Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Makale, gastropod Crepidula fornicata'nın larva kültürü için yöntemleri küçük hacimli laboratuvar ölçekli bir sistemde ve sahada konuşlandırılabilen bir ortam-deniz suyu mezokozm sisteminde sunmaktadır.

Özet

Calyptraeid gastropod yumuşakçası, Crepidula fornicata, larva gelişim biyolojisi, fizyolojisi ve ekolojisi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu türün kuluçkadaki veliger larvaları, erginler tarafından doğal olarak salındıktan sonra bir elek üzerine sifonlanarak toplanmış, 200/L yoğunlukta kültüre dağıtılmış ve 1 x 105 hücre/mL'de Isochrysis galbana (suş T-ISO) ile beslenmiştir. Ortam havasına veya tanımlanmış atmosferik gaz karışımlarına dengeleme için tasarlanmış havalandırmalı 800 mL kültürlerde yetiştirilen kardeş larvalar için kabuk büyümesi ve metamorfoz için yeterlilik kazanılması belgelenmiştir. Bu laboratuvar kültürü koşullarının aksine; Üreme yetişkinlerinden oluşan bir tarla popülasyonunda bulunan 15 L'lik akışlı bir ortam deniz suyu mezokozmunda yetiştirilen larvalar için de büyüme ve yeterlilik verileri toplanmıştır. Laboratuvar kültürlerinde metamorfik yeterliliğin büyüme oranları ve zamanlaması, daha önce yayınlanmış çalışmalarda bildirilenlere benzerdi. Mezokozm tarlasında yetiştirilen larvalar, herhangi bir laboratuvar çalışması için bildirilenden çok daha hızlı büyüdü ve daha erken metamorfoza uğradı. Birlikte, bu yöntemler, laboratuvarda önceden belirlenmiş kontrollü koşullar altında ve tarlada doğal olarak oluşan koşullar altında larva gelişimini araştırmak için uygundur.

Giriş

Terlik limpeti, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), gelişimsel bir model olarak faydası ve istilacı bir tür olarak yaygın etkileri nedeniyle güncel ve tarihsel araştırma literatüründe iyi temsil edilmektedir. Deneysel embriyolojinin klasik çağındaspiral gelişimin temel bir örneği olarak hizmet etti 1 ve lophotrochozoan erken gelişim 2,3 mekanizmalarını incelemek için modern görüntüleme ve genomik araçların uygulanmasıyla yeniden bir ilgi doğuşu yaşadı. Yaşam tarihinin diğer ucunda, diğer araştırmalar, bu ekosistem mühendisinin yetişkin popülasyonlarının, doğu Kuzey Amerika'daki orijinal dağılımından çok uzakta olan ılıman kıyı deniz ortamlarındaki etkilerine odaklanmıştır 4,5. Embriyo ve yetişkin arasında, bu türün veliger larvaları, larva gelişimi ve ekolojisi, özellikle büyümeyi etkileyen faktörler ve metamorfoz için yeterlilik kazanılması, larva yerleşimine aracılık eden iç ve dış ipuçları ve larva deneyiminin gençlik performansı üzerindeki etkileri hakkında çok sayıda çalışmanın konusu olmuştur 6,7,8,9,10,11 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, C. fornicata'nın larvalarının ve yavrularının okyanus asitlenmesine karşı direncini ortaya koymuştur, bu da bu hayvanın üretken araştırma kullanımı için başka bir yol 12,13,14,15,16.

