Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Özet

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Özet

Özellikle kemirgen ve büyük hayvan modellerinde klinik öncesi gen tedavisi araştırmaları, yüksek verim ve saflıkta AAV vektörlerinin üretimini gerektirmektedir. Araştırma laboratuvarlarındaki geleneksel yaklaşımlar, genellikle hem zahmetli hem de sorunlu olabilen bir süreç olan HEK293T hücrelerini yetiştirmek için hücre kültürü kaplarının yaygın kullanımını içerir. Burada, bu işlemi belirli bir hücre fabrikası (veya hücre yığınları, CF10) platformuyla basitleştiren benzersiz bir şirket içi yöntem sunulmaktadır. Polietilen glikol/sulu iki fazlı bölümlemenin iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile entegrasyonu, üretilen AAV vektörlerinin hem verimini hem de saflığını artırır. AAV vektörlerinin saflığı, SDS-PAGE ve gümüş boyama ile doğrulanırken, dolu parçacıkların boş parçacıklara oranı, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak belirlenir. Bu yaklaşım, in vivo çalışmalar için kalite taleplerini karşılamak için geliştirilmiş bir saflaştırma yöntemi ile birlikte AAV vektörlerinin yüksek verimlerde üretilmesi için verimli bir hücre fabrikası platformu sunar.

Giriş

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri, gen iletimi için benzersiz bir etkinlik ve güvenlik kombinasyonu sunarak gen terapisi araştırmalarında vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir¹. Laboratuvar ortamlarında AAV'ler oluşturmak için geleneksel yöntemler, gen terapisi² anlayışımızı ve uygulamamızı ilerletmede çok önemli olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemler, temel olmakla birlikte, özellikle verim, zaman verimliliği ve üretilen vektörlerin kalitesi, özellikle de dolu parçacıkların boş parçacıklara oranı açısından belirli sınırlamalar ve zorluklar sergilemektedir³.

AAV üretimi için geleneksel prosedür öncelikle HEK293 hücrelerinin⁴ transfeksiyonunu içerir. Tipik olarak hücre kültürü kaplarında gerçekleştirilen bu işlem, hücrelerin yardımcı plazmid ve AAV kapsid plazmidi ^5,6 ile birlikte ilgilenilen geni içeren bir plazmit ile transfekte edilmesini gerektirir. Transfeksiyonu takiben, hücreler daha sonra hasat edilen ve saflaştırılan AAV parçacıkları üretir ^5,6. Saflaştırma işlemi genellikle, yüksek saflıkta AAV vektörleri⁷ elde etmede kritik bir adım olan ultrasantrifüjlemeyi içerir. Özellikle sezyum klorür (CsCl) veya iyodiksanol gradyanı kullanılarak yapılan ultrasantrifüjleme, AAV partiküllerini hücresel kalıntılardan ve diğer safsızlıklardan ayırmak için standart bir yöntemdir⁸. Bu adım, AAV vektörlerinin istenen saflığını ve konsantrasyonunu elde etmek için çok önemlidir ve bu da gen iletimindeki etkinliklerini doğrudan etkiler⁸. Yaygın kullanımına rağmen, geleneksel ultrasantrifüjlemenin dezavantajları vardır. Örneğin, bu yöntemden elde edilen AAV vektörlerinin verimi değişken ve genellikle düşük olabilir, bu da özellikle in vivo çalışmalar veya büyük hayvan modelleri için büyük miktarlarda yüksek titreli vektörlere ihtiyaç duyulduğunda önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır⁹.

AAV vektör kalitesinin bir diğer kritik yönü, dolu parçacıkların boş parçacıklara^{oranıdır 10}. AAV preparatları genellikle bu parçacıkların bir karışımını içerir; Bununla birlikte, sadece tam parçacıklar terapötik genetik materyali içerir. Yüksek oranda boş parçacıkların varlığı, gen iletiminin verimliliğini önemli ölçüde azaltabilir¹⁰. Bu nedenle, dolu parçacıkların boş parçacıklara oranının değerlendirilmesi ve optimize edilmesi, AAV vektörlerinin etkinliğinin değerlendirilmesinde önemli bir parametredir. Geleneksel yöntemler, AAV vektörleri üretebilse de, genellikle bu oranı tutarlı bir şekilde kontrol etmekte zorlanır ve bu da vektör potensinde¹⁰ değişikliklere yol açar.

