쥐 눈의 전방에 생착된 간 회전 타원체의 In vivo 이미징

요약

여기에서는 쥐 눈의 전방에 생착된 간 스페로이드의 비침습적 in vivo 이미징을 허용하는 플랫폼에 대해 설명합니다. 워크플로우는 일차 간 세포에서 스페로이드를 생성하는 것부터 마우스 눈에 이식하고 컨포칼 현미경을 통해 세포 해상도로 생체 내 이미징을 수행하는 것까지 다양합니다.

초록

포유류의 간에 대한 생물의학 연구는 세포 해상도에서 생체 내 비침습적 종단 이미징을 위한 방법의 부족으로 인해 방해를 받고 있습니다. 지금까지는 세포 수준에서 고해상도 이미징을 제공하는 생체 내 이미징을 통해 간의 현장 광학 이미징이 가능했지만 여러 번 수행할 수 없으므로 동일한 동물에서 종방향으로 수행할 수 없었습니다. 생물 발광(bioluminescence)과 같은 비침습적 이미징 방법은 동일한 동물에 대한 반복적인 이미징 세션을 허용하지만 세포 해상도를 달성하지는 못합니다. 이러한 방법론의 차이를 해결하기 위해 우리는 쥐 눈의 전방에 생착된 간 스페로이드의 비침습적 in vivo 이미징을 위한 플랫폼을 개발했습니다. 이 연구에서 설명된 워크플로우에서 1차 마우스 간 스페로이드는 시험관에서 생성되어 수혜자 마우스의 눈 전방에 이식되어 홍채에 생착됩니다. 각막은 기존의 컨포칼 현미경으로 생착된 스페로이드를 이미지화할 수 있는 자연스러운 신체 창 역할을 합니다. 스페로이드는 눈에서 수개월 동안 생존하며, 이 기간 동안 세포는 건강 및 질병의 맥락에서 연구될 수 있을 뿐만 아니라 적절한 형광 프로브를 사용하여 반복적인 이미징 세션을 통해 다양한 자극에 대한 반응으로 모니터링될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 이 이미징 시스템을 구현하는 데 필요한 단계를 분석하고 그 잠재력을 가장 잘 활용하는 방법을 설명합니다.

서문

건강 및 질병 중 포유류의 간 기능 모니터링은 고해상도, 비침습적 생체 내 이미징 기술의 부족으로 인해 제한됩니다. 이 장기의 시각화는 접근할 수 없는 위치로 인해 방해를 받고 있으며, 세포 과정을 결합하기 위해 생체 내 연구는 서로 다른 시점에서 동물의 희생에 의존합니다. 이러한 이미징 제한을 피하기 위해 많은 작업이 통제된 환경에서 간과 같은 미세 조직을 시각화하고 연구하는 체외 모델에 의존하고 있습니다.

최근 몇 년 동안 간 스페로이드와 같은 3차원 배양 시스템의 개발은 간 연구를 지원하고 발전시켰습니다. 간 스페로이드는 간 조직의 미세환경과 복잡한 세포-세포 상호작용을^{어느 정도 모방}하는 다세포 응집체이며1 기존의 단층 배양에 비해 분명한 이점을 제공합니다 ^2,3. 간 스페로이드는 또한 다양한 간 질환 ^4,5,6에 대한 모델로 사용되며 질병 메커니즘을 이해하는 데 중요한 역할을 합니다. 그럼에도 불구하고 현재 in vitro liver 모델의 주요 한계는 생리학적 in vivo 환경이 부족하고 배양에서의 활용 시간이 제한적(약 20^{일)이라는} 것입니다3. 간 스페로이드는 이전에 생체 내 다른 부위, 예를 들어 신장 캡슐(kidney capsule)⁷ 아래 또는 복강 내(intraperitoneally⁾⁸와 같은 다른 부위에 이식되었는데, 이는 광학 이미징을 위해 접근할 수 없다. 생체 내 간 이미징은 세포 해상도 실시간 이미징을 제공하는 최첨단 기술입니다. 현재 이러한 상피내 간 영상은 외부 장기에서만 가능하며, 이는 매우 침습적이며 종종^{말기 9}입니다. 복부 창문을 삽입하면 반복적인 간 영상 촬영이 가능하지만 복잡한 수술과 사후 관리가 수반됩니다.