Deniz larva biyolojisi çalışmaları için C. fornicata'nın bir avantajı, kamçılı Isochrysis galbana'nın tek algal bir diyetinde doğal veya yapay deniz suyunda laboratuvarda yetiştirilmesinin nispeten kolay olmasıdır. Kültür yöntemleri, yazar tarafından daha önceki yöntem odaklı bir basılı yayında detaylandırılmıştır17. Mevcut katkının nedenleri iki yönlüdür. Birincisi, kültürlerin kurulması ve bakımıyla ilgili rutin fiziksel manevralar kavramsal olarak çok basittir, ancak uygulamalı veya video gösterimi olmadan doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi zordur. İkinci olarak, daha önce açıklanan kültür yöntemlerinde, özellikle okyanus asitlenmesi, ötrofikasyon ve oksijen tükenmesi gibi çevresel stres faktörlerine verilen tepkilerin laboratuvar ve saha çalışmaları için uygun olan iki varyasyon tanımlanmıştır. Bunlardan ilki, küçük hacimlerde kabarcıklı gazlar aracılığıyla deniz suyundaki pH ve çözünmüş oksijenin manipülasyonu için uygun düşük hacimli (800 mL) bir kültür sistemi, ikincisi ise sahaya yerleştirilebilen ve ortamdaki deniz suyunun serbest değişimine izin veren daha büyük hacimli (15 L) bir mezokozm sistemidir.

Protokol

1. C. fornicata'nın larva kültürlerinin kurulması ve sürdürülmesi için rutin manevralar

NOT: Bu yöntem, kuluçkalık veliger larvalarını yeni salmış yetişkin C. fornicata içeren bir galon (3,8 L) kavanoz deniz suyu ile başlar. Yetişkinler sahada toplanabilir veya Malzeme Tablosunda verilen bir tedarikçiden temin edilebilir. Yetişkinler, çiftleşme yığınlarında yaşayan ve yığının dibinde sapsız kuluçka dişileri olan protandrous hermafroditlerdir. Yetişkin yığınlarını parçalamayın. Üremenin mevsimselliği ve yetişkinlerin mevsim dışı yumurtlama için şartlandırılma yöntemleri daha önce tanımlanmıştır17. Larvalar en iyi şekilde serbest bırakıldıktan sonra 2-3 saat içinde, güçlü bir şekilde jeonegatif olduklarında ve kavanozun yüzeyine yakın yoğunlaştıklarında toplanır.

  1. 400 mL'lik üç köşeli tek kullanımlık plastik beherin altını keserek ve 236 μm naylon ağlı bir panele yapıştırarak bir elek yapın. Bu amaçla ve özellikle mezokozm yapımı için (aşağıda), polietilene iyi yapışma için formüle edilmiş sıcakta eriyen bir yapıştırıcı kullanın.
  2. Yetişkin kavanozunun havasını alın ve 15-20 dakika bekletin, böylece döküntüler çöker ve larvalar yüzeye kolayca yüzebilir.
  3. Larvaları, 60-80 cm uzunluğundaki yumuşak plastik akvaryum borusunun ucuna yapıştırılmış kısa bir uzunlukta (15-20 cm) 5 mm'lik cam borudan geçirin, yukarıdaki gibi hazırlanan elek içine süzülün, böylece 600 mL'lik bir cam beherde asılı kalın, böylece fazla deniz suyu cam beherden taşar ve larvalar elek üzerinde tutulur. Elek dibini su altında tutun ve larvaların kıvrılmasını önleyin.
  4. Süzgeci beherden kısa bir süre kaldırın ve larvaları düşük güçlü bir diseksiyon mikroskobu altında manipüle etmek için uygun boyutta bir cam FSW kasesine durulamak için bir fışkırtma şişesi filtrelenmiş deniz suyu (FSW) kullanın.
    NOT: C. fornicata larvaları, 30 ppt tuzluluğa yakın filtrelenmiş doğal deniz suyunda veya 20-25 °C'de 32 ppt. tuzluluğa kadar yapılan Instant Ocean yapay deniz suyundagelişir 17,18. < 1 μm'de filtrasyon, laboratuvar kültürlerinde sorunlara neden olabilecek kirlenme epizootik protistlerini ortadan kaldırmak için yeterlidir.
  5. İstenilen sayıda larvayı bir Pasteur pipeti kullanarak bir kültür kavanozuna manuel olarak aktarın ve sayın. En iyi sonuçlar için, C. fornicata'ya 1 larva / 5 mL kültür hacmi kullanın. Larvaları sayın ve sayıları tahmin etme cazibesinden kaçının.
  6. Kültür başlatıldığında larvaları istenen mikroalg rasyonu ile besleyin ve kültür suyu değiştirildiğinde mikroalgleri gün aşırı değiştirin.
    NOT: 1 x 105 hücre / mL Isochrysis galbana (T-ISO suşu) diyeti, maksimuma yakın laboratuvar büyüme oranları sağlayan iyi bir standart diyettir. T-ISO kültürü için gıda rasyonu ve yöntemleri daha önceki bir yayındaverilmiştir 17.
  7. Yukarıdaki adım 1.3'te olduğu gibi, kültürün içeriğini bir beher içindeki bir elek içine dökerek kültür suyunu her gün değiştirin. Süzgeci kaldırın ve larvaları yeni yiyeceklerle taze FSW içeren bir kültür kavanozuna durulamak için bir fışkırtma şişesi FSW kullanın.
    NOT: En iyi uygulama, larva kültürü için kullanılan herhangi bir cam malzemeyi ayırmak ve bu cam eşyanın fiksatifler, çözünür ağır metal tuzları veya deterjanlarla herhangi bir temasını önlemektir. Rutin temizlik en iyi şekilde bir kabartma tozu macunu (NaHCO3) ve bir naylon ovma pedi ile yapılırken, mineral birikintileri beyaz sirke veya seyreltik HCl içinde hafif asitli bir yıkama ile çıkarılabilir.

