Лабораторная и полевая культура личинок башмачка Crepidula fornicata

Резюме

В статье представлены методы культивирования личинок брюхоногих моллюсков Crepidula fornicata в малообъемной лабораторной системе и в системе мезокосма окружающей среды и морской воды, которые могут быть развернуты в полевых условиях.

Аннотация

Брюхоногий моллюск Crepidula fornicata широко используется для изучения биологии, физиологии и экологии развития личинок. Выводковые личинки велигера этого вида собирали путем сифона на сито после естественного выпуска взрослыми особями, распределяли по культуре в плотности 200/л и скармливали Isochrysis galbana (штамм T-ISO) в концентрации 1 x 10⁵ клеток/мл. Рост скорлупы и приобретение способности к метаморфозу были задокументированы у личинок братьев и сестер, выращенных в вентилируемых культурах объемом 800 мл, предназначенных для уравновешивания с окружающим воздухом или определенными атмосферными газовыми смесями. В отличие от этих лабораторных условий культивирования; Данные о росте и компетентности также были собраны для личинок, выращенных в проточном мезокосме морской воды объемом 15 л, расположенном в полевой популяции репродуктивных взрослых особей. Темпы роста и сроки метаморфической компетентности в лабораторных культурах были аналогичны тем, о которых сообщалось в ранее опубликованных исследованиях. Личинки, выращенные в полевых условиях, росли гораздо быстрее и метаморфизировались раньше, чем сообщалось о каких-либо лабораторных исследованиях. В совокупности эти методы подходят для изучения развития личинок в заранее определенных контролируемых условиях в лаборатории, а также в естественных условиях в полевых условиях.

Введение

Тапочка, Crepidula fornicata (Gastropoda: Calyptraeidae), широко представлена в современной и исторической исследовательской литературе из-за ее полезности в качестве модели развития и из-за ее широкого воздействия в качестве инвазивного вида. Она послужила основополагающим примером спирального развития в классическую эпоху экспериментальной эмбриологии^{1 и} пережила возрождение интереса с применением современных инструментов визуализации и геномики для анализа механизмов раннего развития лофотрохозоидов ^2,3. С другой стороны, другие исследования были сосредоточены на воздействии взрослых популяций этого экосистемного инженера в умеренной прибрежной морской среде, удаленной от его первоначального распространения в восточной части^{Северной Америки.} В промежутке между эмбрионом и взрослой особью, личинки велигера этого вида были предметом многочисленных исследований развития личинок и экологии, особенно факторов, влияющих на рост и приобретение способности к метаморфозу, внутренних и внешних сигналов, опосредующих заселение личинок, и влияния личиночного опыта на производительность молоди 6,7,8,9,10,11 . Недавние исследования выявили устойчивость личинок и молоди C. fornicata к закислению океана, что является еще одним направлением продуктивного использования этого животного в научных исследованиях 12,13,14,15,16.

Преимущество C. fornicata для изучения биологии морских личинок заключается в том, что его относительно легко выращивать в лаборатории в естественной или искусственной морской воде на одножгутиковой диете жгутиконосца Isochrysis galbana. Методы культивирования были подробно описаны автором в более ранней печатной публикации, ориентированной на^{методы17}. Причины такого взноса двояки. Во-первых, рутинные физические маневры, связанные с созданием культур и заботой о них, концептуально очень просты, но их трудно правильно выполнить без практической или видеодемонстрации. Во-вторых, описаны два варианта ранее описанных методов культивирования, которые особенно подходят для лабораторных и полевых исследований реакций на стрессоры окружающей среды, такие как закисление океана, эвтрофикация и истощение кислорода. Первая из них представляет собой малообъемную (800 мл) культуральную систему, подходящую для манипулирования pH и растворенным кислородом в морской воде с помощью небольших объемов пузырьковых газов, а вторая представляет собой мезокосмическую систему большего объема (15 л), которая может быть размещена в полевых условиях и обеспечивает свободный обмен окружающей морской водой.

протокол

1. Рутинные маневры по созданию и поддержанию личиночных культур C. fornicata

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод начинается с галлона (3,8 л) банки морской воды, содержащей взрослых особей C. fornicata , которые только что выпустили выведенных личинок велигера. Взрослые особи могут быть собраны в полевых условиях или получены от поставщика, указанного в Таблице материалов. Взрослые особи — это протандровые гермафродиты, которые живут в брачных стаях с сидячими самками на дне стаи. Не разбивайте стопки для взрослых. Сезонность воспроизводства и методы подготовки взрослых особей к нересту вне сезона были описаны ранее¹⁷. Личинки лучше всего собирать в течение 2-3 часов после выпуска, когда они сильно геонегативны и будут концентрироваться у поверхности банки.

1. Сделайте сито, отрезав дно от трехугольного одноразового пластикового стакана объемом 400 мл и приклеив панель из нейлоновой сетки 236 мкм. Для этой цели и особенно для строительства мезокосма (ниже) используйте клей-расплав, разработанный для хорошей адгезии к полиэтилену.
2. Снимите аэрацию со взрослой банки и дайте ей постоять 15-20 минут, чтобы мусор остыл и личинки смогли легко выплыть на поверхность.
3. Откачайте личинок через короткую (15-20 см) стеклянную трубку диаметром 5 мм, прикрепленную к концу мягкой пластиковой трубки для аквариума длиной 60-80 см, в сито, приготовленное выше, подвешенное в стеклянном стакане объемом 600 мл таким образом, чтобы избыток морской воды переполнял стеклянный стакан, в то время как личинки задерживались на сите. Держите дно сита под водой и избегайте выбрасывания личинок на берег.
4. Ненадолго выньте сито из стакана и используйте бутылку с фильтрованной морской водой (FSW), чтобы промыть личинки в стеклянную миску с FSW, которая имеет удобный размер для манипуляций под маломощным препарирующим микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки C. fornicata процветают в фильтрованной природной морской воде с соленостью около 30 ppt или искусственной морской воде Instant Ocean, полученной до 32 ppt, при 20-25 °C^17,18. Фильтрация на уровне < 1 мкм достаточна для устранения обрастающих эпизоотических протистов, которые могут вызывать проблемы в лабораторных культурах.
5. Вручную перенесите и подсчитайте нужное количество личинок в банку для культивирования с помощью пипетки Пастера. Для достижения наилучших результатов используйте 1 личинку/5 мл объема культуры для C. fornicata. Посчитайте личинки и избегайте соблазна оценить численность.
6. Кормите личинок нужным рационом микроводорослей при начале культивирования и через день заменяйте микроводоросли при подмене воды для культивирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диета из 1 x 10⁵ клеток/мл Isochrysis galbana (штамм T-ISO) является хорошей стандартной диетой, которая обеспечивает почти максимальные лабораторные темпы роста. Рацион питания и методы культивирования T-ISO приведены в одной из предыдущих публикаций¹⁷.
7. Меняйте воду для культуры через день, высыпая содержимое культуры в сито внутри стакана, как в шаге 1.3 выше. Поднимите сито и используйте флакон с распылением FSW, чтобы промыть личинки в банке для культивирования свежего FSW с новым кормом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшей практикой является разделение любой стеклянной посуды, используемой для выращивания личинок, и избегание любого контакта этой стеклянной посуды с фиксаторами, растворимыми солями тяжелых металлов или моющими средствами. Обычную чистку лучше всего проводить с помощью пасты из пищевой соды (NaHCO₃) и нейлоновой губки для чистки, в то время как минеральные отложения можно удалить с помощью умеренной кислотной стирки в белом уксусе или разбавленного HCl.

2. Строительство вентилируемых культур для личинок C. fornicata

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая стеклянная банка (Таблица материалов) имеет полипропиленовую крышку, которая инертна к морской воде и имеет подходящую толщину для крепления входных отверстий трубки для потока вентиляционного газа.

1. Просверлите два отверстия по 5 мм в крышке каждой банки для культуры (включая внутренний вкладыш крышки), каждое примерно в 1,5 см от края и напротив друг друга. (Сверло 13/64 дюйма дюймового дюйма или сверло стандарта ASME #7 ASME также сделает соответствующее отверстие с зазором).
2. Установите адаптер нейлоновой трубки с резьбой 1/8 дюйма x 10-32 в каждое отверстие с помощью нейлоновой гайки 10-32 с заусенцем трубки на внешней поверхности крышки.
3. Нанесите каплю силиконового резинового герметика для аквариума на отверстие резьбовой внутренней части одного из адаптеров трубки и протолкните полиэтиленовую трубку длиной 20 см длиной 20 мм (внешний диаметр) через отверстие изнутри так, чтобы она выступала на несколько мм за внешнее отверстие заусенца трубки.
4. Теперь трубка будет иметь небольшую пробку из аквариумного герметика на конце, которая выступает через заусеницу трубки, но прозрачная трубка будет видна сразу за концом заусенца. Дайте герметику застыть, затем обрежьте выступающий конец полиэтиленовой трубки так, чтобы он был заподлицо с концом заусенца трубки.
5. Заполните банку для культур FSW на расстоянии не менее 1 см от плеча в верхней части банки, закрутите крышку и прикрепите подачу вентиляционного воздуха или экспериментальной газовой смеси к штуцеру трубки, на котором находится полиэтиленовая вентиляционная трубка. Обрежьте длину вентиляционной трубки так, чтобы ее конец лежал аккуратно на дне банки.
6. Отрегулируйте поток вентиляционного воздуха или газовой смеси, чтобы получить медленный поток пузырьков (Рисунок 1). Используйте аквариумный воздушный насос с общими для аквариума клапанами для подачи вентиляции окружающим воздухом или используйте регуляторы массового расхода для других экспериментальных атмосферных газовых смесей¹⁴.

3. Создание пригодной для развертывания в полевых условиях мезокосмической культуры для личинок C. fornicata

1. Вырежьте 4 равномерно расположенных прямоугольных отверстия, каждое размером 25 см x 14,5 см, по бокам стандартного 7-галлонного полиэтиленового ведра. Расположите дно каждого отверстия примерно в 3,5 см от внутреннего дна ведра (рисунок 2A). Для этой цели идеально подходит ручная электрическая сабельная пила с мелкозубчатым лезвием. Сохраните вырезанные отходы и нарежьте их вдоль на полоски шириной 2 см с помощью настольной пилы.
2. Вырежьте 4 панели из нейлоновой сетки 236 мкм, каждая размером не менее 30 см х 20 см, чтобы удобно перекрывать (не менее чем на 2 см) вырезные отверстия в ведре. Временно закрепите один край сетчатой панели над длинным краем ее выреза с помощью небольших пружинных зажимов или прищепок.
3. Край сетчатой панели приклейте к отверстию ведра термоплавким клеем, который предназначен для полиэтилена. После того, как первый край будет закреплен, приклейте другие края, сохраняя натяжение, чтобы получить тугую поверхность на сетчатой панели.
4. Обрежьте длину полос отходов ведра из шага 3.1, чтобы сделать армирующие полосы, чтобы аккуратно покрыть склеенный участок, где сетчатые панели перекрывают отверстия ведра. Прижмите каждую покрывающую полосу к месту с обильным количеством клея-расплава, быстро работая над тем, чтобы каждая полоса была на месте, прежде чем клей затвердеет.
5. Закрепите конец каждой полосы с помощью нейлоновой заклепки, установленной с внешней стороны ведра. Обрежьте излишки клея и сетки с внешних краев усиливающих полос с помощью канцелярского бритвенного ножа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой заклепки требуется направляющее отверстие 15/64 дюйма. Внутренние (глухие) части заклепок видны на внутренней стороне готового мезокосма на рисунке 2В.
6. Разверните мезокосм в плавающей стойке, которая удерживает верхнюю часть ведра над водой (рисунок 2C). Плавающая стойка, которая показана, изготовлена из 30-сантиметровых сегментов 2-дюймовой трубы из ПВХ Schedule 40, сцементированных вместе с коленами и тройниками для создания герметичной конструкции, которая может удерживать ряд из 4 повторяющихся мезокосмов.
7. В зависимости от местных условий, сетчатые панели могут загрязниться в течение 1-2 дней, что затруднит обмен морской воды через мезокосм. В той мере, в какой это происходит, перенесите личинки в свежий чистый мезокосм, вытащив загрязненный мезокосм на 2/^{3 из воды} и многократно вычерпывая его со дна в свежий мезокосм с помощью кувшина объемом 2 л.
8. Выполните 20-25 итераций для переноса большей части личинок, или до тех пор, пока личинки не перестанут наблюдаться в загрязненном мезокосме. Очистите загрязненные мезокосмы, аккуратно почистив сетчатые панели мягкой губкой, загруженной пастой из пищевой соды (NaHCO₃) и промойте водопроводной водой.

Результаты

Рост личинок и приобретение способности к метаморфозу измеряли в 4 одновременных репликациях культур объемом 800 мл, каждая из которых содержала 160 личинок, полученных из родственной партии личинок, которые вылупились из одной яичной массы и которых кормили Isochrysis galbana с плотностью 1 ...

Обсуждение

Несмотря на то, что личинки C. fornicata относительно легко поддаются культивированию по сравнению с другими планктотрофными морскими личинками, внимание к основам надлежащей практики культивирования по-прежнему имеет важное значение^17,19. Здоровые личи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bucket, Polyethylene, 7 gallon	US Plastic	16916	for mesocosm
Crepidula fornicata	Marine Biological Laboratory, Marine Resources Center	760	adult broodstock
Hotmelt glue, Infinity Supertac 500	Hotmelt.com	INFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB	good for bonding polyethylene
Jar, glass, 32 oz, with polypropylene lid	Uline	S-19316P-W	for 800 mL ventilated cultures
Nitex mesh, 236 µm	Dynamic Aqua Supply Ltd.	NTX236-136	for mesocosm
Nut, hex, nylon, 10-32 thread	Home Depot	1004554441	for fastening tubing barbs
Rivets, nylon, blind, 15/64" diameter, 5/32"-5/16" grip range, pack of 8	NAPA auto parts	BK 6652844	4 packs needed per mesocosm
Tubing barb 1/8" x 10-32 thread	US Plastic	65593	2 needed per culture jar
Tubing, polyethylene, 2.08 mm OD	Fisher Scientific	14-170-11G	for ventilating gas stream inside culture jar
Tubing, Tygon, 1/8"x3/16"x1/32"	US Plastic	57810	fits barbs for ventilating cultures