Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico

Resumo

Este protocolo descreve o modelo de isquemia cerebral focal transitória em camundongos através da oclusão intraluminal da artéria cerebral média. Além disso, exemplos de avaliação de resultados são mostrados usando ressonância magnética e testes comportamentais.

Resumo

O AVC é uma das principais causas de morte ou incapacidade crônica em todo o mundo. No entanto, os tratamentos ideais existentes são limitados às terapias de reperfusão durante a fase aguda do acidente vascular cerebral isquêmico. Para obter informações sobre a fisiopatologia do AVC e desenvolver abordagens terapêuticas inovadoras, modelos in vivo de roedores de AVC desempenham um papel fundamental. A disponibilidade de animais geneticamente modificados tem impulsionado particularmente o uso de camundongos como modelos experimentais de AVC.

Em pacientes com acidente vascular encefálico, a oclusão da artéria cerebral média (ACM) é uma ocorrência comum. Consequentemente, o modelo experimental mais prevalente envolve a oclusão intraluminal da ACM, uma técnica minimamente invasiva que não requer craniectomia. Esse procedimento consiste em inserir um monofilamento através da artéria carótida externa (ECA) e avançá-lo através da artéria carótida interna (ACI) até atingir o ponto de ramificação da ACM. Após 45 min de oclusão arterial, o monofilamento é removido para permitir a reperfusão. Durante todo o processo, o fluxo sanguíneo cerebral é monitorado para confirmar a redução durante a oclusão e posterior recuperação após a reperfusão. Os resultados neurológicos e teciduais são avaliados por meio de testes comportamentais e estudos de ressonância magnética (RM).

Introdução

O AVC é uma doença devastadora que afeta aproximadamente 15 milhões de pessoas em todo o mundo anualmente, de acordo com a OMS. Cerca de um terço dos pacientes sucumbe à condição, enquanto outro terço experimenta incapacidade permanente. O acidente vascular encefálico (AVE) é uma patologia complexa que envolve vários tipos celulares, como células imunes neurais e periféricas, vasculatura e respostas^sistêmicas1. A intrincada rede de reações desencadeadas pelo AVC em nível de sistemas não pode ser replicada atualmente usando modelos in vitro . Assim, modelos animais experimentais são essenciais para aprofundar os mecanismos da doença e desenvolver e testar novas terapias. Atualmente, a reperfusão tecidual precoce é a única intervenção aprovada, seja por meio de trombólise com ativador de plasminogênio tecidual (tPA) ou trombectomia endovascular¹.

Oclusões da artéria cerebral média (ACM) são frequentes em pacientes com acidente vascular encefálico. Consequentemente, modelos roedores de oclusão transitória da MCA (tMCAo) foram inicialmente desenvolvidos em^ratos2,3,4. Atualmente, camundongos geneticamente modificados são os animais mais utilizados em modelos experimentais de AVC. Neste estudo, descrevemos um modelo minimamente invasivo de tMCAo intraluminal em camundongos. A abordagem é realizada através da artéria carótida ao nível do pescoço, sem craniectomia.

A duração do período de oclusão é um fator crítico que determina a extensão da lesão isquêmica. Mesmo oclusões curtas de 10 min podem causar morte neuronal seletiva sem um infarto aparente, enquanto oclusões mais longas, tipicamente com duração de 30 a 60 min, resultam em algum grau de infarto cerebral. Ao contrário dos ramos proximal e distal da ACM que suprem o córtex e possuem colaterais, as artérias lentículo-estriatais que fornecem sangue para o estriado carecem de colaterais⁵. Como consequência, há maior redução do fluxo sanguíneo no estriado do que no córtex após a tMCAo. Assim, oclusões de 30 min ou menos geralmente afetam o estriado, mas não o córtex, enquanto oclusões mais longas, a partir de 45 min, frequentemente geram uma lesão isquêmica em todo o território da ACM, incluindo o estriado e o córtex dorsolateral.

