Визуализация in vivo сфероидов печени, привитых в передней камере глаза мыши

Резюме

Здесь мы описываем платформу, которая позволяет неинвазивно визуализировать in vivo сфероиды печени, привитые в передней камере глаза мыши. Рабочий процесс охватывает от получения сфероидов из первичных клеток печени до трансплантации в глаз мыши и визуализации in vivo с клеточным разрешением с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

Биомедицинские исследования печени у млекопитающих затруднены отсутствием методов неинвазивной продольной визуализации in vivo с клеточным разрешением. До сих пор оптическая визуализация печени in situ возможна с помощью прижизненной визуализации, которая обеспечивает визуализацию с высоким разрешением на клеточном уровне, но не может быть выполнена несколько раз и, следовательно, продольно у одного и того же животного. Неинвазивные методы визуализации, такие как биолюминесценция, позволяют проводить повторные сеансы визуализации на одном и том же животном, но не достигают клеточного разрешения. Чтобы восполнить этот пробел в методологии, мы разработали платформу для неинвазивной визуализации in vivo сфероидов печени, привитых в передней камере глаза мыши. В рабочем процессе, описанном в этом исследовании, первичные сфероиды печени мыши генерируются in vitro и трансплантируются в переднюю камеру глаза мышей-реципиентов, где они приживаются на радужной оболочке. Роговица действует как естественное окно тела, через которое мы можем визуализировать привитые сфероиды с помощью обычной конфокальной микроскопии. Сфероиды выживают в глазу в течение нескольких месяцев, в течение которых клетки можно изучать в контексте здоровья и болезни, а также контролировать в ответ на различные стимулы в течение повторных сеансов визуализации с использованием соответствующих флуоресцентных зондов. В этом протоколе мы приводим разбивку необходимых шагов для внедрения этой системы визуализации и объясняем, как наилучшим образом использовать ее потенциал.

Введение

Мониторинг функции печени у млекопитающих во время здоровья и болезни ограничен отсутствием неинвазивных методов визуализации in vivo с высоким разрешением. Визуализация этого органа затруднена его недоступным местоположением, и для того, чтобы собрать воедино клеточные процессы, исследования in vivo полагаются на жертвоприношение животных в разные моменты времени. Чтобы обойти это ограничение визуализации, большая часть работы полагается на модели in vitro , в которых микроткани, похожие на печень, визуализируются и изучаются в контролируемой среде.

В последние годы развитие трехмерных систем культивирования, таких как сфероиды печени, помогло и продвинуло исследования печени. Сфероиды печени представляют собой многоклеточные агрегаты, которые в определенной степени имитируют микроокружение и сложные межклеточные взаимодействия ткани печени¹ и имеют явные преимущества по сравнению с традиционными монослойными культурами ^2,3. Сфероиды печени также используются в качестве моделей для различных заболеваний печени ^4,5,6 и играют важную роль в понимании механизмов заболевания. Тем не менее, ключевыми ограничениями существующих моделей печени in vitro являются отсутствие физиологической среды in vivo и ограниченное время использования в культуре (около 20 дней)³. Сфероиды печени ранее трансплантировались в различные места in vivo, например, под капсулу почки⁷ или внутрибрюшинно⁸, которые недоступны для оптической визуализации. Прижизненная визуализация печени — это современный метод, предлагающий визуализацию с клеточным разрешением в режиме реального времени. В настоящее время визуализация печени in situ возможна только на внешнем органе, который является высокоинвазивным и часто терминальным⁹. Хотя установка брюшного окна позволила бы проводить повторные сеансы визуализации печени, она влечет за собой сложную операцию и последующий уход.

Для проведения лонгитюдного мониторинга с клеточным разрешением мы исследовали трансплантацию сфероидов печени в переднюю камеру глаза (АПФ) мышей, где печеноподобная ткань приживается в физиологической среде, соединена со стимулами тела и доступна для оптической визуализации. Роговица представляет собой прозрачную ткань и действует как окно, через которое микроткани, привитые на радужной оболочке, могут быть визуализированы неинвазивно и продольно с помощью конфокальной микроскопии. Здесь мы представляем рабочий процесс этой недавно разработанной платформы для визуализации сфероидов печени in vivo ¹⁰. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по его реализации, разделенное на (1) экстракцию первичных клеток печени мыши и образование сфероидов печени in vitro , (2) трансплантацию сфероидов печени в АПФ мышей-реципиентов и (3) визуализацию in vivo привитых сфероидов печени у мышей, находящихся под наркозом. Кроме того, мы продемонстрируем некоторые возможности и области применения этой платформы визуализации.

протокол

Все процедуры, выполняемые на животных, были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Каролинского института.

