der Durchführung des experimentellen Verfahrens zu berücksichtigen sind.

Protokoll

Die Tierarbeit wurde nach den katalanischen und spanischen Gesetzen (Real Decreto 53/2013) und den europäischen Richtlinien durchgeführt, mit Zustimmung des Ethikkomitees (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) der Universität Barcelona und der lokalen Aufsichtsbehörden der Generalitat de Catalunya. Die Studien werden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien berichtet. Dieses Verfahren ist so konzipiert, dass es bei erwachsenen Mäusen ab einem Alter von 8 Wochen ohne Altersbeschränkung durchgeführt werden kann. Beispiele für das chirurgische Verfahren, das an C57BL/6-Mäusen im Alter von 10-12 Wochen entwickelt wurde, finden Sie hier. Anatomische Unterschiede je nach Mausstamm sollten berücksichtigt werden.

1. Zubereitung von Tieren

1. Bevor Sie mit dem chirurgischen Eingriff beginnen, sammeln und sterilisieren Sie alle erforderlichen Materialien und Werkzeuge. Richten Sie den OP-Tisch mit allen notwendigen chirurgischen Materialien ein (siehe Materialtabelle).
2. Betäubung des Tieres durch Isofluran-Inhalation in einem Gemisch aus Sauerstoff und Distickstoffmonoxid (30%/70%).
3. Verabreichen Sie Buprenorphin (siehe Materialtabelle) subkutan in einer Dosierung von 0,05 mg/kg Körpergewicht, um eine Analgesie zu gewährleisten und Schmerzen und Beschwerden zu lindern.
   HINWEIS: Analgesie ist obligatorisch, aber es werden unterschiedliche Protokolle akzeptiert. Auch Schmerz- und Unbehagenzeichen müssen in den ersten Tagen nach MCAo kontrolliert werden (siehe Schritt 4). Tragen Sie bei Bedarf Korrekturlösungen auf.
4. Legen Sie das Tier in eine Anästhesie-Induktionsbox (siehe Materialtabelle) mit 5% Isofluran, bis es einen Zustand tiefer Narkose erreicht hat (Verlust des Reflexes bei der Pfotenpunktion und des Augenreflexes).
5. Positionieren Sie die Maus auf dem Operationstisch und senken Sie den Isofluranspiegel auf 1,5 %, der von der Gesichtsmaske abgegeben wird. Tragen Sie Tierarztsalbe auf, um Augentrockenheit während des Eingriffs zu vermeiden.
6. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 ± 0,5 °C, kontrolliert durch eine Rektalsonde, die an ein Heizkissen angeschlossen ist (siehe Materialtabelle).
7. Rasieren Sie den ventralen Teil des Halses und des Kopfes (Calvaria) mit einem elektrischen Rasierer. Fellreste vorsichtig entfernen und die Hautpartien dreimal in kreisenden Bewegungen mit Desinfektionsmittel auf Jodbasis und 70%igem Alkohol desinfizieren.
   .

2. Beurteilung des zerebralen Blutflusses (CBF) mit Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF)

1. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt auf der Haut des Kopfes in Richtung der sagittalen Naht, von den Ohren bis zum Bereich zwischen den Augen.
2. Ziehen Sie die Haut zurück und entfernen Sie die Knochenhaut auf der rechten Seite des Schädels.
3. Ermitteln Sie die Koordinaten (2,5 mm seitlich von Bregma) und befestigen Sie den Dopplerhalter (siehe Materialtabelle) mit Cyanacrylat. Nachdem der Kleber getrocknet ist, schließen Sie die Dopplersonde an und überprüfen Sie, ob das Signal korrekt ausgelesen wurde.

3. Vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterie (tMCAo)

1. Drehen Sie die Maus in Rückenlage und befestigen Sie sie mit medizinischem Klebeband auf dem Operationstisch.
2. Mache einen Schnitt in der Mittellinie am Hals. Ziehen Sie die Haut und die Speicheldrüsen mit Retraktoren (siehe Materialtabelle) seitlich zurück, um das Karotisgebiet freizulegen.
3. Identifizieren Sie die vaskuläre Anatomie der Arteria carotis communis (CCA), der ICA und der ECA sowie die verschiedenen Arterien, die von ihnen abgeleitet sind (Oberkiefer und Lingualartrie, obere Schilddrüse, Okzipitalartumor und Pterygopalatin) (Abbildung 1A).
4. Lösen Sie die Hauptarterien vom angrenzenden Bindegewebe, damit sie behandelt werden können.
   HINWEIS: Achten Sie besonders darauf, die Nerven nicht zu schädigen, insbesondere nicht den Vagusnerv, der parallel zum CCA verläuft.
5. Wickeln Sie ein 6-0-Seidennaht (siehe Materialtabelle) um die ECA an der Gabelung zwischen Oberkiefer und Zungen. Befestigen Sie einen Knoten fest, um den Kreislauf dauerhaft zu unterbrechen.
6. Führen Sie eine zweite Naht um dieselbe Arterie zwischen dem ersten Knoten und der CCA-Bifurkation und halten Sie diesen Knoten locker.
7. Lege einen dritten Faden um den CCA und binde einen Schlupfknoten, der sich leicht lösen lässt.
   HINWEIS: Dies kann auch mit einem Gefäßclip durchgeführt werden, allerdings lässt der Faden mehr Bewegung und Flexibilität zu. In diesem Stadium ist es möglich, eine erste Abnahme des CBF im LDF-Signal zu beobachten.
8. Platzieren Sie eine Gefäßklammer (siehe Materialtabelle), die die Durchblutung des ICA unterbricht.
9. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der ECA, in der Nähe des Bereichs, in dem sich der feste Knoten befindet.
10. Führen Sie das Monofilament ein, bis die dicke Beschichtung vollständig in das arterielle Lumen eingedrungen ist.
11. Ziehen Sie den zweiten Knoten fest, um das Monofilament in der Arterie zu halten und zu verhindern, dass der vom Blut ausgeübte Druck es herausdrückt (Abbildung 1B).
12. Entfernen Sie die Gefäßklammer vom ICA.
13. Schneiden Sie den ECA unterhalb des ersten Knotens ab und drehen Sie den Stumpf, um ihn in Richtung ICA auszurichten (Abbildung 1C).
14. Schieben Sie das Monofilament über den ICA bis zu dem Punkt, an dem sich der MCA verzweigt.
    HINWEIS: Die Okklusion spiegelt sich in einem abrupten Blutflussabfall in der LDF-Anzeige wider. Wir sprechen von einem erfolgreichen Verschluss, wenn der CBF-Abfall mehr als 70 % des Basalwerts beträgt. Wenn keine CBF-Messsysteme zur Verfügung stehen, kann der Punkt der Okklusion durch den Widerstand gegen den Vorschub festgestellt werden, der bei erwachsenen Mäusen in der Regel etwa 11 mm von der Bifurkation des CCA entfernt ist.
    1. Wenn die Anästhesie während der Okklusionsphase fortgesetzt wird, überwachen Sie die Maus und halten Sie sie 45 Minuten lang unter ständiger Beobachtung.
    2. Falls die Maus während der Okklusionsphase geweckt wird, nähen Sie die Haut des Halses mit mehreren Stichen. Ohne die LDF-Sonde zu trennen, legen Sie die Maus in die temperaturkontrollierte Box, um sich von der Anästhesie zu erholen.
       HINWEIS: Es ist üblich, dass die Maus während dieser Zeit ein spontanes Kreisverhalten zeigt, was auf eine erfolgreiche Okklusion hinweist.
    3. Nach 40 Minuten ist die Maus erneut zu betäuben, wobei die gleichen Anästhesie- und Desinfektionsverfahren wie in den Nummern 1.4, 1.5 und 1.7 beschrieben anzuwenden sind. Legen Sie es zurück auf den Operationstisch und entfernen Sie die Fäden aus dem Hals.
15. Lösen Sie nach 45 Minuten Okklusion den Knoten, der das Monofilament an Ort und Stelle hält. Ziehen Sie langsam und vorsichtig am Filament und prüfen Sie, ob eine Geweberekanalisation stattfindet.
16. Ziehen Sie das Filament heraus und ziehen Sie den Knoten fest, um Blutverlust zu verhindern.
17. Löse den CCA-Knoten. Stellen Sie sicher, dass keine Schäden an der Arterienwand vorliegen.
18. Entfernen Sie die Retraktoren und positionieren Sie die Muskeln, Drüsen und die Haut neu. Die Haut vernähen (6-0) und Desinfektionsmittel auftragen.
19. Trennen Sie die Dopplersonde und nehmen Sie die Halterung ab. Vernähen und desinfizieren Sie die Haut des Kopfes.
20. Lassen Sie die Maus während der Erholungsphase nach der Narkose in einem Käfig, der mit einer Heizung ausgestattet ist, um die Temperatur zu halten. Halten Sie es unter ständiger Beobachtung, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat. Nach der Genesung kann die Maus wieder in ihren Käfig zurückgebracht werden.
    HINWEIS: Wohnen mit sozialer Bereicherung wird dringend empfohlen. Mischen Sie jedoch niemals operierte Mäuse mit nicht operierten Mäusen im selben Käfig ohne physische Trennung, um Aggressionen zu vermeiden.