Para garantir o bem-estar dos camundongos, administramos analgésicos antes do procedimento e usamos anestesia durante a cirurgia. No entanto, a anestesia pode potencialmente introduzir alterações artificiais na fisiologia do camundongo e afetar algumas medidas de desfecho⁶. A intervenção cirúrgica, quando realizada por pessoal experiente, geralmente dura cerca de 15 min para indução de MCAo. Posteriormente, o tempo total de anestesia depende do período de oclusão. Para experimentos em que minimizar a anestesia é crucial, uma etapa alternativa do procedimento envolve a interrupção da anestesia durante o período de oclusão e limitá-la apenas às etapas cirúrgicas para inserir e retirar o filamento que oclui a ACM. Essa abordagem reduz a duração da anestesia e minimiza seus potenciais efeitos artefatuais no modelo experimental ^7,8. Portanto, o método de indução de isquemia focal transitória é apresentado pela oclusão intraluminal da ACM com duas variantes: com o camundongo anestesiado durante todo o período de oclusão ou com o camundongo acordado durante esse período. Em ambos os casos, uma cirurgia simulada deve ser realizada em paralelo com a intervenção realizada nos camundongos isquêmicos. Além disso, dados sobre a avaliação do desfecho são fornecidos medidos por testes comportamentais e ressonância magnética em vários momentos após a reperfusão. Finalmente, os principais fatores a serem considerados na implementação do procedimento experimental são discutidos.

Protocolo

O trabalho com animais foi realizado seguindo as leis catalãs e espanholas (Real Decreto 53/2013) e as diretivas europeias, com aprovação do comitê de ética (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) da Universidade de Barcelona, e dos órgãos reguladores locais da Generalitat de Catalunya. Os estudos são reportados em conformidade com as diretrizes ARRIVE. Este procedimento foi projetado para ser realizado em camundongos adultos, a partir de 8 semanas de idade, sem limite de idade. Exemplos do procedimento cirúrgico desenvolvido em camundongos C57BL/6 de 10-12 semanas de idade são fornecidos aqui. Diferenças anatômicas dependendo da cepa do camundongo devem ser consideradas.

1. Preparo dos animais

1. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, reúna e esterilize todos os materiais e ferramentas necessários. Monte a mesa cirúrgica com todos os materiais cirúrgicos necessários (listados na Tabela de Materiais).
2. Anestesiar o animal por inalação de isoflurano em mistura de oxigênio e óxido nitroso (30%/70%).
3. Administrar buprenorfina (ver Tabela de Materiais) por via subcutânea na dose de 0,05 mg/kg PV para proporcionar analgesia e aliviar qualquer dor e desconforto.
   NOTA: A analgesia é obrigatória, mas protocolos diferentes são aceitos. Os sinais de dor e desconforto também devem ser controlados durante os primeiros dias após a MCAo (ver passo 4). Aplicar soluções corretivas quando necessário.
4. Colocar o animal em caixa de indução anestésica (ver Tabela de Materiais) com isoflurano a 5% até atingir um estado de anestesia profunda (perda do reflexo na punção da pata e reflexo ocular).
5. Posicione o mouse sobre a mesa cirúrgica e diminua o nível de isoflurano para 1,5%, administrado por máscara facial. Aplique pomada veterinária para evitar o ressecamento dos olhos durante o procedimento.
6. Manter a temperatura corporal em 37 ± 0,5 °C controlada por uma sonda retal conectada a uma almofada de aquecimento (ver Tabela de Materiais).
7. Faça a barba na parte ventral do pescoço e na cabeça (calvária) com uma navalha elétrica. Remova cuidadosamente os restos de pelos e desinfete as áreas da pele três vezes em movimentos circulares com desinfetante à base de iodo e álcool a 70%.
   .

2. Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) com Dopplerfluxometria a laser (FDL)

1. Com tesoura, faça uma incisão na pele da cabeça, na direção da sutura sagital, das orelhas até a área entre os olhos.
2. Retrair a pele e remover o periósteo do lado direito do crânio.
3. Encontre as coordenadas (2,5 mm laterais do Bregma) e fixe o suporte Doppler (ver Tabela de Materiais) usando cianoacrilato. Depois que a cola secar, conecte a sonda Doppler e verifique a leitura correta do sinal.

3. Oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAo)

1. Vire o mouse para a posição supina e fixe-o na mesa cirúrgica com fita adesiva.
2. Faça uma incisão na linha média do pescoço. Recuar lateralmente a pele e as glândulas salivares usando afastadores (ver Tabela de Materiais) para expor o território carotídeo.
3. Identificar a anatomia vascular da artéria carótida comum (ACC), da ACI e da ECA, bem como as diferentes artérias delas derivadas (maxilar e lingual, tireoide superior, occipital e pterigopalatina) (Figura 1A).
4. Desprenda as artérias principais do tecido conjuntivo adjacente para que possam ser manuseadas.
   NOTA: Tome cuidado especial para não danificar os nervos, especialmente o nervo vago, que corre paralelamente ao CCA.
5. Envolver uma sutura de seda 6-0 (ver Tabela de Materiais) ao redor da ECA na bifurcação maxilar/lingual. Aperte bem um nó para interromper permanentemente a circulação.
6. Passar uma segunda sutura ao redor da mesma artéria, entre o primeiro nó e a bifurcação da ACC, e manter esse nó solto.
7. Coloque um terceiro fio ao redor do CCA e amarre um nó deslizante que pode ser facilmente desatado.
   OBS: Isso também pode ser realizado com um clipe vascular, mas o fio permite mais movimento e flexibilidade. Nesta etapa é possível observar uma primeira diminuição do FSC no sinal da FDL.
8. Coloque um clipe vascular (ver Tabela de Materiais) interrompendo a circulação sanguínea a partir do ICA.
9. Faça uma pequena incisão na ECA, próximo à área onde o nó apertado está localizado.
10. Insira o monofilamento até que o revestimento espesso tenha entrado completamente na luz arterial.
11. Aperte o segundo nó para segurar o monofilamento dentro da artéria e evitar que a pressão exercida pelo sangue o empurre para fora (Figura 1B).
12. Remova o clipe vascular do ICA.
13. Corte o ECA abaixo do primeiro nó e gire o coto para orientá-lo em direção à ACI (Figura 1C).
14. Avançar o monofilamento através do ICA até o ponto onde o MCA se ramifica.
    NOTA: A oclusão é refletida em uma queda abrupta do fluxo sanguíneo na leitura do LDF. Consideramos sucesso a oclusão quando a queda do FSC for maior que 70% do valor basal. Se os sistemas de medição do FSC não estiverem disponíveis, o ponto de oclusão pode ser notado pela resistência ao avanço, que em camundongos adultos geralmente está a cerca de 11 mm da bifurcação da CCA.
    1. Se a anestesia for continuada durante o período de oclusão, monitorar o camundongo e mantê-lo sob observação constante por 45 min.
    2. Caso o camundongo seja acordado durante o período de oclusão, suture a pele do pescoço com vários pontos. Sem desconectar a sonda de FDL, coloque o mouse na caixa com temperatura controlada, permitindo a recuperação da anestesia.
       NOTA: É comum que o camundongo apresente comportamento de circular espontâneo durante esse período, indicativo de oclusão bem-sucedida.
    3. Após 40 min, anestesiar novamente o rato seguindo os mesmos procedimentos de anestesia e desinfecção indicados nos pontos 1.4, 1.5 e 1.7. Coloque-o de volta na mesa cirúrgica e retire os pontos do pescoço.
15. Após 45 min de oclusão, solte o nó mantendo o monofilamento no lugar. Puxe lenta e suavemente o filamento e verifique se ocorre a recanalização do tecido.
16. Puxe o filamento e aperte o nó para evitar a perda de sangue.
17. Desamarre o nó do CCA. Certifique-se de que não há danos na parede arterial.
18. Remova os afastadores e reposicione os músculos, glândulas e pele. Sutura a pele (6-0) e aplicação de desinfetante.
19. Desconecte a sonda Doppler e retire o suporte. Sutura e desinfecção da pele da cabeça.
20. Durante o período de recuperação da anestesia, deixe o rato numa gaiola equipada com um aquecedor para manter a temperatura. Mantenha-o sob observação constante até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Após a recuperação, o rato pode ser devolvido à sua gaiola.
    NOTA: Habitação com enriquecimento social é altamente recomendada. No entanto, nunca misture camundongos operados com camundongos não operados na mesma gaiola sem qualquer separação física, a fim de evitar agressão.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Supervisionar periodicamente os animais seguindo os procedimentos e normas estabelecidas de acordo com as normas locais. Fornecer tratamento analgésico no horário adequado para minimizar a dor após a cirurgia.
   LEGENDA: No presente estudo, o mesmo analgésico foi aplicado no início da intervenção (Buprenorfina 0,05mg/kg PV) 6 h e 24 h após a cirurgia.
2. Realizar a eutanásia quando os parâmetros de supervisão assim o indicarem, seguindo os protocolos aprovados institucionalmente.
3. Monitorar diariamente o peso dos animais. Fornecer ração macia aos animais durante os primeiros dias após a cirurgia. Além disso, hidratá-los por injeção subcutânea de soro fisiológico (200 μL) imediatamente após a cirurgia e periodicamente depois se for observado que o camundongo não se hidrata sozinho. Organize comida e água de forma que seja facilmente acessível ao animal.
4. Uma vez concluído o estudo in vivo , anestesiar os camundongos, eutanasiá-los e remover o tecido cerebral para análise histopatológica adicional (se necessário).