2. C. fornicata larvaları için havalandırmalı kültürlerin yapımı

NOT: Önerilen cam kavanoz (Malzeme Tablosu), deniz suyuna karşı inert olan ve havalandırma gazı akışı için boru diken girişlerini sabitlemek için doğru kalınlığa sahip bir polipropilen kapağa sahiptir.

  1. Her bir kültür kavanozunun kapağına (kapağın iç astarı dahil), her biri kenardan yaklaşık 5 cm uzakta ve birbirinin karşısında 1.5 mm'lik iki delik açın. (13/64 inç emperyal veya # 7 ASME standart makinist matkap ucu da uygun bir boşluk deliği açacaktır).
  2. Boru dikeni kapağın dış yüzeyinde olacak şekilde 10-32 naylon somun kullanarak her deliğe 1/8 inç x 10-32 dişli naylon boru adaptörü takın.
  3. Boru adaptörlerinden birinin dişli iç kısmının açıklığına bir miktar silikon kauçuk akvaryum sızdırmazlık maddesi uygulayın ve 20 cm uzunluğunda 2 mm (dış çap) polietilen boruyu içeriden açıklıktan itin, böylece dış açıklığın birkaç mm dışına çıkıntı yapar.
  4. Borunun sonunda, boru dikeninden çıkıntı yapan küçük bir akvaryum sızdırmazlık maddesi tapası olacaktır, ancak dikenin ucunun hemen ötesinde şeffaf boru görünecektir. Sızdırmazlık maddesinin sertleşmesine izin verin, ardından polietilen borunun çıkıntılı ucunu, boru dikeninin ucuyla aynı hizada olacak şekilde kesin.
  5. Kültür kavanozunu, kavanozun üst kısmındaki omzun 1 cm yakınına kadar FSW ile doldurun, kapağı vidalayın ve havalandırma havasını veya deneysel gaz karışımı beslemesini polietilen havalandırma borusunu tutan boru dikenine takın. Havalandırma borusunun uzunluğunu, ucu kavanozun dibinde düzgün bir şekilde duracak şekilde kesin.
  6. Yavaş bir kabarcık akışı elde etmek için havalandırma havası veya gaz karışımının akışını ayarlayın (Şekil 1). Ortam havası ile havalandırma sağlamak için ortak akvaryum çete valflerine sahip bir akvaryum hava pompası kullanın veya diğer deneysel atmosferik gaz karışımları için kütle akış kontrolörleri kullanın14.