세포 해상도에서 종단 모니터링을 수행하기 위해 간 스페로이드를 생쥐의 안구 전방(ACE)에 이식하는 방법을 조사했으며, 여기서 간과 유사한 조직이 생리학적 환경에 생착되고 신체 자극에 연결되어 광학 이미징에 접근할 수 있습니다. 각막은 투명한 조직이며 홍채에 생착된 미세조직을 컨포칼 현미경으로 비침습적 및 종방향으로 이미징할 수 있는 창 역할을 합니다. 여기에서는 간 스페로이드¹⁰의 in vivo 이미징을 위해 새로 개발된 이 플랫폼의 워크플로우를 제시합니다. 이 프로토콜은 (1) 1차 마우스 간 세포 추출 및 간 스페로이드의 시험관 내 형성, (2) 간 스페로이드를 수혜 마우스의 ACE에 이식, (3) 마취된 마우스에서 생착된 간 스페로이드의 in vivo 이미징으로 나뉘며 구현을 위한 단계별 가이드입니다. 또한 이 이미징 플랫폼의 몇 가지 가능성과 응용 분야를 선보일 것입니다.

프로토콜

동물에게 행해진 모든 시술은 카롤린스카 연구소의 동물실험윤리위원회(Animal Experiment Ethics Committee)의 승인을 받았다.

1. in vitro에서 1차 마우스 간세포 추출 및 간 스페로이드 생성

1. 준비
   1. 캐뉼레이션, 간 절제 및 일차 간 세포의 분리를 위해 혈청학적 피펫 및 원심분리기 튜브(그림 1A) 외에도 다음과 같은 멸균 또는 일회용 재료를 준비합니다: 연동 펌프, 스윙 버킷 원심분리기, 흡수 패드, 해부 매트, 곡선 팁 겸자 2개, 수술용 가위, 27G 버터플라이 바늘 1개, 70μm 세포 여과기 1개, 세포 리프터 1개, 100mm 페트리 접시 1개, 세포 계수 챔버 및 96-Well, U-shaped-bottom microplates.
   2. 표 1에 나열된 간 관류, 일차 간 세포의 분리 및 간 스페로이드 생성에 사용되는 용액을 준비합니다.
      참고: Digestion buffer와 Gradient 용액은 신선하게 준비해야 합니다.
   3. 42°C 수조에서 간으로 용액을 전도하는 연동 펌프로 구성된 관류 시스템을 설정합니다(그림 1A). 수조의 온도가 높을수록 완충액이 최적의 온도인 37°C에서 간에 도달합니다. 튜브 길이와 실내 온도(RT)에 따라 이를 사용자 정의하십시오.
   4. 캐뉼레이션의 경우 27G 버터플라이 바늘을 튜브 끝에 맞춥니다. 최종 분리 단계에서 사용되는 도금 매체를 4°C로 유지합니다.
2. 절차
   1. 50mL 원심분리기 튜브의 42°C 수조에서 PBS 40mL, 관류 완충액 20mL, 분해 완충액 12mL를 사전 가열합니다.
   2. 펌프 튜브를 청소하고 따뜻하게 하려면 예열된 PBS 약 20mL를 순환시킵니다.
   3. 튜브를 관류 완충액으로 변경하고 튜브와 버터플라이 바늘을 프라이밍한 다음 유속을 4mL/분으로 설정합니다. 프로토콜 전체에서 버퍼를 변경하는 동안 튜브에 기포가 없는지 확인하십시오.
   4. 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시키고 바늘을 사용하여 팔다리를 해부판에 고정합니다.
   5. 복부 털을 70% 에탄올로 적시고 해부하여 소화 기관에 접근합니다.
   6. 장을 오른쪽으로 움직여 문맥과 하대정맥을 노출시킵니다(그림 1B).
   7. 바늘을 수평 위치에 놓고 대정맥을 길이의 약 절반으로 캐뉼레이팅하고 안정적인지 확인한 다음 펌프를 시작합니다.
   8. 간이 팽창하기 시작하거나 간엽에 흰 점이 나타나면 문맥을 절단하여 혈액과 관류 완충액이 배출될 수 있도록 합니다.
   9. 간은 즉시 데치기 시작해야 합니다. 구부러진 집게를 사용하여 5초 간격으로 문맥을 고정하도록 권장합니다.
   10. 간이 노랗게 변하고 피가 없어질 때까지 1.2.9단계를 반복합니다(약 15-20mL의 관류 완충액).
   11. 연동 펌프를 중지하여 튜브를 분해 완충액으로 변경하고 펌프를 다시 시작합니다. 분해 완충액이 간에 도달하면 유속을 2.5mL/분으로 줄입니다.
       참고: 소화 완충액의 페놀 레드는 간으로의 도착을 구별하고 치료 중 펌프 매개변수를 조정할 수 있도록 합니다.
   12. 완충액이 모든 간엽에 도달하고 적절한 소화를 보장하도록 하려면 1.2.9단계를 여러 번 반복하십시오.
   13. 소화 완충액이 고갈되거나 간이 충분히 소화된 것처럼 보일 때 연동 펌프의 흐름을 멈춥니다.
       참고: 소화 정도는 집게로 간엽을 부드럽게 꼬집고 조직에 작은 자국이 나타나는지 확인하여 육안으로 모니터링할 수 있습니다. 간도 약해진다.
   14. 간을 적출하려면 복강 내의 간 인대와 연결부를 절단하여 완전히 제거하는 것을 목표로 하고 10mL의 냉간 도금 배지가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다(표 1).
   15. 담낭을 제거한 후 겸자를 사용하여 엽을 약간 꼬집어 간낭을 가볍게 찢습니다. 접시에서 간을 흔들어 세포가 배지로 쏟아져 나오는 것을 관찰하십시오.
   16. 집게로 간을 안정되게 잡고 세포 리프터를 엽을 따라 부드럽게 당겨 세포를 방출합니다.
       참고: 올바른 소엽 간 소화는 조직 조각이 아닌 매체에서 세포 현탁으로 이어집니다.
   17. 혈청학적 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 세포 현탁액을 수집하고 50mL 원심분리기 튜브에 놓인 70μm 세포 여과기를 통해 여과합니다. 신선한 도금 매체를 사용하여 소화 된 간 세포의 접시를 씻고 필터로 옮깁니다.
   18. 4 °C에서 5분 동안 50 x g 으로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
   19. 상층액을 제거하고 약 1mL를 남겨 세포 펠릿을 덮고 튜브를 소용돌이쳐 세포를 재현 탁한 다음 점차적으로 10mL의 냉간 도금 매체를 추가합니다.
   20. 10mL의 그래디언트 용액을 세포 현탁액에 넣고 튜브를 10회 부드럽게 뒤집습니다.
   21. 200 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.
   22. 펠릿에는 간세포가 풍부해진 생존 가능한 간세포가 포함되어 있는 반면, 상층액에는 죽은 세포와 파편이 포함되어 있습니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 약 1mL를 남기고 부드럽게 휘젓습니다.
   23. 셀 현탁액에 20mL의 냉간 도금 매체를 추가하고 4°C에서 5분 동안 50 x g 으로 원심분리하여 그래디언트 용액을 씻어냅니다.
   24. 펠릿 위로 약 1mL를 남겨두고 상층액을 제거하고 20mL의 냉간 도금 매체에 세포를 재현탁시킵니다.
       참고: 여기에서 세포 펠릿을 압축할 수 있으므로 필요한 경우 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 해리합니다.
   25. 세포 계수 챔버와 Trypan Blue를 사용하여 세포 수와 생존율을 수동으로 측정합니다.
       참고: 간세포 세포는 튜브에서 빠르게 침전됩니다. 그것들을 다시 매달기 위해 튜브를 몇 번 부드럽게 뒤집습니다.
   26. 1200 cells/well의 도금 매체 200 μL/well에 간 세포를 96-well 초저 접착 플레이트에 파종합니다.
       참고: 웰당 최적의 매체 부피는 200μL입니다. 그러나 100 μL/well에 세포를 파종할 수 있습니다.
   27. 플레이트를 200 x g 에서 3분 동안 돌려 웰 중앙에 세포를 모읍니다.
   28. 세포를 배양(37 °C, 5% CO₂)하고 자연적으로 5일 동안 스페로이드를 형성하도록 둡니다(그림 1C).
   29. 5일째에 웰에서 배지의 절반을 조심스럽게 제거하고 무혈청 유지 관리 배지로 교체합니다(표 1). 간 스페로이드를 이식할 준비가 된 10일까지 48시간마다 이 단계를 반복합니다.
       참고: 배양된 간 스페로이드에서 캡슐과 같은 구조의 형성은 우수한 응집과 생존력을 보여줍니다.

2. 간 스페로이드를 안구 전방(ACE)에 이식

1. 준비
   1. 간 스페로이드를 ACE에 이식하려면 다음 자원을 준비해야 합니다(그림 2A): 실체현미경, 이소플루란 마취 장치, 유도 챔버, 이소플루란, 가열 패드, 맞춤형 금속 베이스 플레이트, 마우스 헤드 홀더 및 방독면, 고체 유니버설 조인트에 부착된 겸자, Hamilton 500 μL 나사산 플런저 주사기, 실리콘, 폴리에틸렌 및 펌프 튜브, 맞춤형 무딘 유리 캐뉼라 또는 24G 카테터, 에탄올 70%, 멸균 식염수, 멸균 23G 바늘, 눈 연고(액상 파라핀과 바셀린을 1:1 비율로 사용), 일회용 1mL 주사기 및 세포 현탁액 접시 35mm.
   2. Hamilton 주사기, 튜브 및 캐뉼러를 70% 에탄올과 식염수를 통과시켜 청소합니다.
   3. Hamilton 주사기, 튜브 및 유리 캐뉼러에 식염수를 채우고 테이프로 Hamilton 주사기를 수평으로 벤치에 고정합니다(그림 2A).
   4. 맞춤형 뭉툭한 유리 캐뉼라를 사용하십시오.
      1. 2단계 마이크로피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관을 >300μm의 내경으로 늘려 스페로이드를 흡인할 수 있도록 합니다.
      2. 미세 전극 베벨러를 사용하여 팁을 경사지고 무디게 하고 캐뉼라 팁을 몇 초 동안 화염에 노출시켜 가장자리를 부드럽게 합니다.
         알림: 미세 전극 베벨러는 수동으로 작동되는 회전 샌딩 스톤으로 구성됩니다. 따라서 특정 설정은 적용할 수 없습니다.
   5. 또는 24G 카테터의 플라스틱 부분을 사용하여 캐뉼라를 구성합니다(그림 2B).
   6. 마취 이소플루란 장치를 준비하고 가열 패드를 37°C로 예열합니다.
   7. 단단한 유니버설 조인트에 부착된 집게의 끝부분을 폴리에틸렌 튜브 조각으로 덮어 고리를 형성하면 눈을 안정시키는 데 도움이 됩니다.
   8. 피펫과 200 μL 팁을 사용하여 유지 배지가 있는 96-well plate의 간 스페로이드를 35 mm cell suspension dish에 옮깁니다.
2. 절차
   1. 2.5% 이소플루란과 280mL/분 공기를 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다.
   2. 쥐가 의식을 잃었을 때 마취를 1.8% 이소플루란과 280mL/min 공기로 낮추고 마취 튜브를 헤드 홀더에 연결한 다음 동물을 가열 패드로 빠르게 옮겨 코를 헤드 홀더 내부에 위치시킵니다.
   3. 나사로 머리를 고정하고 소켓에서 눈을 부드럽게 빼낸 다음 집게로 고정하고 양쪽 눈에 식염수를 한 방울 떨어뜨려 건조를 방지합니다.
   4. 스테레오스코프 아래에서 Hamilton 주사기를 사용하여 간 스페로이드를 흡입하고 캐뉼라 끝으로 모으고 깨끗한 표면에 수평으로 놓습니다.
      참고: 간 스페로이드와 함께 매체를 흡입하면 캐뉼라 벽에 달라붙는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
   5. 23G의 바늘을 사용하여 각막을 조심스럽게 뚫고 스며드는 수액을 티슈로 말리십시오. 필요한 경우 절개 부위를 더 넓히기 위해 바늘을 조심스럽게 옆으로 밀어 각막을 자릅니다.
      참고: 일회용 멸균 바늘을 사용하여 각막 천자를 수행하므로 절개 전에 각막을 소독하지 않습니다.
   6. 눈이 건조해지지 않도록 눈에 식염수를 넣으십시오.
   7. 간 스페로이드가 들어있는 캐뉼라를 잡고 수직으로 잡아 스페로이드가 캐뉼라 끝 쪽으로 끌릴 수 있도록 합니다.
   8. 캐뉼라를 구멍에 부드럽게 삽입하고 베벨이 동공을 향하게 하여 Hamilton 주사기를 사용하여 간 스페로이드를 ACE로 천천히 배출합니다(그림 2C).
      알림: 캐뉼라를 제거하기 전에 눈 안팎의 액체 압력이 재조정되고 스페로이드가 눈 밖으로 다시 빠져나가지 않도록 몇 초 동안 기다리는 것이 좋습니다.
   9. 각막 바깥쪽에서 캐뉼라 끝으로 각막을 부드럽게 찔러 간 회전 타원체를 동공 주위로 배치하고 절개 부위에서 멀리 떨어뜨립니다(그림 2C).
   10. 간 회전 타원체가 홍채에 정착할 때까지 5~10분 동안 기다렸다가 집게에서 눈을 떼십시오.
   11. 수술한 눈에 바셀린 눈 연고를 바르면 각막을 윤활하고 치유하는 데 도움이 됩니다.
   12. 원하는 경우 동일한 방법에 따라 두 번째 눈 수술을 진행하십시오.
   13. 쥐를 깨우기 전에 수술 후 불편함을 피하기 위해 진통제를 투여하십시오(예: 멸균 식염수에 0.1mg/kg 부프레노르핀을 넣고 피하 투여).
       참고: 이 작은 절차에서 빠르게 회복하고 통증이나 변화된 행동의 징후를 보이지 않았기 때문에 생쥐에게 진통제의 단 한 가지 용량만 투여되었습니다. 이 절차는 매우 빠르고(10분 미만 소요) 경미한 불편함만 유발하기 때문에 생쥐는 동물을 깨우기 전에 투여된 수술 후 진통제 외에는 수술 후 관리가 필요하지 않습니다.

3. ACE에서 생착된 간 스페로이드의 In vivo 이미징

1. 준비
   1. ACE에 생착된 간 스페로이드의 비침습적 in vivo 이미징을 위해 정립 컨포칼 현미경, 장거리 침지 대물렌즈, 이소플루란 마취 장치, 유도 챔버, 이소플루란, 가열 패드, 맞춤형 금속 베이스 플레이트, 마우스 헤드 홀더 및 방독면, 고형 유니버설 조인트에 부착된 겸자, 인공 눈물 젤, 눈 연고(액체 파라핀과 바셀린을 1:1 비율로 사용).
   2. 옵션 재료에는 주사 가능한 형광 프로브, 일회용 주사기 및 꼬리 정맥 주입을 위한 27G 바늘이 포함됩니다.
2. 절차
   1. 2.5% 이소플루란과 280mL/분 공기를 사용하여 유도 챔버에서 마우스를 마취합니다.
   2. 쥐가 의식을 잃었을 때 마취를 1.8% 이소플루란과 280mL/min 공기로 낮추고 마취 튜브를 헤드 홀더에 연결한 다음 동물을 가열 패드로 빠르게 옮겨 코를 헤드 홀더 내부에 위치시킵니다.
   3. 나사를 사용하여 헤드 홀더의 헤드를 고정합니다.
   4. 인공 눈물 젤을 양쪽 눈에 한 방울 떨어뜨려 건조를 방지합니다.
   5. 이 시점에서 꼬리 정맥을 통해 형광 프로브를 정맥 주사하고 직후에 이미지를 촬영합니다.
   6. 머리를 기울이고 소켓에서 눈을 부드럽게 빼낸 다음 집게로 고정하고 대물렌즈 아래 위치에 고정합니다.
   7. 인공 눈물 젤을 넉넉하게 바르고 각막과 대물렌즈 사이의 공간을 채우고 접안렌즈를 통해 간 회전 타원체에 초점을 맞춥니다.
      알림: 가능하면 접안렌즈 중 하나의 접안렌즈를 제거하여 비확대 시야를 확보하고 홍채의 스페로이드를 더 쉽게 찾을 수 있습니다.
   8. 동물의 호흡 움직임에도 불구하고 고해상도 이미징을 얻으려면 25x 대물렌즈와 512 x 512 픽셀 형식, 600Hz의 스캔 속도 및 3μm의 Z 스택 두께와 같은 이미징 설정을 사용하십시오. 자세한 이미징 설정은 표 2를 참조하십시오.
      참고: 이미징 전반에 걸쳐 마취 농도는 1.6-2.2mL/h 이소플루란으로 조정되어 얕고 제어된 호흡 리듬을 달성하여 동물의 움직임을 최소화합니다.
   9. 이미징 세션이 끝나면 이소플루란을 제거하고 동물을 깨우기 전에 이미징된 눈을 바셀린 눈 연고로 치료합니다.

토론

이 프로토콜은 ACE에 생착된 간 스페로이드의 안구 내 이미징을 위한 새로운 플랫폼을 설명합니다. ACE는 혈관, 신경 및 산소가 풍부한 독특한 생착 미세환경과 각막을 통한 이미징에 대한 접근성^{으로 인해 이전에} 췌장 섬^11,12과 같은 다른 장기 유래 미세조직의 이식 장소로 사용되었습니다. 생체 내 간 이미징을 통해 세포와 과정을 현장에서 시각화할 수 있지만 종단 모니터링은 불가능합니다. 복부 창문을 통한 간 영상 촬영은 복잡한 수술을 수반하며, 신체 내 장기의 움직임으로 인해 시간 경과에 따른 단세포 추적이 어렵습니다. 따라서 이 새로운 이미징 방법은 단일 세포 해상도에서 간 세포의 비침습적 종단 모니터링을 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다. 첫 번째는 Charni-Natan et ^al.13에서 채택한 2단계 콜라겐분해효소 관류를 통한 원발성 간세포의 분리로, 마취된 살아있는 동물 대신 죽은 쥐에 대해 간 관류를 수행한다는 차이점이 있습니다. 이러한 변화는 윤리적 고려 사항이 적고 유기체에서 마취 잔류물을 피하는 것과 같은 특정 이점을 제공합니다. 이 연구에서는 분리물의 간세포가 풍부한 부분에서 간 스페로이드를 생성하지만, 이는 다양한 조성의 공동 배양 스페로이드를 만들기 위해 다른 특수 프로토콜을 사용하여 다른 비실질 세포 집단을 분리할 가능성을 배제하지 않습니다^14,15.

이 프로토콜의 두 번째 부분은 간 스페로이드를 수용 마우스의 ACE에 이식하는 것입니다. 이것은 마취된 마우스에서 수행되는 빠르고 간단한 수술(10분 미만)이며 수술 후 치료가 필요하지 않습니다. 각막 천자는 자가 밀봉되고 3-5일에 걸쳐 치유됩니다. 간혹 치유 과정에서 절개 부위 주변에 약간의 흐릿함이 관찰되지만 며칠 내에 사라집니다. 우리는 수술받은 동물의 눈에 전방 활막증이 나타난 사례를 경험하지 못했습니다. 우리는 깨끗하지만 개방된 실험실에서 이식 절차를 수행하며 수술한 눈의 감염 문제 없이 수행합니다. 눈에 스페로이드를 접종하고 생착하는 것은 시력을 손상시키거나 수용 동물의 행동을 변화시키지 않습니다. 이 프로토콜에서는 이식 수술과 생체 내 이미징 모두에 이소플루란 마취를 사용하며, 이는 마우스에서 잘 견디는 것입니다. 용량 의존적 효과로 인해 절차 전반에 걸쳐 쉽게 조정할 수 있으며 수면 및 기상 시간을 줄이는 이점을 제공합니다. 그러나 대체 주사 가능한 마취제를 사용할 수 있습니다. 이식 후, 일반적으로 스페로이드가 완전히 생착되고, 혈관화되고, 신경 분포가 형성될 때까지 1개월을 허용한 후 치료 중재 및 생체 내 이미징을 수행합니다. 또한 인간 간 스페로이드와 면역력이 저하된 수용 마우스를 사용하여 이식 및 생착이 가능하다는 것을 보여주었다¹⁰.

이 방법의 세 번째 부분은 ACE에서 생착된 간 스페로이드의 in vivo 이미징입니다. 이 프로토콜은 연구 이미징 시설에서 흔히 볼 수 있는 현미경 장비를 사용하는 in vivo 이미징 설정을 설명합니다. 더욱이, 마우스 헤드 홀더 및 플라스틱 캐뉼라와 같은 특수 재료는 현재 상업적으로 이용 가능합니다. 이 이미징 설정을 통해 z 절편을 캡처하고 레이저 침투 깊이와 형광 검출 깊이에 따라 스페로이드 구조의 3차원 재구성을 얻을 수 있습니다. 생착된 간 스페로이드에서 세포 기능을 모니터링하려면 세포 유형, 세포 기능 및 역학을 보고하는 형광 단백질의 시각화에 의존합니다. 따라서, 이 이미징 플랫폼은 단독으로 또는 조합하여 다양한 양식을 사용하여 활용될 수 있습니다: (1) 형광 프로브는 정맥 주사로 투여될 수 있습니다(예: 기능성 염료뿐만 아니라 세포를 라벨링하고 추적하기 위한 항체); (2) 간 스페로이드는 간 특이적 형광 단백질을 발현하는 리포터 마우스 모델로부터 분리된 세포로부터 생성될 수 있습니다(예: 세포주기 역학에 대해 보고하는 FUCCI 간 스페로이드; (3) 시험관 내에서 간 스페로이드의 형성은 transfection 또는 transduction과 결합하여 스페로이드에 형광 단백질 및 바이오센서를 장착할 수 있습니다. 예: 아데노 관련 바이러스. 실험 설정에서 excitation을 위해 단일 광자를 사용하여 달성할 수 있는 이미징 깊이는 대략 60-100 μm입니다. 그러나 이는 레이저 출력 및 다광자 이미징 가용성, 형광 프로브 방출 특성 및 검출기의 감도, 스페로이드가 생착되는 눈의 각도에 따라 달라집니다. 이미징 획득 후 Image J 및 Imaris와 같은 인기 있는 프로그램을 사용하여 다운스트림 이미지 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, FUCCI 리포터의 경우, 녹색으로 표시된 세포주기 활성 세포를 계수하고 총 적색 세포의 수와 대조하여 생착된 스페로이드 내의 세포 주기 활성을 평가할 수 있습니다. 또한 ACE 이미징 플랫폼을 사용하면 물질을 눈에 적용하거나(점안액 형태) ACE에 직접 주입하여 이식편을 치료하고 반응을 모니터링할 수 있습니다. 사후 이식된 스페로이드는 수동 미세해부로 쉽게 회수할 수 있으며 면역형광 염색, 전사체 분석 등과 같은 생체 외 기술을 통해 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.¹⁰.

이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫 번째는 우리의 경험에 비추어 볼 때, 수혜 마우스는 알비노, 즉 색소가 없는 홍채를 가져야 한다는 것입니다. 생착 시 간 스페로이드는 홍채 세포의 단층으로 덮여 스페로이드의 생존력이나 기능에 영향을 미치지 않지만 홍채 세포의 색소는 이미징을 방해합니다. 두 번째 고려 사항은 마취된 마우스에서 안구 내 이미징 중 안정성입니다. in vivo 이미징 세션 중에는 동물의 마취 농도와 호흡을 면밀히 모니터링하여 움직임을 최소화해야 합니다. 그럼에도 불구하고 여기에 표시된 이미징 설정을 사용하여 단일 셀 수준에서 고해상도 이미징을 얻을 수 있습니다.

요약하자면, 이 프로토콜은 생쥐의 눈에 생착된 간 유사 조직의 비침습적 in vivo 이미징 플랫폼의 구현을 설명합니다. 우리는 쉬운 절차, 공통 장비 및 저렴한 재료를 사용하여 많은 조사관이 달성할 수 있는 접근 방식을 만듭니다. 이 모델은 in vitro 3D 간 스페로이드의 장점과 ACE가 제공하는 in vivo 환경 및 광학 접근성을 결합하여 기초 연구 및 전임상 환경에서 간 생리학 및 병리학을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 만듭니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G butterfly needle	Venofix	4056388
AAV8-CAG-GFP	Charles River	CV17169-AV9	Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation
Absolute and 70% ethanol	N/A	N/A
Absorbent pad	Attends	203903
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson	#003574 and #007914	Mice obtained from in-house breeding
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)	Jackson	#000058	Mice obtained from in-house breeding
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH	INFRAFRONTIER/EMMA	EM:08395	Mice obtained from in-house breeding
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in	BD Medical	381212
Borosillicate standard glass cappilaries	World Precision Instruments	1B150-4
Cell lifter	Corning	3008
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Custom-made metal plate	Hardware store	N/A
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	Model PC-100
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Electric heating pad	Hardware store	N/A
FBS	Gibco	N/A
GlutaMAX	Gibco	35050061
Green CMFDA	Abcam	ab145459	Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS
Hamilton syringe	Hamilton	81242	Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red	Gibco	14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective	Leica	N/A
HEPES	Gibco	15630080
Induction chamber 0.8 L	Univentor	8329001
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G)	Gibco	41400045
Isoflurane	Baxter	N/A
Lectin DyLight-649	Invitrogen	L32472	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Liberase TM Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001
Microelectrode beveler	World Precision Instruments	Model BV-10
Mouse head-holder and gas mask	Narshige	Model SGM-4
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Fisher	174929
Oculentum simplex	APL	N/A
PBS 10x	Gibco	14080055
PBS 1x; no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644
Peristaltic pump	Ismatec	Model ISM795
PharMed BPT Pump Tubing	VWR	VERN070540-07	Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm
pHrodo Red-LDL	Invitrogen	L34356	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing	Smiths Medical	800/100/140	Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm
Silicone dissection mat	Hardware store	N/A
Sodium chloride 0.9%	Braun	N/A
Solid Universal Joint	Narshige	Model UST-2
Stereomicroscope	Leica	Model M80
Suspension culture dish 35 mm	Sarstedt	833900500
Temgesic	Indivor	N/A	Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse
Translucent Silicone Tubing	VWR	228-1450	Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Univentor 400 Anesthesia unit	Univentor	8323001
Upright laser scanning confocal microscope	Leica	Model TCS SP5 II
Viscotears	Novartis	N/A
William's E Medium; no glutamine, phenol red	Gibco	22551089