1. Экстракция первичных клеток печени мыши и генерация сфероидов печени in vitro

1. Подготовка
   1. Для канюляции, резекции печени и выделения первичных клеток печени приготовьте следующие стерильные или одноразовые материалы в дополнение к серологическим пипеткам и центрифужным пробиркам (рис. 1A): перистальтический насос, центрифуга с качающимся ведром, абсорбирующая прокладка, коврик для препарирования, два щипца с изогнутым наконечником, хирургические ножницы, одна игла-бабочка 27 G, один клеточный фильтр 70 мкм, один клеточный подъемник, одна чашка Петри 100 мм, камера для подсчета клеток и 96-луночные микропланшеты с U-образным дном.
   2. Приготовьте растворы, используемые для перфузии печени, выделения первичных клеток печени и получения сфероидов печени, как указано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для разложения и раствор для градиента следует готовить свежими.
   3. Настройте перфузионную систему, состоящую из перистальтического насоса, который проводит растворы от водяной бани 42 °C к печени (рис. 1A). Более высокая температура водяной бани гарантирует, что буферы достигают печени при оптимальной температуре 37 °C. Настройте его в зависимости от длины трубки и температуры в помещении (RT).
   4. Для канюляции установите иглу-бабочку 27 G на конец трубки. Держите металлический материал, используемый на заключительных этапах изоляции, при температуре 4 °C.
2. Процедура
   1. Предварительно нагрейте следующие растворы на водяной бане при температуре 42 °C в центрифужных пробирках объемом 50 мл: 40 мл PBS, 20 мл буфера для перфузии и 12 мл буфера для разложения.
   2. Для очистки и нагрева трубок насоса циркулируйте около 20 мл предварительно нагретого PBS.
   3. Замените трубку на перфузионный буфер, загрунтуйте трубку и иглу-бабочку и установите скорость потока на 4 мл/мин. Убедитесь, что в трубке нет пузырьков во время замены буфера на протяжении всего протокола.
   4. Усыпьте мышь при вывихе шейки матки и с помощью игл прикрепите конечности к препарирующей доске.
   5. Намочите мех живота 70% этанолом и рассеките его, чтобы получить доступ к органам пищеварения.
   6. Сдвиньте кишечник вправо, чтобы обнажить воротную вену и нижнюю полую вену (рисунок 1B).
   7. Канюлируйте полую вену примерно на полпути ее длины с иглой в горизонтальном положении, убедитесь, что она устойчива, и запустите насос.
   8. Когда печень начинает раздуваться или появляются белые точки в более близких долях, перережьте воротную вену, чтобы позволить крови и перфузионному буферу вытечь.
   9. Печень должна немедленно начать бледнеть. Поощряйте очищение с помощью изогнутых щипцов для зажима воротной вены с интервалом в 5 с.
   10. Повторяйте шаг 1.2.9 до тех пор, пока печень не станет желтой и не очистится от крови (около 15-20 мл перфузионного буфера).
   11. Остановите перистальтический насос, чтобы заменить трубку на буфер для разложения, и перезапустите насос. Когда буфер для разложения достигнет печени, уменьшите скорость потока до 2,5 мл/мин.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Феноловый красный в буфере для пищеварения позволяет различать его поступление в печень и позволяет регулировать параметры насоса во время лечения.
   12. Чтобы стимулировать попадание буфера во все доли печени и обеспечить правильное пищеварение, повторите шаг 1.2.9 несколько раз.
   13. Остановите поток перистальтического насоса, когда буфер для пищеварения истощен или печень выглядит достаточно переваренной.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Степень пищеварения можно визуально контролировать, аккуратно зажимая доли печени щипцами и проверяя, не появляются ли на тканях небольшие отметины. Печень также станет хлипкой.
   14. Чтобы извлечь печень, разрежьте печеночные связки и соединения в брюшной полости, стремясь удалить ее полностью, и поместите ее в чашку Петри, содержащую 10 мл среды для холодного покрытия (табл. 1).
   15. После удаления желчного пузыря сделайте небольшие пощипки на мочках с помощью щипцов, слегка разрывая печеночную капсулу. Встряхивая печень в чашке, наблюдайте, как клетки выливаются в среду.
   16. Удерживая печень устойчиво щипцами, осторожно проведите клеточный подъемник по долям, чтобы освободить клетки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное междольковое пищеварение приведет к суспензии клеток в среде, а не фрагментов тканей.
   17. С помощью серологической пипетки соберите клеточную суспензию из чашки Петри и профильтруйте через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, помещенный в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Используйте свежий гальванический материал, чтобы вымыть чашку от переваренных клеток печени и перенести их на фильтр.
   18. Центрифугируйте при 50 x g в течение 5 мин при 4 °C для гранулирования клеток.
   19. Удалите надосадочную жидкость, оставив примерно 1 мл для покрытия клеточной гранулы, закрутите трубку, чтобы повторно суспендировать клетки, а затем постепенно добавьте 10 мл среды для холодного покрытия.
   20. Добавьте 10 мл градиентного раствора в клеточную суспензию и аккуратно переверните пробирку 10 раз.
   21. Центрифуга при 200 x g в течение 10 мин при 4 °C.
   22. Гранула содержит жизнеспособные клетки печени, обогащенные гепатоцитами, в то время как надосадочная жидкость содержит мертвые клетки и мусор. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, оставив примерно 1 мл, и повторно суспендируйте гранулу, осторожно поворачивая.
   23. Добавьте 20 мл среды для холодного покрытия в суспензию клеток и центрифугируйте при 50 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы смыть градиентный раствор.
   24. Удалите надосадочную жидкость, оставив примерно 1 мл над гранулой, и повторно суспендируйте клетки в 20 мл среды для холодного покрытия.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь клеточную гранулу можно уплотнить, поэтому при необходимости используйте серологическую пипетку объемом 10 мл, чтобы аккуратно диссоциировать клетки.
   25. Вручную определите количество клеток и жизнеспособность с помощью камеры для подсчета клеток и Trypan Blue.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки гепатоцитов быстро выпадают в осадок в трубе; Чтобы снова подвесить их, осторожно переверните трубку несколько раз.
   26. Засейте клетки печени в 200 мкл/лунку гальванической среды из расчета 1200 клеток/лунку в 96-луночные планшеты со сверхнизкой адгезией.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный объем среды на лунку составляет 200 μл; однако можно засеять клетки в 100 мкл/лунку.
   27. Вращайте пластины при 200 x g в течение 3 минут, чтобы собрать ячейки в центре лунок.
   28. Инкубируйте (37 °C, 5%_CO2) клетки и оставьте их для образования сфероидов на 5 дней естественным путем (рисунок 1C).
   29. На 5-й день осторожно удалите половину среды из лунки и замените ее бессывороточными питательными средами (Таблица 1). Повторяйте этот шаг каждые 48 ч до 10-го дня, когда сфероиды печени будут готовы к пересадке.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование капсулообразной структуры у культивируемых сфероидов печени показывает хорошую агрегацию и жизнеспособность.