3. C. fornicata larvaları için sahada konuşlandırılabilir bir mezokozm kültürünün inşası

  1. Standart 7 galonluk polietilen kovanın yanlarında her biri 25 cm x 14,5 cm olan 4 eşit aralıklı dikdörtgen açıklık kesin. Her açıklığın altını kovanın iç tabanından yaklaşık 3.5 cm uzağa yerleştirin (Şekil 2A). İnce dişli bıçaklı el tipi bir elektrikli kılıç testeresi bu amaç için idealdir. Kesilen atık parçalarını saklayın ve bir masa testeresi ile uzunlamasına 2 cm genişliğinde şeritler halinde dilimleyin.
  2. Kovadaki kesme açıklıklarını rahatça üst üste gelecek şekilde (en az 2 cm) sağlamak için her biri en az 30 cm x 20 cm boyutlarında 236 μm naylon ağdan 4 panel kesin. Bir ağ panelinin bir kenarını, küçük yaylı kelepçeler veya mandallar kullanarak oyuğunun uzun bir kenarı üzerine geçici olarak sabitleyin.
  3. Kafes panelin kenarını, polietilen için formüle edilmiş sıcakta eriyen yapıştırıcı ile kova açıklığına yapıştırın. İlk kenar sabitlendikten sonra, ağ panelinde gergin bir yüzey elde etmek için gerginliği korurken diğer kenarları yapıştırın.
  4. Ağ panellerinin kova açıklıklarıyla örtüştüğü yapıştırılmış alanı düzgün bir şekilde kaplayacak takviye şeritleri yapmak için kova atık parçalarının şeritlerinin uzunluklarını kesin. Yapıştırıcı sertleşmeden önce her bir şeridi yerine oturtmak için hızlı bir şekilde çalışarak, her bir kaplama şeridini bol miktarda sıcakta eriyen yapıştırıcı ile yerine bastırın.
  5. Her şeridin ucunu, kovanın dışından takılan bir naylon kör perçin ile sabitleyin. Takviye şeritlerinin dış kenarlarından fazla yapıştırıcıyı ve ağı bir maket tıraş bıçağıyla kesin.
    NOT: Her perçin için 15/64 inçlik bir pilot delik gerekir. Perçinlerin iç (kör) kısımları, Şekil 2B'de bitmiş mezokozmun iç kısmında görülebilir.
  6. Mezokozmi, kovanın üst kısmını suyun oldukça üzerinde tutan yüzer bir rafa yerleştirin (Şekil 2C). Gösterilen yüzer raf, 2 inçlik Schedule 40 PVC borunun 30 cm'lik segmentlerinden yapılmıştır, 4 kopya mezokozmun bir sırasını tutabilen hava geçirmez bir yapı oluşturmak için dirsek ve tee bağlantıları ile birlikte çimentoludur.
  7. Yerel koşullara bağlı olarak, ağ panelleri 1-2 gün içinde deniz suyunun mezokozm yoluyla değişimini engelleyecek şekilde kirlenebilir. Bu meydana geldiği ölçüde, kirlenmiş mezokozmu 2/3 oranındasudan çekerek ve 2 L'lik bir sürahi ile dibinden taze mezokozmosa tekrar tekrar baltalayarak larvaları taze temiz bir mezokozme aktarın.
  8. Larvaların çoğunu transfer etmek için veya kirlenmiş mezokozmosta larvalar artık gözlenmeyene kadar 20-25 yineleme gerçekleştirin. Ağ panellerini kabartma tozu (NaHCO3) macunu ile doldurulmuş yumuşak bir süngerle nazikçe ovalayarak kirlenmiş mezokozmu temizleyin ve musluk suyuyla durulayın.