Resultados

Existem diferentes abordagens para avaliar o resultado do procedimento de tMCAo. Métodos de neuroimagem (RM) in vivo e testes comportamentais são utilizados aqui.

Camundongos desenvolvem lesões isquêmicas no cérebro, afetando principalmente o território suprido pela ACM ipsilateral à oclusão, como o estriado e o córtex dorsolateral. Existem vários métodos para determinar a extensão da lesão, incluindo a coloração tecidual com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC), ...

Discussão

O procedimento de tMCAo intraluminal é o modelo mais comumente utilizado de isquemia cerebral focal com reperfusão em pesquisa básica. Atualmente, camundongos são o modelo animal preferido devido à disponibilidade de linhagens geneticamente modificadas. No entanto, é essencial reconhecer que camundongos geneticamente modificados e suas origens genéticas podem afetar a vascularização cerebral. A presença de circulação colateral e anastomoses entre diferentes territórios arteriais pode influenciar significativ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6/0 suture	Arago		Vascular ligatures
6/0 suture with curved needle	Arago		Skin sutures
9 mg/mL Saline	Fresenius Kabi	CN616003 EC	For hydration
Anaesthesia system	SurgiVet
Blunt retractors, 1 mm wide	Fine Science Tools	18200-09
Buprenorfine	Buprex		For pain relief
Clamp applying forceps	Fine Science Tools	S&T CAF4
Dumont mini forceps	Fine Science Tools	M3S 11200-10
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Glue	Loctite		To stick LDF probe to the skull
Grip Strength Meter	IITC Life Science Inc.	#2200
Isoflurane	B-Braun	CN571105.8
LDF Perimed	Perimed	Periflux System 5000
LDF Probe Holders	Perimed	PH 07-4
Medical tape
MRI magnet	Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany		BioSpec 70/30 horizontal animal scanner
Needle Holder with Suture Cutter	Fine Science Tools	12002-14
Nylon filament	Doccol	701912PK5Re
Recovery cage with heating pad
Sirgical scissors	Fine Science Tools	91401-12
Small vessel cauterizer kit	Fine Science Tools	18000-00
Stereomicroscope and cold light	Leica	M60
Suture tying forceps	Fine Science Tools	18025-10
Thermostat, rectal probe and mouse pad	Letica Science Instruments	LE 13206
Vannas spring scissors (4mm cutting edge)	Fine Science Tools	15019-10
Vascular clamps	Fine Science Tools	00396-01