2. Трансплантация сфероидов печени в переднюю камеру глаза (АПФ)

1. Подготовка
   1. Для пересадки сфероидов печени в АПФ необходимо обеспечить наличие следующих ресурсов (рис. 2A): стереомикроскоп, узел для анестезии изофлурана, индукционная камера, изофлуран, грелка, изготовленная на заказ металлическая опорная пластина, держатель головки мыши и противогаз, щипцы, прикрепленные к твердому универсальному шарниру, шприц с резьбовым плунжером Hamilton 500 μL, силикон, полиэтилен и трубка для помпы, изготовленная на заказ канюля из тупого стекла или катетер 24 G, этанол 70%, стерильный физиологический раствор, стерильные иглы 23 г, глазная мазь (жидкий парафин и вазелин в соотношении 1:1), одноразовый шприц 1 мл и чашка для клеточной суспензии 35 мм.
   2. Очистите шприц, трубку и канюлю Hamilton, пропустив 70% этанол и физиологический раствор.
   3. Наполните шприц, трубку и стеклянную канюлю Гамильтона физиологическим раствором и закрепите шприц Гамильтона на скамье в горизонтальном положении лентой (рисунок 2А).
   4. Используйте изготовленную на заказ канюлю из тупого стекла.
      1. Удлинить капилляр боросиликатного стекла с помощью двухступенчатого съемника микропипеток до внутреннего диаметра >300 мкм, чтобы обеспечить аспирацию сфероидов.
      2. Скосите и затупите наконечник с помощью микроэлектродного скоса и подвергните наконечник канюли воздействию пламени на несколько секунд, чтобы смягчить края.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Станок для снятия фаски с микроэлектродами состоит из вращающегося шлифовального камня, который управляется вручную; поэтому определенные настройки неприменимы.
   5. В качестве альтернативы можно сконструировать канюлю с помощью пластиковой части катетера 24 G (рисунок 2B).
   6. Подготовьте анестезиологический изофлуран и разогрейте грелку до 37 °C.
   7. Накройте кончики щипцов, прикрепленных к твердому универсальному шарниру, куском полиэтиленовой трубки, чтобы образовалась петля, которая помогает стабилизировать глаз.
   8. Перенесите сфероиды печени из 96-луночного планшета в 35-миллиметровую чашку для клеточной суспензии с поддерживающей средой с помощью пипетки и наконечника объемом 200 мкл.
2. Процедура
   1. Обезболить мышь в индукционной камере, используя дозу 2,5% изофлурана и 280 мл/мин воздуха.
   2. Когда мышь находится без сознания, снизьте анестезию до 1,8% изофлурана и 280 мл/мин воздуха, подсоедините анестезиологическую трубку к держателю головы и быстро переложите животное на грелку, расположив нос внутри держателя головы.
   3. Иммобилизуйте головку винтами, аккуратно вытащите глаз из глазницы, зафиксируйте его щипцами и капните каплю физраствора на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание.
   4. Под стереоскопом используйте шприц Гамильтона для аспирации и сбора сфероидов печени на кончике канюли и оставьте их горизонтально лежать на чистой поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирационная среда вместе со сфероидами печени помогает предотвратить их прилипание к стенкам канюли.
   5. Осторожно проколите роговицу иглой 23 G и высушите сочащуюся водянистую влагу салфеткой. При необходимости, чтобы сделать разрез шире, осторожно сдвиньте иглу в сторону, чтобы разрезать роговицу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения пункции роговицы используется одноразовая стерильная игла, поэтому роговица не дезинфицируется перед разрезом.
   6. Добавьте в глаза капли солевого раствора, чтобы избежать высыхания.
   7. Возьмите канюлю, содержащую сфероиды печени, и держите ее вертикально, чтобы сфероиды могли тяготеть к кончику канюли.
   8. Осторожно вставьте канюлю в отверстие и, направив скос к зрачку, с помощью шприца Гамильтона медленно вытолкните сфероиды печени в АПФ (рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед удалением канюли рекомендуется подождать несколько секунд, пока давление жидкости внутри и снаружи глаза не отрегулируется, и избежать выхода сфероидов обратно из глаза.
   9. Снаружи роговицы расположите сфероиды печени вокруг зрачка и подальше от разреза, осторожно проталкивая роговицу кончиком канюли (рис. 2C).
   10. Подождите ~5-10 минут, пока сфероиды печени осядут на радужную оболочку, прежде чем освободить глаз от щипцов.
   11. Нанесите на прооперированный глаз вазелиновую глазную мазь, которая помогает смазать и заживить роговицу.
   12. При желании приступайте к операции на втором глазу, следуя тому же методу.
   13. Перед пробуждением мыши введите обезболивающее средство, чтобы избежать послеоперационного дискомфорта, например, 0,1 мг/кг бупренорфина в стерильном физрастворе, вводимом подкожно.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам была введена только одна доза анальгетиков, так как они быстро восстановились после этой небольшой процедуры и не показали никаких признаков боли или изменения поведения. Поскольку эта процедура очень быстрая (занимает менее 10 минут) и вызывает лишь незначительный дискомфорт, мыши не нуждаются в послеоперационном уходе, кроме послеоперационной анальгезии, проводимой перед пробуждением животного.

3. Визуализация in vivo привитых сфероидов печени в АПФ

1. Подготовка
   1. Подготовить следующие материалы и инструменты для неинвазивной визуализации in vivo сфероидов печени, привитых в АПФ (рис. 3А): вертикальный конфокальный микроскоп, объектив для погружения в воду на большом рабочем расстоянии, узел для анестезии изофлураном, индукционная камера, изофлуран, грелка, изготовленная на заказ металлическая опорная пластина, держатель головы мыши и противогаз, щипцы, прикрепленные к твердому универсальному шарниру, гель искусственной слезы, глазная мазь (жидкий парафин и вазелин в соотношении 1:1).
   2. Дополнительные материалы включают инъекционные флуоресцентные зонды, одноразовые шприцы и иглы 27 G для внутривенной инъекции хвоста.
2. Процедура
   1. Обезболить мышь в индукционной камере, используя дозу 2,5% изофлурана и 280 мл/мин воздуха.
   2. Когда мышь находится без сознания, снизьте анестезию до 1,8% изофлурана и 280 мл/мин воздуха, подсоедините анестезиологическую трубку к держателю головы и быстро переложите животное на грелку, расположив нос внутри держателя головы.
   3. Иммобилизуйте головку в держателе головы с помощью винтов.
   4. Нанесите каплю искусственного слезного геля на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание.
   5. На этом этапе внутривенно введите флуоресцентные зонды через хвостовую вену и сразу после этого сделайте снимок.
   6. Наклоните голову, аккуратно вытащите глаз из глазницы и закрепите его щипцами в положение под объективом.
   7. Нанесите большое количество искусственного слезного геля, чтобы заполнить пространство между роговицей и объективом, и сосредоточьтесь на сфероидах печени через окуляр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, снимите окуляр одного из окуляров, чтобы получить неувеличенное зрение и легче найти сфероиды на радужной оболочке.
   8. Чтобы получить изображение с высоким разрешением, несмотря на дыхательные движения животного, используйте объективы с 25-кратным увеличением и следующие настройки изображения: формат 512 x 512 пикселей, скорость сканирования 600 Гц и толщина Z-стека 3 мкм. Подробные настройки изображения см. в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей визуализации концентрация анестезии регулируется от 1,6-2,2 мл/ч изофлурана для достижения неглубокого, контролируемого ритма дыхания и, таким образом, минимизации движений животного.
   9. В конце сеанса визуализации обработайте изображенные глаза вазелиновой глазной мазью, прежде чем удалить изофлуран и разбудить животное.

Результаты

Первичные клетки печени, обогащенные гепатоцитами, были выделены из печени мыши с помощью двухступенчатой перфузии коллагеназы с использованием перистальтического насоса для циркуляции теплых буферов через печень, используя сосудистую сеть органа для доставки ферментов диссоциации ко всем клеткам (рис. 1A). Для этого нижняя полая вена была канюлирована, а воротная вена была разрезана, чтобы обеспечить протекание буферов (рис. 1B). Сначала буфер на основе HBSS промывался через печень, чтобы очистить кровь. Если канюляция прошла успешно и тромбов нет, печень бледнеет и становится желтой в течение нескольких секунд. Во-вторых, буфер для пищеварения, содержащий смесь ферментов либеразы, циркулировал через печень для диссоциации ткани в одноклеточную суспензию. Клетки были подсчитаны вручную и помещены в 96-луночные планшеты со сверхнизкой адгезией (ULA), которые позволяют самособираться в сфероиды в течение нескольких дней. На 5-й день формируются сфероиды, а тонкая капсула, окаймляющая сфероиды, свидетельствует об успешной агрегации (рис. 1В). Мы ждем до 10-го дня трансплантации, после чего сфероиды компактны и развивают прочные межклеточные связи. Количество засеянных клеток на лунку определяло размер сфероида печени с диаметром 1000, 1200 и 1500 клеток на хорошо дающий сфероид 238 мкм ± 10 мкм, 248 мкм ± 17 мкм и диаметром 298 мкм ± 19 мкм (среднее значение ± SD) соответственно (рис. 1C, D). Для трансплантации мы отбираем сфероиды диаметром около 250 мкм по следующим причинам: (1) размер сфероидов не должен быть слишком большим, чтобы избежать гипоксии и некротического ядра, но должен содержать достаточно клеток для поддержания межклеточных коммуникаций и ремоделирования трансплантата в глазу, (2) вес сфероидов такого размера позволяет им тяготеть к радужной оболочке и улучшать их приживление, (3) Этот размер подходит для пересадки 5-10 сфероидов на глаз мыши.

Для операции по трансплантации требуется шприц с ручной резьбой, соединенный со стеклянной канюлей (рисунок 2A). Стеклянная канюля состоит из боросиликатного стеклянного капилляра, модифицированного на собственном производстве для получения тонкого тупого наконечника с помощью съемника микропипетки и скоса. Более простая альтернативная канюля может быть создана с использованием имеющегося в продаже пластикового катетера, подключенного к трубке шприца и стабилизированного в наконечнике пипетки (рисунок 2B). Операция заключается в инокуляции сфероидов печени в АПФ через разрез в роговице (Рисунок 2C). Сфероиды располагались по краям зрачка, чтобы сделать их более доступными для визуализации и избежать их смещения в глазной угол. Мышей-альбиносов использовали для трансплантации, так как их непигментированная радужная оболочка позволяет in vivo визуализировать привитые сфероиды печени. Мышам-реципиентам трансплантировали в оба глаза с 7-10 сфероидами на глаз, а стереоскопические изображения были сделаны через 3 дня после трансплантации (после пересадки), а также через 1 неделю и 1 месяц после пересадки, чтобы задокументировать заживление роговицы и успешное приживление сфероидов (рисунок 2D). Следует отметить, что изменение внешнего вида сфероидов печени в АПФ между свежей трансплантацией и полным приживлением связано с оседанием трансплантата на радужной оболочке, а также с ростом монослоя клеток радужки над сфероидом. Успешность приживления сфероидов печени в АПФ составляет 70% (n = 9 глаз как у самцов, так и у самок мышей) (рис. 2E). Первые дни после пересадки являются наиболее важными для выживания и приживления, вероятно, из-за того, что животное-реципиент трет глаза и смещает сфероиды до того, как роговица заживет. Размеры сфероидов печени существенно не различаются после пересадки, а изменения формы объясняются ремоделированием и приживлением трансплантата (рис. 2F). Через 1 месяц после передатчика все привитые сфероиды, присутствующие на радужной оболочке, были васкуляризированы и иннервированы, как показано иммунофлуоресцентным окрашиванием (рис. 2G).

Неинвазивная визуализация in vivo выполняется на мышах-реципиентах, находящихся под наркозом, с использованием вертикального конфокального микроскопа и объектива для погружения на большое расстояние (рис. 3A, таблица 2). Флуоресцентная визуализация в АПФ может быть получена с помощью различных подходов, как показано на рисунке 3B. Введение флуоресцентных зондов в кровообращение мыши-реципиента позволяет визуализировать различные типы клеток и структуры внутри сфероидов. Мы использовали лектин для маркировки кровеносных сосудов (рис. 3C), CMFDA для наблюдения сети желчных каналов (рис. 3D) и pHrodo-LDL, что подтвердило активное поглощение ЛПНП сфероидными клетками (рис. 3E). Также можно использовать сфероиды печени, полученные из моделей мышей-репортеров. Сфероиды Albumin-Cre:tdTomato позволяли мечить и отслеживать гепатоциты (рис. 3F), а сфероиды, экспрессирующие биосенсор флуоресцентного убиквитинового индикатора клеточного цикла (FUCCI), использовали для визуализации динамики клеточного цикла с разрешением одной клетки (рис. 3G). Наконец, сфероиды печени могут быть генетически модифицированы in vitro до трансплантации, а в случае трансдукции аденоассоциированного вируса (AAV)-GFP экспрессия наблюдалась in vivo в течение более 6 месяцев (рисунок 3H).

Рисунок 1: Выделение первичных гепатоцитов мыши и генерация сфероидов печени. (A) Материал и оборудование, используемые для выделения первичных гепатоцитов мыши: 1. Изоляционные буферы; 2. Водяная баня; 3. Перистальтический насос; 4. Чашка Петри; 5. Сетчатый фильтр; 6. Впитывающая прокладка; 7. Коврик для вскрытия; 8. Клеточный лифтер; 9. Игла бабочка 27 г; 10. Инструменты для препарирования. (B) Брюшная полость во время операции: полая вена канюлируется и перфузируется, а воротная вена разрезается, чтобы обеспечить протекание буферов. (C) Светлопольные изображения формирования сфероидов печени in vitro через 0 (d0), 5 (d5) и 10 (d10) дней после посева, масштабные линейки = 200 мкм. (D) Размер сфероида печени при различных концентрациях при посеве клеток, n = 21 сфероид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Трансплантация и приживление сфероидов печени в АПФ мышей. (A) Материалы и оборудование, используемые для трансплантации (Tx) сфероидов печени в АПФ: 1. Сфероиды печени в чашке для культивирования; 2. Стерильный физиологический раствор; 3. Глазная мазь; 4. Иглы 23 г; 5. Канюля; 6. Шприц Гамильтона; 7. Газовая трубка для анестезии; 8. Подголовник и противогаз; 9. Грелка; 10. Изготовленная на заказ металлическая опорная плита; 11. Щипцы и прочный карданный шарнир. (B) Установка канюли и шприца Гамильтона: 1. Стеклянная канюля, соединенная со шприцем Гамильтона с помощью трубки Portex и иглы 27G; 2. Стеклянная канюля соединена с трубкой Portex через дополнительные сегменты силиконовой трубки и трубки PharMed; 3. Пластиковая канюля в альтернативной сборке; 4. Детали, образующие пластиковую канюлю: пластиковый катетер BD Insyte 24 г, подключенный через трубку PharMed и заключенный в обрезной наконечник пипетки объемом 10 мкл для стабильности и захвата. (C) Иллюстрация этапов операции Tx: 1. Сфероиды собираются в канюлю; 2. Роговица прокалывается иглой; 3. Канюля вводится в разрез, а сфероиды высвобождаются в АПФ; 4. Снаружи глаза сфероиды расположены близко к зрачку и вдали от разреза. (D) Стереоскопические изображения сфероидов печени (sph) в глазу мыши в день операции и через 3, 7 и 30 дней после Tx. Стрелки указывают на жизнеспособные сфероиды. (E) Скорость приживления сфероида печени (размер 1200 клеток/лунка) после Tx, n = 9 глаз у 6 мышей-реципиентов. (F) Размер сфероидов печени в культуре до трансплантации (in vitro, n = 20 сфероидов из одного препарата) и через 1 месяц после приема в АПФ (in vivo, n = 16 сфероидов у 3 мышей-реципиентов), рассчитанный путем усреднения вертикального и горизонтального диаметров. (G) Иммунофлуоресцентное окрашивание привитых сфероидов печени через 2 месяца после передатчика, показывающее васкуляризацию (CD31, розовый, пунктирная линия очерчивает сфероидную массу) и симпатическую иннервацию (тирозингидроксилаза (TH), оранжевый), масштабная линейка = 100 мкм. Данные для панели F были адаптированы с разрешения Lazzeri-Barcelo et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Неинвазивная интраокулярная визуализация in vivo привитых сфероидов печени. (A) Материал и оборудование, используемые для визуализации АПФ in vivo : 1. Вертикальный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп; 2. Темный ящик; 3. Моторизованная ступень XYZ; 4. Цель погружения; 5. Подголовник и противогаз; 6. Щипцы и прочный карданный шарнир; 7. Грелка; 8. Изготовленная на заказ металлическая опорная плита. (B) Диаграмма, изображающая различные подходы, используемые для визуализации in vivo флуоресцентных показаний в сфероидах печени, привитых в глазу. (К-Н) Репрезентативные изображения сфероидов печени АПФ во время визуализации in vivo с помощью конфокальной микроскопии. Сигнал обратного рассеяния используется для наблюдения за объемом и структурой сфероида; (C) Кровеносные сосуды, помеченные внутривенной инъекцией флуоресцентного лектина, масштабная линейка = 100 мкм; (D) Желчно-канальная сеть, меченная инъекцией флуоресцентного CMFDA, масштабная линейка = 50 μм; (E) Поглощение ЛПНП путем инъекции флуоресцентного пХродо-ЛПНП-зонда, масштабная линейка = 100 мкм; (F) Td-томатоэкспрессирующие гепатоциты, стрелки обозначают ядра, звездочки указывают на внутрисфероидную сосудистую сеть, масштабная линейка = 50 мкм; (G) Мониторинг динамики клеточного цикла в сфероидах печени, экспрессирующих FUCCI, масштабные линейки = 50 мкм (основное изображение) и 20 мкм (увеличение). (H) сфероиды печени, трансдуцированные in vitro с помощью AAV8-GFP до Tx и визуализированные в глазу через 6 месяцев после Tx, масштабная линейка = 50 μm. Изображение на панели G было адаптировано с разрешения Lazzeri-Barcelo et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Растворы, используемые для выделения первичных гепатоцитов мыши. Состав растворов и буферов, необходимых для выделения гепатоцитов мыши. Компоненты буфера для разложения и раствора градиента следует смешивать свежими в день изоляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2. Настройки конфокального микроскопа Leica SP5 используются для интраокулярной визуализации сфероидов печени in vivo. Таблица была адаптирована с разрешения Lazzeri et ^al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Этот протокол описывает новую платформу для интраокулярной визуализации in vivo сфероидов печени, привитых в АПФ. АПФ ранее использовался в качестве места трансплантации других микротканей, полученных из органов, таких как островки поджелудочной железы^11,12, из-за его уникального микроокружения приживления, богатого сосудами, нервами и кислородом, а также доступа к визуализации через роговицу. В то время как прижизненная визуализация печени позволяет визуализировать клетки и процессы in situ, лонгитюдный мониторинг невозможен. Визуализация печени через брюшное окно влечет за собой сложную операцию, а движение органа в организме затрудняет отслеживание отдельных клеток с течением времени. Таким образом, этот новый метод визуализации позволяет проводить неинвазивный продольный мониторинг клеток печени с одноклеточным разрешением.