Sonuçlar

Larva büyümesi ve metamorfoz için yeterlilik kazanımı, her biri 160 larva içeren, tek bir yumurta kütlesinden yumurtadan çıkan ve 1 x 105 hücre / mL yoğunlukta Isochrysis galbana ile beslenen bir kardeş larva grubundan türetilen 800 mL ventilasyonlu kültürün 4 eşzamanlı kopyasında ölçülmüştür. PH 7.9-8.0, sıcaklık 20-21 °C ve tuzluluk 30-31 ppt idi. Büyüme ve metamorfoz, Buzzards Bay, MA, ABD'de laboratuvar kültürleriyle benzer pH, sıcaklık ve tuzluluk koşulları alt...

Tartışmalar

C. fornicata larvalarının kültüre alınması diğer planktotrofik deniz larvalarına kıyasla nispeten daha kolay olmasına rağmen, iyi kültür uygulamalarının temellerine dikkat etmek hala önemlidir17,19. Sağlıklı larvalar yumurtadan çıktıktan hemen sonra beslenmeye başlamalıdır. Bu, yumurtadan çıktıktan sonraki gün, transillüminasyonlu bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, alg hücreleriyle dolu bağırsaklarını gözlemleyerek ...

Açıklamalar

Bildirilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Düşük hacimli ventilasyonlu kültür sisteminin ilk gelişimi, kısmen Ulusal Bilim Vakfı (CRI-OA-1416690'dan Dickinson College'a) tarafından desteklenmiştir. Dr. Lauren Mullineaux, bu sistem için sunulan verilerin toplandığı Woods Hole Oşinografi Enstitüsü'nde laboratuvar olanakları sağladı (Şekil 4).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Bucket, Polyethylene, 7 gallonUS Plastic16916for mesocosm
Crepidula fornicataMarine Biological Laboratory, Marine Resources Center760adult broodstock
Hotmelt glue, Infinity Supertac 500Hotmelt.comINFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LBgood for bonding polyethylene
Jar, glass, 32 oz, with polypropylene lidUlineS-19316P-Wfor 800 mL ventilated cultures
Nitex mesh, 236 µmDynamic Aqua Supply Ltd.NTX236-136for mesocosm
Nut, hex, nylon, 10-32 threadHome Depot1004554441for fastening tubing barbs
Rivets, nylon, blind, 15/64" diameter, 5/32"-5/16" grip range, pack of 8NAPA auto partsBK 66528444 packs needed per mesocosm
Tubing barb 1/8" x 10-32 threadUS Plastic655932 needed per culture jar
Tubing, polyethylene, 2.08 mm ODFisher Scientific14-170-11Gfor ventilating gas stream inside culture jar
Tubing, Tygon, 1/8"x3/16"x1/32"US Plastic57810fits barbs for ventilating cultures