4. Nachsorge nach der Operation

1. Beaufsichtigen Sie die Tiere regelmäßig gemäß den Verfahren und Vorschriften, die gemäß den örtlichen Vorschriften festgelegt wurden. Bieten Sie eine schmerzstillende Behandlung nach dem entsprechenden Zeitplan an, um die Schmerzen nach der Operation zu minimieren.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde 6 h und 24 h nach der Operation das gleiche Analgetikum wie zu Beginn des Eingriffs (Buprenorphin 0,05 mg/kg KG) appliziert.
2. Euthanasie durchführen, wenn die Aufsichtsparameter dies anzeigen, gemäß den institutionell genehmigten Protokollen.
3. Überwachen Sie täglich das Gewicht der Tiere. Versorgen Sie die Tiere in den ersten Tagen nach der Operation mit weichem Futter. Darüber hinaus sollten sie unmittelbar nach der Operation und in regelmäßigen Abständen nach der Operation durch subkutane Injektion von Kochsalzlösung (200 μl) hydratisiert werden, wenn beobachtet wird, dass die Maus nicht von selbst hydratisiert. Ordnen Sie Futter und Wasser so an, dass es für das Tier leicht zugänglich ist.
4. Sobald die In-vivo-Studie abgeschlossen ist, werden die Mäuse anästhesiert, eingeschläfert und das Hirngewebe für weitere histopathologische Analysen (falls erforderlich) entfernt.

Ergebnisse

Es gibt verschiedene Ansätze, um das Ergebnis des tMCAo-Verfahrens zu bewerten. Hier kommen In-vivo-Verfahren der Neurobildgebung (MRT) und Verhaltenstests zum Einsatz.

Mäuse entwickeln ischämische Läsionen im Gehirn, die hauptsächlich das Gebiet betreffen, das vom MCA ipsilateral zur Okklusion versorgt wird, wie das Striatum und den dorsolateralen Kortex. Es gibt mehrere Methoden, um das Ausmaß der Läsion zu bestimmen, darunter die Gewebefärbung mit 2,3,5-Triphenyltetrazolium...

Diskussion

Das intraluminale tMCAo-Verfahren ist das in der Grundlagenforschung am häufigsten verwendete Modell der fokalen Hirnischämie mit Reperfusion. Derzeit sind Mäuse aufgrund der Verfügbarkeit genetisch veränderter Stämme das bevorzugte Tiermodell. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass genetisch veränderte Mäuse und ihr genetischer Hintergrund die Vaskularisierung des Gehirns beeinflussen können. Das Vorhandensein von Kollateralzirkulation und Anastomosen zwischen verschiedenen arteriellen Territorien kann die Er...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 suture	Arago		Vascular ligatures
6/0 suture with curved needle	Arago		Skin sutures
9 mg/mL Saline	Fresenius Kabi	CN616003 EC	For hydration
Anaesthesia system	SurgiVet
Blunt retractors, 1 mm wide	Fine Science Tools	18200-09
Buprenorfine	Buprex		For pain relief
Clamp applying forceps	Fine Science Tools	S&T CAF4
Dumont mini forceps	Fine Science Tools	M3S 11200-10
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Glue	Loctite		To stick LDF probe to the skull
Grip Strength Meter	IITC Life Science Inc.	#2200
Isoflurane	B-Braun	CN571105.8
LDF Perimed	Perimed	Periflux System 5000
LDF Probe Holders	Perimed	PH 07-4
Medical tape
MRI magnet	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany		BioSpec 70/30 horizontal animal scanner
Needle Holder with Suture Cutter	Fine Science Tools	12002-14
Nylon filament	Doccol	701912PK5Re
Recovery cage with heating pad
Sirgical scissors	Fine Science Tools	91401-12
Small vessel cauterizer kit	Fine Science Tools	18000-00
Stereomicroscope and cold light	Leica	M60
Suture tying forceps	Fine Science Tools	18025-10
Thermostat, rectal probe and mouse pad	Letica Science Instruments	LE 13206
Vannas spring scissors (4mm cutting edge)	Fine Science Tools	15019-10
Vascular clamps	Fine Science Tools	00396-01