Этот протокол разделен на три части. Во-первых, это выделение первичных гепатоцитов с помощью двухступенчатой перфузии коллагеназы, адаптированной из Charni-Natan et ^al.13, с той разницей, что мы выполняем перфузию печени на мертвых мышах, а не на живых животных, находящихся под наркозом. Этот вариант дает определенные преимущества, такие как меньшее количество этических соображений и отсутствие остатков анестезии в организме. В этой работе мы получаем сфероиды печени из обогащенной гепатоцитами фракции выделения, но это не исключает возможности выделения других непаренхиматозных клеточных популяций с использованием других специализированных протоколов для создания сфероидов кокультуры разнообразного состава^14,15.

Вторая часть этого протокола включает трансплантацию сфероидов печени в АПФ мышей-реципиентов. Это быстрая (менее 10 минут) и простая операция, выполняемая на мышах под наркозом и не требующая послеоперационного лечения. Прокол роговицы самозаживает и заживает в течение 3-5 дней. Иногда, в процессе заживления, вокруг разреза наблюдается некоторая дедовщина, но она проходит в течение нескольких дней. Мы не сталкивались со случаями передней синехии в глазах прооперированных животных. Мы проводим процедуры трансплантации в чистой, но открытой лаборатории и без проблем с инфекциями в прооперированных глазах. Инокуляция и приживление сфероидов в глазу не ставят под угрозу зрение и не изменяют поведение животного-реципиента. В этом протоколе мы используем изофлурановую анестезию как для трансплантационной операции, так и для визуализации in vivo , которая хорошо переносится мышами. Благодаря дозозависимому эффекту его можно легко регулировать на протяжении всей процедуры, что дает преимущество сокращения времени сна и пробуждения. Однако можно использовать альтернативные инъекционные анестетики. После трансплантации мы обычно даем 1 месяц, чтобы сфероиды полностью прижились, васкуляризировались и иннервировались, прежде чем проводить лечебные вмешательства и визуализацию in vivo . Мы также показали, что трансплантация и приживление возможны с использованием сфероидов печени человека и мышей-реципиентов с ослабленным иммунитетом¹⁰.

Третьей частью этого метода является визуализация in vivo привитых сфероидов печени в АПФ. Этот протокол описывает установку визуализации in vivo, в которой используется оборудование для микроскопии, обычно используемое в исследовательских центрах визуализации. Кроме того, специализированные материалы, такие как держатель головы мыши и пластиковая канюля, теперь коммерчески доступны. С помощью этой установки визуализации мы можем захватывать z-срезы и получать трехмерную реконструкцию архитектуры сфероида в зависимости от глубины проникновения лазера и обнаружения флуоресценции. Мониторинг клеточной функции в привитых сфероидах печени основан на визуализации флуоресцентных белков, которые сообщают о типах клеток, клеточных функциях и динамике. Таким образом, эта платформа визуализации может быть использована с использованием различных модальностей, по отдельности или в комбинации: (1) флуоресцентные зонды могут вводиться внутривенно, например, антитела для маркировки и отслеживания клеток, а также функциональные красители; (2) сфероиды печени могут быть получены из клеток, выделенных из моделей мышей-репортеров, которые экспрессируют специфичные для печени флуоресцентные белки, например, сфероиды печени FUCCI, которые сообщают о динамике клеточного цикла; (3) Образование сфероидов печени in vitro может сочетаться с трансфекцией или трансдукцией, чтобы оснастить сфероиды флуоресцентными белками и биосенсорами. Например, аденоассоциированные вирусы. В наших экспериментальных условиях и при использовании одного фотона для возбуждения глубина изображения, которую можно достичь, составляет примерно 60-100 мкм. Однако это зависит от мощности лазера и доступности многофотонной визуализации, характеристик излучения флуоресцентного зонда и чувствительности детекторов, а также угла глаза, в который привит сфероид. После получения изображений последующий анализ изображений может быть выполнен с помощью популярных программ, таких как Image J и Imaris. Например, в случае с репортером FUCCI активные клетки клеточного цикла, выделенные зеленым цветом, могут быть подсчитаны и сопоставлены с количеством общих эритроцитов для оценки активности клеточного цикла в привитом сфероиде. Кроме того, платформа ACE-imaging позволяет наносить вещества в глаз (в виде глазных капель) или вводить непосредственно в АПФ для обработки трансплантата и мониторинга его реакции. После вскрытия трансплантированные сфероиды могут быть легко извлечены с помощью ручной микродиссекции и могут предоставить ценную информацию с помощью методов ex vivo, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание, транскриптомный анализ и т.д.10.

Эта методика имеет определенные ограничения. Во-первых, по нашему опыту, мыши-реципиенты должны быть альбиносами, т.е. иметь непигментированную радужную оболочку. При приживлении сфероиды печени покрываются монослоем клеток радужной оболочки, что не влияет на жизнеспособность или функцию сфероидов, но пигмент в клетках радужки препятствует визуализации. Вторым соображением является стабильность во время внутриглазной визуализации у мышей под наркозом. Во время сеансов визуализации in vivo необходимо тщательно контролировать концентрацию анестезии и дыхание животного, чтобы свести к минимуму движения. Тем не менее, используя указанные здесь настройки визуализации, мы можем получить изображение с высоким разрешением на уровне отдельных клеток.

Подводя итог, можно сказать, что этот протокол описывает реализацию неинвазивной платформы визуализации in vivo печеноподобной ткани, привитой в глаза мышей. Мы используем простые процедуры, обычное оборудование и доступные материалы, что делает этот подход доступным для многих исследователей. Эта модель сочетает в себе преимущества 3D-сфероидов печени in vitro с средой in vivo и оптической доступностью, обеспечиваемой ACE, чтобы создать ценную платформу для изучения физиологии и патологии печени в фундаментальных исследованиях и доклинических условиях.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G butterfly needle	Venofix	4056388
AAV8-CAG-GFP	Charles River	CV17169-AV9	Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation
Absolute and 70% ethanol	N/A	N/A
Absorbent pad	Attends	203903
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson	#003574 and #007914	Mice obtained from in-house breeding
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)	Jackson	#000058	Mice obtained from in-house breeding
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH	INFRAFRONTIER/EMMA	EM:08395	Mice obtained from in-house breeding
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in	BD Medical	381212
Borosillicate standard glass cappilaries	World Precision Instruments	1B150-4
Cell lifter	Corning	3008
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Custom-made metal plate	Hardware store	N/A
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	Model PC-100
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Electric heating pad	Hardware store	N/A
FBS	Gibco	N/A
GlutaMAX	Gibco	35050061
Green CMFDA	Abcam	ab145459	Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS
Hamilton syringe	Hamilton	81242	Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red	Gibco	14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective	Leica	N/A
HEPES	Gibco	15630080
Induction chamber 0.8 L	Univentor	8329001
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G)	Gibco	41400045
Isoflurane	Baxter	N/A
Lectin DyLight-649	Invitrogen	L32472	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Liberase TM Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001
Microelectrode beveler	World Precision Instruments	Model BV-10
Mouse head-holder and gas mask	Narshige	Model SGM-4
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Fisher	174929
Oculentum simplex	APL	N/A
PBS 10x	Gibco	14080055
PBS 1x; no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644
Peristaltic pump	Ismatec	Model ISM795
PharMed BPT Pump Tubing	VWR	VERN070540-07	Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm
pHrodo Red-LDL	Invitrogen	L34356	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing	Smiths Medical	800/100/140	Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm
Silicone dissection mat	Hardware store	N/A
Sodium chloride 0.9%	Braun	N/A
Solid Universal Joint	Narshige	Model UST-2
Stereomicroscope	Leica	Model M80
Suspension culture dish 35 mm	Sarstedt	833900500
Temgesic	Indivor	N/A	Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse
Translucent Silicone Tubing	VWR	228-1450	Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Univentor 400 Anesthesia unit	Univentor	8323001
Upright laser scanning confocal microscope	Leica	Model TCS SP5 II
Viscotears	Novartis	N/A
William's E Medium; no glutamine, phenol red	Gibco	22551089