Referanslar

  1. Conklin, E. G. The embryology of Crepidula: a contribution to the cell lineage and early development of some marine gastropods. Gasteropods. , (1897).
  2. Henry, J. J., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula: an emerging lophotrochozoan model system. Biol Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
  3. Lyons, D. C., Henry, J. Q. Slipper snail tales: how Crepidula fornicata and Crepidula atrasolea became model molluscs. Curr Top Dev Biol. 147, 375-399 (2022).
  4. Blanchard, M. Spread of the slipper limpet Crepidula fornicata (L. 1758) in Europe. Current state and consequences. ScientiaMarina. 61 (Suppl 2), 109-118 (1997).
  5. Beninger, P., Valdizan, A., Decottigies, P., Cognie, B. Field reproductive dynamics of the invasive slipper limpet, Crepidula fornicata. J Exp Mar Biol Ecol. 390 (2), 179-187 (2010).
  6. Pechenik, J. A. The relationship between temperature, growth rate, and duration of planktonic life for larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 74 (3), 241-257 (1984).
  7. Pechenik, J. A. Latent effects: surprising consequences of embryonic and larval experience on life after metamorphosis. Evol Ecol Marine Invertebrate Larvae. , 208-225 (2018).
  8. Pechenik, J. A., Gee, C. C. Onset of metamorphic competence in larvae of the gastropod Crepidula fornicata (L.), judged by a natural and an artificial cue. J Exp Mar Biol Ecol. 167 (1), 59-72 (1993).
  9. Taris, M., Comtet, T., Viard, F. Inhibitory function of nitric oxide on the onset of metamorphosis in competent larvae of Crepidula fornicata: A transcriptional perspective. Mar Genomics. 2 (3-4), 161-167 (2009).
  10. Penniman, J. R., Doll, M. K., Pires, A. Neural correlates of settlement in veliger larvae of the gastropod, Crepidula fornicata. Invertebrate Biol. 132 (1), 14-26 (2013).
  11. Meyer-Kaiser, K. S. Carryover effects of brooding conditions on larvae in the slipper limpet Crepidula fornicata. Mar Ecol Prog Ser. 643, 87-97 (2020).
  12. Noisette, F., et al. Does encapsulation protect embryos from the effects of ocean acidification? The example of Crepidula fornicata. PLoS One. 9 (3), e93021 (2014).
  13. Kriefall, N. G., Pechenik, J. A., Pires, A., Davies, S. W. Resilience of Atlantic slippersnail Crepidula fornicata larvae in the face of severe coastal acidification. Front in Mar Sci. 5, 312 (2018).
  14. Bogan, S. N., McMahon, J. B., Pechenik, J. A., Pires, A. Legacy of multiple stressors: Responses of gastropod larvae and juveniles to ocean acidification and nutrition. Biol Bull. 236 (3), 159-173 (2019).
  15. Pechenik, J. A., et al. Impact of ocean acidification on growth, onset of competence, and perception of cues for metamorphosis in larvae of the slippershell snail, Crepidula fornicata. Mar Biol. 166, 128 (2019).
  16. Reyes, C. L., et al. The marine gastropod Crepidula fornicata remains resilient to ocean acidification across two life history stages. Front Physiol. 12, 702864 (2021).
  17. Pires, A. Artificial seawater culture of the gastropod Crepidula fornicata for studies of larval settlement and metamorphosis. In: Carroll, D., Stricker, S. (eds) Developmental biology of the sea urchin and other marine invertebrates. Methods Mol Biol. 1128, 35-44 (2014).
  18. Bashevkin, S. M., Pechenik, J. A. The interactive influence of temperature and salinity on larval and juvenile growth in the gastropod Crepidula fornicata (L.). J Exp Mar Biol Ecol. 470, 78-91 (2015).
  19. Strathmann, M. F. . Reproduction and Development of Marine Invertebrates of the Northern Pacific Coast: Data and Methods for the Study of Eggs, Embryos, and Larvae. , (1987).
  20. Clark, H. R., Gobler, C. J. Diurnal fluctuations in CO2 and dissolved oxygen concentrations do not provide a refuge from hypoxia and acidification for early-life-stage bivalves. Mar Ecol Prog Ser. 558, 43114 (2016).
  21. Gobler, C. J., Baumann, H. Hypoxia and acidification in ocean ecosystems: coupled dynamics and effects on marine life. Biol Lett. 12 (5), 20150976 (2016).
  22. Pechenik, J. A., Hilbish, T. J., Eyster, L. S., Marshall, D. Relationship between larval and juvenile growth rates in two marine gastropods, Crepidula plana and C. fornicata. Mar Biol. 125, 119-127 (1996).
  23. Padilla, D. K., McCann, M. J., McCarty Glenn, M., Hooks, A. P., Shumway, S. E. Effect of food on metamorphic competence in the model system Crepidula fornicata. Biol Bull. 227 (3), 242-251 (2014).
  24. Wallace, R. B., Baumann, H., Grear, J. S., Aller, R. C., Gobler, C. J. Coastal ocean acidification: the other eutrophication problem. Estuarine, Coast Shelf Sci. 148, 1-13 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Crepidula fornicataTerlik LimpetiLarva Geli imiVeliger LarvalarLaboratuvar K lt rTarla K lt rB y me H zMetamorfozzokriz GalbanaMezokozm

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır