Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

Özet

Burada, fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesine izin veren bir platformu tarif ediyoruz. İş akışı, birincil karaciğer hücrelerinden sferoidlerin üretilmesinden fare gözüne transplantasyona ve konfokal mikroskopi ile hücresel çözünürlükte in vivo görüntülemeye kadar uzanır.

Özet

Memelilerde karaciğer ile ilgili biyomedikal çalışmalar, hücresel çözünürlükte in vivo noninvaziv uzunlamasına görüntüleme yöntemlerinin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Şimdiye kadar, karaciğerin yerinde optik görüntülemesi, hücresel düzeyde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sunan ancak birden çok kez ve dolayısıyla aynı hayvanda uzunlamasına gerçekleştirilemeyen intravital görüntüleme ile mümkündü. Biyolüminesans gibi invaziv olmayan görüntüleme yöntemleri, aynı hayvan üzerinde tekrarlanan görüntüleme seanslarına izin verir, ancak hücre çözünürlüğü elde etmez. Bu metodoloji boşluğunu gidermek için, fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesi için bir platform geliştirdik. Bu çalışmada açıklanan iş akışında, birincil fare karaciğer sferoidleri in vitro olarak üretilir ve alıcı farelerin gözünün ön odasına nakledilir ve burada iris üzerine aşılanırlar. Kornea, konvansiyonel konfokal mikroskopi ile aşılanmış sferoidleri görüntüleyebileceğimiz doğal bir vücut penceresi görevi görür. Sferoidler gözde aylarca hayatta kalır, bu süre zarfında hücreler sağlık ve hastalık bağlamlarında incelenebilir ve uygun floresan problar kullanılarak tekrarlanan görüntüleme seansları boyunca farklı uyaranlara yanıt olarak izlenebilir. Bu protokolde, bu görüntüleme sistemini uygulamak için gerekli adımların bir dökümünü sunuyor ve potansiyelinden en iyi şekilde nasıl yararlanılacağını açıklıyoruz.

Giriş

Memelilerde sağlık ve hastalık sırasında karaciğer fonksiyonunun izlenmesi, yüksek çözünürlüklü, noninvaziv in vivo görüntüleme tekniklerinin eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Bu organın görselleştirilmesi, erişilemeyen konumu tarafından engellenir ve hücresel süreçleri bir araya getirmek için, in vivo çalışmalar, farklı zaman noktalarında hayvanların kurban edilmesine dayanır. Bu görüntüleme sınırlamasını aşmak için, birçok çalışma, karaciğer benzeri mikro dokuların kontrollü bir ortamda görselleştirildiği ve incelendiği in vitro modellere dayanır.

Son yıllarda, karaciğer sferoidleri gibi üç boyutlu kültür sistemlerinin geliştirilmesi, karaciğer araştırmalarına yardımcı olmuş ve ilerletmiştir. Karaciğer sferoidleri, karaciğer dokusunun mikro çevresini ve karmaşık hücre-hücre etkileşimlerini bir dereceye kadar taklit eden çok hücreli agregatlardır¹ ve geleneksel tek katmanlı kültürlere göre açık avantajlar sunar ^2,3. Karaciğer sferoidleri ayrıca farklı karaciğer hastalıkları için model olarak kullanılmaktadır ^4,5,6 ve hastalık mekanizmalarını anlamada etkili olmuştur. Yine de, mevcut in vitro karaciğer modellerinin temel sınırlamaları, fizyolojik bir in vivo ortamın olmaması ve kültürde sınırlı kullanım süresidir (yaklaşık 20 gün)³. Karaciğer sferoidleri daha önce in vivo olarak, optik görüntüleme için erişilemeyen böbrek kapsülü⁷ veya intraperitoneal⁸ gibi farklı bölgelere nakledilmiştir. İntravital karaciğer görüntüleme, hücre çözünürlüğünde gerçek zamanlı görüntüleme sunan son teknoloji bir tekniktir. Şu anda, bu in situ karaciğer görüntülemesi yalnızca oldukça invaziv ve sıklıkla terminal⁹ olan dış organda mümkündür. Abdominal bir pencerenin takılması, tekrarlanan karaciğer görüntüleme seanslarına izin verse de, karmaşık cerrahi ve bakım sonrası bakım gerektirir.

Hücresel çözünürlükte uzunlamasına izleme yapmak için, karaciğer sferoidlerinin, karaciğer benzeri dokunun fizyolojik bir ortamda aşılandığı, vücut uyaranlarına bağlı olduğu ve optik görüntüleme için erişilebilir olduğu farelerin gözün ön odasına (ACE) naklini araştırdık. Kornea şeffaf bir dokudur ve iris üzerine aşılanan mikro dokuların konfokal mikroskopi ile non-invaziv ve uzunlamasına görüntülenebildiği bir pencere görevi görür. Burada, karaciğer sferoidlerinin 10 in vivo görüntülenmesi için bu yeni geliştirilen platformun bir iş akışını sunuyoruz. Bu protokol, (1) birincil fare karaciğer hücrelerinin ekstraksiyonu ve karaciğer sferoidlerinin in vitro oluşumu, (2) karaciğer sferoidlerinin alıcı farelerin ACE'sine nakli ve (3) anestezi uygulanmış farelerde aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi. Ayrıca, bu görüntüleme platformunun bazı olanaklarını ve uygulamalarını sergileyeceğiz.

Protokol

Hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler Karolinska Enstitüsü'ndeki Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylandı.

1. Birincil fare karaciğer hücrelerinin ekstraksiyonu ve in vitro karaciğer sferoidlerinin üretilmesi

1. Hazırlık
   1. Kanülasyon, karaciğer rezeksiyonu ve birincil karaciğer hücrelerinin izolasyonu için, serolojik pipetlere ve santrifüj tüplerine ek olarak aşağıdaki steril veya tek kullanımlık malzemeleri hazırlayın (Şekil 1A): peristaltik pompa, döner kovalı santrifüj, emici ped, diseksiyon matı, iki kavisli uçlu forseps, cerrahi makas, bir adet 27 G kelebek iğne, bir adet 70 μm hücre süzgeci, bir adet hücre kaldırıcı, bir adet 100 mm Petri kabı, hücre sayma odası ve 96 Kuyulu, U şeklinde tabanlı mikroplakalar.
   2. Karaciğer perfüzyonunda, primer karaciğer hücrelerinin izolasyonunda ve karaciğer sferoidlerinin oluşturulmasında kullanılan solüsyonları Tablo 1'de listelendiği gibi hazırlayın.
      NOT: Sindirim tamponu ve Gradyan çözeltisi taze olarak hazırlanmalıdır.
   3. 42 °C su banyosundan karaciğere solüsyon ileten peristaltik bir pompadan oluşan perfüzyon sistemini kurun (Şekil 1A). Su banyosunun daha yüksek sıcaklığı, tamponların karaciğere 37 ° C'lik optimum sıcaklıkta ulaşmasını sağlar. Bunu tüp uzunluğuna ve oda sıcaklığına (RT) bağlı olarak özelleştirin.
   4. Kanülasyon için tüpün ucuna 27 G'lık bir kelebek iğne takın. Son izolasyon adımlarında kullanılan kaplama ortamını 4 °C'de tutun.
2. Prosedür
   1. Aşağıdaki çözeltileri 42 ° C'lik su banyosunda 50 mL santrifüj tüplerinde önceden ısıtın: 40 mL PBS, 20 mL perfüzyon tamponu ve 12 mL sindirim tamponu.
   2. Pompa borularını temizlemek ve ısıtmak için, önceden ısıtılmış PBS'den yaklaşık 20 mL dolaştırın.
   3. Tüpü perfüzyon tamponuna değiştirin, tüpü ve kelebek iğneyi astarlayın ve akış hızını 4 mL / dk'ya ayarlayın. Protokol boyunca tampon değişiklikleri sırasında boruda kabarcık olmadığından emin olun.
   4. Fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın ve uzuvları diseksiyon tahtasına sabitlemek için iğneler kullanın.
   5. Karın kürkünü% 70 etanol ile ıslatın ve sindirim organlarına erişmek için inceleyin.
   6. Portal ven ve inferior vena kava'yı ortaya çıkarmak için bağırsakları sağa hareket ettirin (Şekil 1B).
   7. İğne yatay konumdayken vena kava'yı uzunluğunun yaklaşık yarısında kanüle edin, sabit olduğundan emin olun ve pompayı çalıştırın.
   8. Karaciğer şişmeye başladığında veya daha yakın loblarda beyaz noktalar göründüğünde, kanın ve perfüzyon tamponunun dışarı akmasını sağlamak için portal veni kesin.
   9. Karaciğer hemen ağartmaya başlamalıdır. Portal veni 5 s aralıklarla klemplemek için kavisli forseps kullanarak temizlemeyi teşvik edin.
   10. Karaciğer sarı olana ve kandan temizlenene kadar (yaklaşık 15-20 mL perfüzyon tamponu) adım 1.2.9'u tekrarlayın.
   11. Hortumu sindirim tamponuna değiştirmek için peristaltik pompayı durdurun ve pompayı yeniden başlatın. Sindirim tamponu karaciğere ulaştığında, akış hızını 2,5 mL / dk'ya düşürün.
       NOT: Sindirim tamponundaki fenol kırmızısı, karaciğere gelişini ayırt etmeye izin verir ve tedavi sırasında pompa parametrelerinin ayarlanmasını sağlar.
   12. Tamponun tüm karaciğer loblarına ulaşmasını teşvik etmek ve uygun sindirimi sağlamak için adım 1.2.9'u birkaç kez tekrarlayın.
   13. Sindirim tamponu tükendiğinde veya karaciğer yeterince sindirilmiş göründüğünde peristaltik pompanın akışını durdurun.
       NOT: Sindirim derecesi, karaciğer loblarını forseps ile nazikçe sıkıştırarak ve doku üzerinde küçük izler olup olmadığını kontrol ederek görsel olarak izlenebilir. Karaciğer de dayanıksız hale gelecektir.
   14. Karaciğeri çıkarmak için, karın boşluğu içindeki karaciğer bağlarını ve bağlantılarını kesin, tamamen çıkarmayı hedefleyin ve 10 mL soğuk kaplama ortamı içeren Petri kabına yerleştirin (Tablo 1).
   15. Safra kesesini çıkardıktan sonra, hepatik kapsülü hafifçe yırtarak forseps kullanarak loblar üzerinde küçük tutamlar yapın. Karaciğeri tabakta sallayarak, hücrelerin ortama döküldüğünü gözlemleyin.
   16. Karaciğeri forseps ile sabit tutarak, hücreleri serbest bırakmak için hücre kaldırıcıyı loblar boyunca yavaşça sürükleyin.
       NOT: Doğru interlobüler sindirim, doku parçalarında değil, ortamda hücre süspansiyonuna yol açacaktır.
   17. Serolojik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu Petri kabından toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 70 μm hücre süzgecinden süzün. Sindirilmiş karaciğer hücrelerinin kabını yıkamak ve bunları filtreye aktarmak için taze kaplama ortamı kullanın.
   18. Hücreleri peletlemek için 50 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
   19. Hücre peletini kaplamak için yaklaşık 1 mL bırakarak süpernatanı çıkarın, hücreleri yeniden süspanse etmek için tüpü döndürün ve ardından yavaş yavaş 10 mL soğuk kaplama ortamı ekleyin.
   20. 10 mL gradyan çözeltisini hücre süspansiyonuna ekleyin ve tüpü 10 kez hafifçe ters çevirin.
   21. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
   22. Pelet, hepatositler için zenginleştirilmiş canlı karaciğer hücreleri içerirken, süpernatant ölü hücreler ve döküntüler içerir. Süpernatanı serolojik bir pipet kullanarak, yaklaşık 1 mL bırakarak atın ve peleti hafifçe döndürerek yeniden süspanse edin.
   23. Hücre süspansiyonuna 20 mL soğuk kaplama ortamı ekleyin ve gradyan çözeltisini yıkamak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 50 x g'da santrifüjleyin.
   24. Peletin üzerinde yaklaşık 1 mL bırakarak süpernatanı çıkarın ve hücreleri 20 mL soğuk kaplama ortamında yeniden süspanse edin.
       NOT: Burada, hücre peleti sıkıştırılabilir, bu nedenle gerekirse, hücreleri nazikçe ayırmak için 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanın.
   25. Bir hücre sayma odası ve Tripan Blue kullanarak hücre sayısını ve canlılığını manuel olarak belirleyin.
       NOT: Hepatosit hücreleri tüpte hızla çökelir; Bunları yeniden askıya almak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin.
   26. Karaciğer hücrelerini 200 μL / kuyu kaplama ortamında 1200 hücre / kuyuda 96 oyuklu ultra düşük yapışma plakalarına tohumlayın.
       NOT: Oyuk başına en uygun ortam hacmi 200 μL'dir; bununla birlikte, hücreleri 100 μL / kuyuda tohumlamak mümkündür.
   27. Hücreleri kuyucukların merkezinde toplamak için plakaları 200 x g'da 3 dakika döndürün.
   28. Hücreleri inkübe edin (37 °C, %5 CO₂) ve 5 gün boyunca doğal olarak sferoid oluşturmaya bırakın (Şekil 1C).
   29. 5. günde, kuyudaki ortamın yarısını dikkatlice çıkarın ve serumsuz bakım ortamıyla değiştirin (Tablo 1). Karaciğer sferoidlerinin nakledilmeye hazır olduğu 10. güne kadar her 48 saatte bir bu adımı tekrarlayın.
       NOT: Kültürlenmiş karaciğer sferoidlerinde kapsül benzeri bir yapının oluşumu, iyi bir agregasyon ve canlılık gösterir.

2. Karaciğer sferoidlerinin gözün ön kamarasına nakli (ACE)

1. Hazırlık
   1. Karaciğer sferoidlerinin ACE'ye nakli için aşağıdaki kaynakları düzenlediğinizden emin olun (Şekil 2A): stereomikroskop, izofluran anestezi ünitesi, indüksiyon odası, izofluran, ısıtma yastığı, ısmarlama metal taban plakası, fare kafası tutucusu ve gaz maskesi, katı üniversal mafsala bağlı forseps, Hamilton 500 μL dişli dalgıç şırınga, silikon, polietilen ve pompa boruları, ısmarlama künt cam kanül veya 24 G kateter, etanol %70, steril tuzlu su, steril 23 G iğneler, göz merhemi (1:1 oranında sıvı parafin ve vazelin), tek kullanımlık 1 mL şırınga ve hücre süspansiyon kabı 35 mm.
   2. Hamilton şırıngasını, hortumunu ve kanülünü %70 etanol ve tuzlu su geçirerek temizleyin.
   3. Hamilton şırıngasını, hortumunu ve cam kanülünü tuzlu su ile doldurun ve Hamilton şırıngasını bantla yatay konumda tezgaha sabitleyin (Şekil 2A).
   4. Özel yapım künt bir cam kanül kullanın.
      1. Kürelerin aspirasyonuna izin vermek için çift kademeli bir mikropipet çektirme kullanarak bir borosilikat cam kılcal damarı >300 μm'lik bir iç çapa kadar uzatın.
      2. Bir mikroelektrot çevirici kullanarak ucu eğin ve köreltin ve kenarları yumuşatmak için kanül ucunu birkaç saniye aleve maruz bırakın.
         NOT: Mikroelektrot düzenleyici, manuel olarak çalıştırılan dönen bir zımpara taşından oluşur; bu nedenle, belirli ayarlar geçerli değildir.
   5. Alternatif olarak, 24 G'lik bir kateterin plastik kısmını kullanarak bir kanül oluşturun (Şekil 2B).
   6. Anestezi izofluran ünitesini hazırlayın ve ısıtma yastığını 37 °C'ye ısıtın.
   7. Katı üniversal bağlantıya tutturulmuş forsepslerin uçlarını, gözü stabilize etmeye yardımcı olan bir halka oluşturmak için bir parça polietilen boru ile örtün.
   8. Karaciğer sferoidlerini 96 oyuklu plakadan bir pipet ve 200 μL uç kullanarak bakım ortamıyla birlikte 35 mm'lik bir hücre süspansiyon kabına aktarın.
2. Prosedür
   1. % 2.5 izofluran ve 280 mL / dak hava dozu kullanarak fareyi indüksiyon odasında uyuşturun.
   2. Fare bilinçsiz olduğunda, anesteziyi% 1.8 izofluran ve 280 mL / dak havaya düşürün, anestezi tüpünü baş tutucuya bağlayın ve burnu baş tutucunun içine yerleştirerek hayvanı hızlı bir şekilde ısıtma yastığına aktarın.
   3. Kafayı vidalarla hareketsiz hale getirin, gözü yavaşça soketten çıkarın ve forseps ile sabitleyin ve kurumasını önlemek için her iki göze bir damla tuzlu su damlatın.
   4. Stereoskopun altında, karaciğer sferoidlerini kanülün ucuna aspire etmek ve toplamak için Hamilton şırıngasını kullanın ve temiz bir yüzeyde yatay olarak dinlenmeye bırakın.
      NOT: Karaciğer sferoidleri ile birlikte aspire edilmesi, kanül duvarlarına yapışmalarını önlemeye yardımcı olur.
   5. 23 G'lik bir iğne kullanarak korneayı dikkatlice delin ve sızan sulu mizahı bir mendille kurulayın. Gerekirse, kesiği daha geniş hale getirmek için, korneayı dilimlemek için iğneyi dikkatlice yana doğru kaydırın.
      NOT: Kornea ponksiyonunu gerçekleştirmek için tek kullanımlık steril bir iğne kullanılır, bu nedenle kornea insizyondan önce dezenfekte edilmez.
   6. Kurumasını önlemek için göze tuzlu su damlaları ekleyin.
   7. Karaciğer sferoidlerini içeren kanülü alın ve sferoidlerin kanülün ucuna doğru çekilmesini sağlamak için dikey olarak tutun.
   8. Kanülü yavaşça deliğe yerleştirin ve eğim göz bebeğine doğru yönlendirilmiş durumdayken, karaciğer sferoidlerini yavaşça ACE'ye atmak için Hamilton şırıngasını kullanın (Şekil 2C).
      NOT: Kanülü çıkarmadan önce, gözün içindeki ve dışındaki sıvı basınçlarının yeniden ayarlanması için birkaç saniye beklenmesi ve sferoidlerin gözden geri kaçmasını önlemeniz önerilir.
   9. Korneanın dışından, kanülün ucuyla korneayı nazikçe iterek karaciğer sferoidlerini göz bebeğinin etrafına ve insizyondan uzağa yerleştirin (Şekil 2C).
   10. Gözü forsepsten serbest bırakmadan önce karaciğer sferoidlerinin iris üzerine yerleşmesi için ~ 5-10 dakika bekleyin.
   11. Ameliyat edilen göze vazelin göz merhemi sürün, bu da korneanın kayganlaşmasına ve iyileşmesine yardımcı olur.
   12. İstenirse, aynı yöntemi izleyerek ikinci gözü de çalıştırmaya devam edin.
   13. Fareyi uyandırmadan önce, ameliyat sonrası rahatsızlığı önlemek için bir analjezik uygulayın, örneğin, deri altından uygulanan steril salin içinde 0.1 mg / kg buprenorfin.
       NOT: Farelere sadece bir doz analjezik uygulandı, çünkü bu küçük prosedürden hızlı bir şekilde iyileştiler ve herhangi bir ağrı veya davranış değişikliği belirtisi göstermediler. Bu prosedür çok hızlı olduğundan (10 dakikadan az sürer) ve sadece küçük bir rahatsızlığa neden olduğundan, fareler, hayvanı uyandırmadan önce uygulanan ameliyat sonrası analjezi dışında ameliyat sonrası bakıma ihtiyaç duymaz.

3. ACE'de aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

1. Hazırlık
   1. ACE'de aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesi için aşağıdaki malzemeleri ve aletleri hazırlayın (Şekil 3A): dik konfokal mikroskop, uzun çalışma mesafeli su daldırma objektifi, izofluran anestezi ünitesi, indüksiyon odası, izofluran, ısıtma yastığı, ısmarlama metal taban plakası, fare kafası tutucusu ve gaz maskesi, katı üniversal ekleme bağlı forseps, yapay gözyaşı jeli, göz merhemi (1:1 oranında sıvı parafin ve vazelin).
   2. İsteğe bağlı malzemeler arasında enjekte edilebilir floresan problar, tek kullanımlık şırıngalar ve kuyruk intravenöz enjeksiyonu için 27 G iğneler bulunur.
2. Prosedür
   1. % 2.5 izofluran ve 280 mL / dak hava dozu kullanarak fareyi indüksiyon odasında uyuşturun.
   2. Fare bilinçsiz olduğunda, anesteziyi% 1.8 izofluran ve 280 mL / dak havaya düşürün, anestezi tüpünü baş tutucuya bağlayın ve burnu baş tutucunun içine yerleştirerek hayvanı hızlı bir şekilde ısıtma yastığına aktarın.
   3. Vidaları kullanarak kafayı kafa tutucuda hareketsiz hale getirin.
   4. Kurumasını önlemek için her iki gözünüze bir damla suni gözyaşı jeli damlatın.
   5. Bu noktada, kuyruk damarından intravenöz olarak floresan problar enjekte edin ve hemen ardından görüntü alın.
   6. Başı eğin, gözü yavaşça yuvadan çıkarın ve forseps ile sabitleyin ve hedefin altındaki yerine yerleştirin.
   7. Kornea ile objektif arasındaki boşluğu doldurmak için bol miktarda suni gözyaşı jeli uygulayın ve göz merceği aracılığıyla karaciğer sferoidlerine odaklanın.
      NOT: Mümkünse, büyütülmemiş görüş elde etmek ve iris üzerindeki sferoidleri daha kolay bulmak için oküler çubuklardan birinin göz merceğini çıkarın.
   8. Hayvanın solunum hareketlerine rağmen yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için 25x objektif ve aşağıdaki görüntüleme ayarlarını kullanın: 512 x 512 piksel format, 600 Hz tarama hızı ve 3 μm Z yığını kalınlığı. Tablo 2'deki ayrıntılı görüntüleme ayarlarına bakın.
      NOT: Görüntüleme boyunca, sığ, kontrollü bir solunum ritmi elde etmek ve böylece hayvanın hareketini en aza indirmek için anestezi konsantrasyonu 1.6-2.2 mL / s izofluran arasında ayarlanır.
   9. Görüntüleme seansının sonunda, izofluranı çıkarmadan ve hayvanı uyandırmadan önce görüntülenen gözleri vazelin göz merhemi ile tedavi edin.

Tartışmalar

Bu protokol, ACE içine aşılanmış karaciğer sferoidlerinin intraoküler in vivo görüntülenmesi için yeni bir platformu tanımlamaktadır. ACE daha önce pankreas adacıkları^11,12 gibi diğer organ kaynaklı mikro dokuların nakil bölgesi olarak kullanılmıştır^, çünkü benzersiz aşılama mikro çevresi, damarlar, sinirler ve oksijen açısından zengin olması ve kornea yoluyla görüntülemeye erişimi vardır. İntravital karaciğer görüntüleme, hücrelerin ve süreçlerin yerinde görüntülenmesini sağlarken, uzunlamasına izleme mümkün değildir. Karın penceresinden karaciğer görüntülemesi karmaşık cerrahi gerektirir ve organın vücut içindeki hareketi zaman içinde tek hücreli izlemeyi zorlaştırır. Bu nedenle, bu yeni görüntüleme yöntemi, karaciğer hücrelerinin tek hücre çözünürlüğünde invaziv olmayan, uzunlamasına izlenmesini sağlar.

Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır. Birincisi, Charni-Natan ve ^ark.13'ten uyarlanan iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu yoluyla primer hepatositlerin izolasyonudur, tek fark, karaciğer perfüzyonunu anestezi uygulanmış canlı hayvanlar yerine ölü fare üzerinde gerçekleştirmemizdir. Bu varyasyon, daha az etik husus ve organizmada anestezi kalıntısından kaçınma gibi bazı avantajlar getirir. Bu çalışmada, izolasyonun hepatositle zenginleştirilmiş fraksiyonundan karaciğer sferoidleri üretiyoruz, ancak bu, çeşitli bileşimlere sahip kokültür sferoidleri yapmak için diğer özel protokolleri kullanarak diğer parankimal olmayan hücre popülasyonlarını izole etme potansiyelini dışlamaz^14,15.

Bu protokolün ikinci kısmı, karaciğer sferoidlerinin alıcı farelerin ACE'sine nakledilmesini içerir. Bu, anestezi uygulanmış farelerde yapılan hızlı (10 dakikadan az) ve basit bir ameliyattır ve ameliyat sonrası herhangi bir tedavi gerektirmez. Kornea delinmesi kendi kendine kapanır ve 3-5 gün içinde iyileşir. Bazen, iyileşme sürecinde, kesi çevresinde bir miktar kirlenme gözlenir, ancak bu birkaç gün içinde düzelir. Ameliyat edilen hayvanların gözlerinde anterior sineşi vakası yaşamadık. Nakil işlemlerini temiz ama açık bir laboratuvarda ve ameliyat edilen gözlerde enfeksiyon sorunu olmadan gerçekleştiriyoruz. Sferoidlerin göze aşılanması ve aşılanması, alıcı hayvanın görüşünü tehlikeye atmaz veya davranışını değiştirmez. Bu protokolde hem transplantasyon cerrahisi hem de in vivo görüntüleme için farelerde iyi tolere edilen izofluran anestezisi kullanıyoruz. Doza bağımlı etkisi nedeniyle, prosedürler boyunca kolayca ayarlanabilir ve uyku ve uyanma sürelerini azaltma avantajını beraberinde getirir. Bununla birlikte, alternatif enjekte edilebilir anestezikler kullanılabilir. Transplantasyondan sonra, tedavi müdahaleleri ve in vivo görüntüleme yapmadan önce sferoidlerin tamamen aşılanması, vaskülarize olması ve innerve olması için genellikle 1 ay izin veriyoruz. Ayrıca insan karaciğer sferoidleri ve immün sistemi baskılanmış alıcı fareler kullanılarak transplantasyon ve aşılamanın mümkün olduğunu gösterdik¹⁰.

Bu yöntemin üçüncü kısmı, ACE'deki aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülemesidir. Bu protokol, araştırma görüntüleme tesislerinde yaygın olarak bulunan mikroskopi ekipmanını kullanan in vivo görüntüleme kurulumunu açıklar. Ayrıca, fare kafası tutucusu ve plastik kanül gibi özel malzemeler artık ticari olarak temin edilebilir. Bu görüntüleme kurulumuyla, lazer penetrasyon derinliğine ve floresan algılamaya bağlı olarak z-kesitlerini yakalayabiliyor ve küresel mimarinin üç boyutlu bir rekonstrüksiyonunu elde edebiliyoruz. Aşılanmış karaciğer sferoidlerinde hücresel fonksiyonun izlenmesi, hücre tipleri, hücresel fonksiyonlar ve dinamikler hakkında rapor veren floresan proteinlerin görselleştirilmesine dayanır. Bu nedenle, bu görüntüleme platformu, tek başına veya kombinasyon halinde farklı modaliteler kullanılarak kullanılabilir: (1) Floresan problar intravenöz olarak uygulanabilir, örneğin hücreleri etiketlemek ve izlemek için antikorlar ve ayrıca fonksiyonel boyalar; (2) Karaciğer sferoidleri, karaciğere özgü floresan proteinleri eksprese eden muhabir fare modellerinden izole edilen hücrelerden, örneğin hücre döngüsü dinamiklerini rapor eden FUCCI karaciğer sferoidlerinden üretilebilir; (3) Karaciğer sferoidlerinin oluşumu in vitro olarak, sferoidleri floresan proteinler ve biyosensörler ile donatmak için transfeksiyon veya transdüksiyon ile birleştirilebilir. örneğin, adeno ile ilişkili virüsler. Deneysel ortamlarımızda ve uyarma için tek bir foton kullanarak, elde edilmesi mümkün olan görüntüleme derinliği kabaca 60-100 μm'dir. Bununla birlikte, bu, lazer gücüne ve çoklu foton görüntüleme kullanılabilirliğine, floresan probu emisyon özelliklerine ve dedektörlerin hassasiyetine ve ayrıca sferoidin aşılandığı gözün açısına bağlıdır. Görüntüleme elde edildikten sonra, aşağı akış görüntü analizi, Image J ve Imis gibi popüler programlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Örneğin, FUCCI raportörü söz konusu olduğunda, yeşil renkli hücre döngüsü aktif hücreleri sayılabilir ve aşılanmış sferoid içindeki hücre döngüsü aktivitesini değerlendirmek için toplam kırmızı hücrelerin sayısıyla karşılaştırılabilir. Ek olarak, ACE görüntüleme platformu, grefti tedavi etmek ve reaksiyonunu izlemek için maddelerin göze uygulanmasına (göz damlası şeklinde) veya doğrudan ACE'ye enjekte edilmesine izin verir. Ölüm sonrası, nakledilen sferoidler manuel mikrodiseksiyon ile kolayca alınabilir ve immünofloresan boyama, transkriptomik analiz vb. gibi ex vivo tekniklerle değerli bilgiler ^{sağlayabilir.10}.

Bu tekniğin belirli sınırlamaları vardır. Birincisi, deneyimlerimize göre, alıcı farelerin albino olması, yani pigmentli olmayan irise sahip olması gerektiğidir. Aşılama üzerine, karaciğer sferoidleri, sferoidlerin canlılığını veya işlevini etkilemeyen, ancak iris hücrelerindeki pigment görüntülemeyi önleyen tek bir iris hücresi tabakası ile kaplanır. İkinci bir husus, anestezi uygulanmış farelerde göz içi görüntüleme sırasındaki stabilitedir. İn vivo görüntüleme seansları sırasında, hareketi en aza indirmek için hayvanın anestezi konsantrasyonu ve solunumu yakından izlenmelidir. Bununla birlikte, burada belirtilen görüntüleme ayarlarını kullanarak, tek hücre düzeyinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde edebiliyoruz.

Özetlemek gerekirse, bu protokol, farelerin gözlerine aşılanmış karaciğer benzeri dokunun noninvaziv bir in vivo görüntüleme platformunun uygulanmasını açıklar. Kolay prosedürler, ortak ekipman ve uygun fiyatlı malzemeler kullanıyoruz, bu da onu birçok araştırmacı için ulaşılabilir bir yaklaşım haline getiriyor. Bu model, temel araştırma ve klinik öncesi ortamlarda karaciğer fizyolojisi ve patolojisini incelemek için değerli bir platform oluşturmak için in vitro 3D karaciğer sferoidlerinin avantajlarını ACE tarafından sağlanan in vivo ortam ve optik erişilebilirlik ile birleştirir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G butterfly needle	Venofix	4056388
AAV8-CAG-GFP	Charles River	CV17169-AV9	Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation
Absolute and 70% ethanol	N/A	N/A
Absorbent pad	Attends	203903
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson	#003574 and #007914	Mice obtained from in-house breeding
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)	Jackson	#000058	Mice obtained from in-house breeding
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH	INFRAFRONTIER/EMMA	EM:08395	Mice obtained from in-house breeding
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in	BD Medical	381212
Borosillicate standard glass cappilaries	World Precision Instruments	1B150-4
Cell lifter	Corning	3008
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Custom-made metal plate	Hardware store	N/A
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	Model PC-100
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Electric heating pad	Hardware store	N/A
FBS	Gibco	N/A
GlutaMAX	Gibco	35050061
Green CMFDA	Abcam	ab145459	Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS
Hamilton syringe	Hamilton	81242	Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red	Gibco	14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective	Leica	N/A
HEPES	Gibco	15630080
Induction chamber 0.8 L	Univentor	8329001
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G)	Gibco	41400045
Isoflurane	Baxter	N/A
Lectin DyLight-649	Invitrogen	L32472	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Liberase TM Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001
Microelectrode beveler	World Precision Instruments	Model BV-10
Mouse head-holder and gas mask	Narshige	Model SGM-4
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Fisher	174929
Oculentum simplex	APL	N/A
PBS 10x	Gibco	14080055
PBS 1x; no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644
Peristaltic pump	Ismatec	Model ISM795
PharMed BPT Pump Tubing	VWR	VERN070540-07	Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm
pHrodo Red-LDL	Invitrogen	L34356	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing	Smiths Medical	800/100/140	Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm
Silicone dissection mat	Hardware store	N/A
Sodium chloride 0.9%	Braun	N/A
Solid Universal Joint	Narshige	Model UST-2
Stereomicroscope	Leica	Model M80
Suspension culture dish 35 mm	Sarstedt	833900500
Temgesic	Indivor	N/A	Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse
Translucent Silicone Tubing	VWR	228-1450	Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Univentor 400 Anesthesia unit	Univentor	8323001
Upright laser scanning confocal microscope	Leica	Model TCS SP5 II
Viscotears	Novartis	N/A
William's E Medium; no glutamine, phenol red	Gibco	22551089