Burada, hücre yemeklerinde emek yoğun HEK293T hücre kültürleri kullanmaktan arınmış bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran, polietilen glikol/sulu iki fazlı bölmelemeyi iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile entegre eden benzersiz bir yöntem sunulmaktadır. AAV vektör saflığı, SDS-PAGE ve gümüş boyama ile doğrulanır ve dolu-boş parçacık oranı, in vivo çalışmalar¹¹ için kalite standartlarını karşılayan transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak belirlenir.

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktiflerin, plazmitlerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Kullanılan tamponların bileşimi Ek Dosya 1'de verilmiştir.

1. Plazmid hazırlığı

1. Plazmitleri (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) E. coli'de dönüştürün.
   NOT: Plazmit amplifikasyonu için herhangi bir E.coli suşu kullanılabilir. Bazı plazmitler için, NEB stabil gibi özel yetkin hücreler plazmit verimini artırabilir. Bu protokolde kullanılan üç plazmit pAAV-GOI'dir: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 ve pAAV-Cap: pAAV-RC6.
2. Uygun seçici antibiyotikleri içeren LB ortamında optimal hacimde 37 ° C'de 16-18 saat boyunca bakteri üremelidir.
   NOT: NEB kararlı hücreleri kullanırken, 18-20 saat boyunca 30 ° C'de kültürleyin.
3. E. coli'yi santrifüjleyerek plazmit DNA'sını hasat edin. 4000 x g, 4 °C'de 15 dakika boyunca kültür ortamı.
4. Süpernatan sıvıyı santrifüj şişesinden dikkatlice bir atık kabına dökün ve plazmit DNA'yı peletten büyük ölçekli bir endotoksin içermeyen plazmit saflaştırma kiti ile saflaştırın.
   NOT: Yavaşça döktüğünüzden ve sıçramasını önlediğinizden emin olun.
5. Bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçün.
   NOT: OD₂₆₀ / OD₂₈₀ oranını kontrol ederek DNA saflığını kontrol edin. Saf DNA oranı yaklaşık 1.8'dir. Daha sonraki ko-transfeksiyon aşaması için DNA konsantrasyonu 1 μg/μL'nin üzerinde olmalıdır. Bir kriyoviyalde 500 μL %50 gliserole 500 μL gece kültürü ekleyerek bakteriyel gliserol stokları yapın ve -80 °C'de saklayın.

2. HEK293T hücrelerinin hazırlanması

1. % 10 FB HEK293T S içeren DMEM yüksek glikoz ortamlı hücreleri 10 katmanlı bir hücre fabrikasına (CF10) tohumlayın ve hücrelerin gece boyunca inkübatörde büyümesine izin verin.
   NOT: Sağlam AAV üretimi için en uygun koşula sahip olmak için 293T hücrelerinin geçişleri 10'dan az olmalıdır. Mümkünse, şu anda kültür ortamına antibiyotik eklemeyin. CF10, 150 mm'lik bir hücre kültürü kabının yaklaşık 42 katı büyüme yüzey alanına sahiptir. Hücre büyümesini mikroskop altında kontrol etmek için aynı hücre yoğunluğunu 150 mm'lik bir hücre kültürü kabına tohumlayın. 1075 mL hücre süspansiyonu hazırlayın, 150 mm'lik bir tabağa 25 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve kalanını CF10'a ekleyin.
2. Transfeksiyondan önceki ertesi gün hücre birleşmesini kontrol edin.
   NOT: Hücreler, mikroskop altında gözlemleyerek transfeksiyon anında %80-90 birleşme noktasına ulaşmalıdır.

3. AAV plazmitlerinin üçlü transfeksiyonu

1. CF10 başına 2.5-5 mg toplam DNA ile 1.2: 1: 1 molar orana sahip olmak için gereken her bir plazmitin miktarını (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-serotip) hesaplayın.
   NOT: Üç plazmitin molar oranı, optimal transfeksiyon etkinliği için değişken olabilir. Bu CF10 ayarına geçmeden önce küçük ölçekli bir ayarda test etmek daha iyidir. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 ve pAAV-RC6, örnek olarak AAV6-CMV-GFP virüsünü yapmak için kullanılır. PEI hesap makinesi formülü Tablo 1'de listelenmiştir.
2. 350 mL OptiMEM'i 500 mL'lik steril bir şişeye koyun.
3. Üç plazmit DNA'sını da Opti-MEM içeren şişeye ekleyin. İyice karıştırın.
4. 15 mL 1 mg / mL polietilenimin (PEI) çözeltisi (1: 3 μg DNA / μg PEI oranı) ekleyin. OptiMEM/DNA/PEI karışımını 30 saniye boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı çalkalayın.
   NOT: Baloncuk yapmakta bir sakınca yoktur.
5. Karışımı oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.
   NOT: Daha uzun inkübasyon, transfeksiyon verimliliğini azaltabilir.
6. OptiMEM/DNA/PEI solüsyonunu, 10 mM HEPES ve% 2 FBS ile 700 mL DMEM düşük glikoz içeren 1 L'lik şişeye ekleyin. İyice karıştırın.
   NOT: Bu çalışmada, DMEM'deki düşük glikoz, ko-transfeksiyondan sonra daha iyi AAV vektör üretimi göstermiştir. HEPES ilavesi, hücrelerin daha iyi bir durumda kalmasına yardımcı olur. Şişeyi yavaşça çevirerek karıştırın. Çok fazla baloncuk oluşturmaktan kaçının.
7. CF10'u inkübatörden çıkarın ve ortamı bir atık kabına vakumlayın.
   NOT: CF10'u kaputun içindeki yüzeye koyun ve bir tarafını kademeli olarak yukarı kaldırın, hücreleri ayırmadan ortamı yavaşça vakumlayın.
8. Transfektan karışımını dikkatlice CF10'a ekleyin. On katmanın tamamının ortamla kaplandığından emin olun.
   NOT: 150 mm'lik tabağa 25 mL transfektant karışımı ekleyin. Hücreleri hasada kadar günlük olarak izleyin. Kalan transfektant karışımını yavaşça dökerek CF10'a ekleyin. CF10'u çok dikkatli bir şekilde döndürün ve her katman için eşit hacim sağlayın.
9. CF10'u 72-96 saat boyunca inkübatöre geri koyun.
   NOT: AAV vektörlerinin ne zaman hasat edileceğine karar vermek için 150 mm'lik monitör çanağını kontrol edin. Hücreler tam bir AAV yükü ile çok kolay bir şekilde ayrıldığında, hasat zamanı gelmiştir.

4. AAV vektörlerinin toplanması

1. CF10'u kuvvetlice çalkalayarak transfeksiyondan 3-4 gün sonra virüsü hasat edin. Ortamı 250 mL'lik konik tüplere dökün ve virüsü 4 °C'de 20 dakika boyunca 4000 x g'da döndürün.
   NOT: Bu protokolde kullanılan AAV6 serotipi için, %80 AAV çoğunlukla peletteki hücresel materyale bağlı kalacaktır. Ve %20'lik AAV medyaya gizlendi. Bu oranlar diğer AAV serotipleri için farklılık gösterebilir.
2. Arıtılmış süpernatanı 0,45 μm filtre ünitesi ile filtreleyin ve yağış için saklayın.
3. CF10'u 500 mL DPBS 1x tampon ile durulayın ve 4000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
4. Bir vakum sistemi ve aspirasyonlu bir pipet kullanarak süpernatanı atın. Saflaştırmaya kadar -80 ° C'de CF10 başına 20 mL AAV lizis tamponu ekleyin.
   NOT: Daha sonra AAV ekstraksiyonu için AAV lizatını 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
5. Filtrelenmiş süpernatanı çıkarın,% 8'lik bir nihai konsantrasyon için% 40 PEG-2.5 M NaCl çözeltisi ekleyin ve en az 3 saat veya gece boyunca bir orbital döndürücü üzerinde soğuk bir odada inkübe edin.
   NOT: 100 mL süpernatan için 25 mL %40 PEG-2.5 M NaCl çözeltisi ekleyin.
6. Virüsü 4000 ° C'de 30 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyerek çökeltin.
   NOT: Karışımı santrifüjleme için 250 mL konik tüplere aktarın.
7. Süpernatanı çıkarmak için aspirat edin ve peletleri askıya almak için 5-10 mL AAV HEPES yeniden süspansiyon tamponu ekleyin. Aşağı akış saflaştırmasına devam etmek için 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın veya -80 °C'de saklayın.

5. AAV ekstraksiyonu

1. Virüs peletini 37 °C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika çalkalayıcı ile çözdürün.
   NOT: AAV lizatını tamamen erimesi için girdaplayın.
2. -80 °C %100 etanol banyosunda 20-30 dakika dondurun.
   NOT: Alternatif olarak, dondurma döngüsü kuru buzla çevrili soğuk bir %100 etanol kabı ile yapılabilir.
3. 3-4 kez donma/çözülme yapın ve gerekirse arada girdap yapın.
   NOT: Bu döngü, dondurma adımında duraklatılabilir. AAV lizatını aşağı akış çalışmasına kadar -80 °C'de saklayın.
4. AAV lizatını (adım 5.3'ten itibaren) ve yeniden askıya alınan AAV'yi (adım 4.7'den itibaren) 37 ° C'lik bir su banyosunda 10-15 dakika boyunca bir çalkalayıcı ve girdap ile çözün.
   NOT: Tamamen eridiğinden ve karıştırdığından emin olun.
5. AAV lizatına Benzonaz nükleaz (250 birim / μL) ekleyin ve 50 birim / mL'lik bir nihai konsantrasyon için AAV'yi yeniden süspanse edin. Çözümü girdap.
6. 37 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.
   NOT: Çözünmesi, ısınması ve iyice karışması için zaman tanımak için bir su banyosunda% 10 sodyum deoksikolat alikotlarını çıkarın.
7. %0,5'lik bir nihai konsantrasyon için %10 sodyum deoksikolat ekleyin ve 37 ° C'de bir çalkalayıcı ile 30 dakika inkübe edin.
   NOT: Hücrelerden AAV salınımını arttırmak için sodyum deoksikolat kullanıldı.
8. Ham AAV çözeltisini 2 mL santrifüj tüplerine dağıtın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
9. Süpernatanı 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   NOT: Süpernatanı aktarmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Peletleri atın.
10. Eşit miktarda kloroform ekleyin ve 1-2 dakika girdaplama yaparak AAV'yi çıkarın.
    NOT: Çözelti opak, beyaz, süt benzeri olmalıdır.
11. Sütlü çözeltiyi 2 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve eşit şekilde dağıtın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
12. Üst pembe tabakayı dikkatlice pipetleyin ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
    NOT: Kloroform/protein katmanlarını rahatsız etmeyin.
13. Bir pipet kullanarak son hacmi ölçün. Ham AAV-PEG-Sülfat hacim tablosuna (Tablo 2) göre, uygun hacimlerde %50 (NH4)_{2 S04} ve %40 PEG çözeltisini karıştırın. 2 dakika boyunca girdap.
14. Karışımı eşit şekilde dağıtmak için 2 mL santrifüj tüplerine aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin
15. 22 G'lık bir iğne ve 3 mL'lik bir şırınga kullanarak alt tabakayı toplayın. AAV'yi 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve daha sonra iyodiksanol gradyanları ultrasantrifüjlemesi için 4 ° C'de saklayın.

6. İodyiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile AAV saflaştırma

1. Kullanılan ultrasantrifüj tüplerinin sayısına göre AAV'yi yüklemeden önce iyodiksanol gradyanlarını taze olarak hazırlayın (Tablo 3).
   NOT: Katmanları gözlemlemek için fenol kırmızısı kullanılmıştır.
2. Her bir çözeltiyi, 16 G'lik uzun bir iğne ile tutturulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanarak yavaşça yuvarlak tepeli polipropilen ultrasantrifüj hızlı sızdırmaz bir tüpe yerleştirin. Baloncuklardan kaçının.
3. 22 G'lik bir şırınga ile gradyanın üzerine dikkatlice 17 mL'ye kadar AAV çözeltisi ekleyin. Tüpü doldurmak için AAV diyaliz tamponu kullanın.
   NOT: Ultrasantrifüj tüpündeki duvara damla yükleyerek AAV çözeltisini ekleyin. Degrade katmanlarını rahatsız etmeyin.
4. Ultrasantrifüj tüplerini elektrikli bir sızdırmazlık maddesi ile kapatın.
   NOT: Tüpleri ultrasantrifüje göndermeden önce ±0,2 g farkla dengeleyin.
5. 4 °C'de bir Ti70 rotorunda 2 saat boyunca 350.000 x g'da santrifüjleyin.
6. Tüpleri rotordan dikkatlice çıkarın ve ultrasantrifüj tüpleri rafına yerleştirin.
   NOT: Degradelerin bozulmadığından emin olun.
7. Aşağıdaki adımları izleyerek AAV kesirlerini toplayın:
   1. Tüpü bir stand tutucu üzerinde sabitleyin.
   2. Ultrasantrifüj tüplerini 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 19 G'lık bir iğne ile %40-60'lık arayüzün biraz altına delin.
      NOT: İğnenin açıklığı yukarı bakacak şekilde %40 eğime bakacak şekilde olmalıdır.
   3. 16 G'lik bir iğne ile tüpün üstüne bir delik açın.
   4. Tüp başına 5 mL'ye kadar toplayın. Protein kontaminasyonunu %25-40 arayüzde toplamaktan kaçının.
   5. Her ultrasantrifüj tüpü için tekrarlayın.
      NOT: AAV fraksiyonlarını 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

7. İkinci tur iyodiksanol gradyanları ultrasantrifüjleme

NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Bu adım, daha yüksek kaliteli bir tam AAV kapsid için boş AAV oranını azaltmaktır.

1. AAV'yi >1: 1'i AAV diyaliz tamponu ile seyreltin.
   NOT: Ultrasantrifüjlemenin ilk turundan toplanan AAV, %40 iyodiksanol tabakasındaydı. %30'luk iyodiksanol tabakasının üzerine yüklenebilmesi için en az %50 oranında seyreltilmesi gerekir.
2. Her bir çözeltiyi (Tablo 4) 16 G'lik bir iğne kullanarak bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin ve yavaşça 10 mL'lik bir şırınga takın. Baloncuklardan kaçının.
3. 22 G'lik bir şırınga ile gradyanın üzerine dikkatlice 20 mL seyreltilmiş AAV çözeltisi ekleyin. Tüpü doldurmak için AAV diyaliz tamponu kullanın.
4. 6.4 ile 6.7 arasındaki adımları tekrarlayın.

8. AAV diyalizi ve konsantrasyonu

1. Yeni bir 18 G iğne ve 10 mL şırınga kullanarak AAV virüsünü diyaliz kasetine aktarın. Virüsü yavaşça kasete enjekte edin ve içindeki havayı çıkarın.
2. AAV diyaliz tamponu içeren behere bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakasına yerleştirin.
3. Diyaliz kasetini bir şamandıra şamandırası ile diyaliz tamponuna koyun. 4 °C'de karıştırın. AAV diyaliz tamponunun 2-3 katını değiştirin.
   NOT: Kasetin yüzmesine ve arabellek değişimini gerçekleştirmesine izin vermek için yeterli arabellek kullanın. Beheri alüminyum folyo ile örtün.
4. 18 G'lik bir iğne ile tutturulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, virüsü kasetten bir santrifüj filtre ünitesine toplayın.
5. 4,000 x g'da 4 ° C'de 15-30 dakika santrifüjleyin.
   NOT: AAV'yi AAV diyaliz tamponu ile 2-3 kez çalın. AAV'yi filtrenin üstünde kalan ~200 μL olana kadar konsantre edin.
6. Konsantre AAV'yi filtre ünitesinden toplayın. Filtreyi başka bir 300 μL AAV diyaliz tamponu ile durulayın ve konsantre AAV'ye aktarın.
7. 1 mL tüberkülin luer kayma şırıngası kullanarak virüsü 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün. En az hacim kaybını sağlamak için, havayı filtreden 2-3 kez itmek için 10 mL şırıngayı kullanın.
8. Saflaştırılmış AAV virüsünü titrasyon için geçici olarak 4 °C'de saklayın.
   NOT: Virüsü titre edin, alikotlayın ve 1 hafta içinde -80 °C'de saklayın.

9. AAV virüsü titrasyonu

NOT: Saflaştırılmış AAV'yi titre etmek için TaqMan kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanıldı.

1. AAV vektörlerini DNaz I ile muamele edin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin, ardından 95 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
   NOT: 10 μL reaksiyona örnek olarak 2 μL AAV virüs örneği, 1 μL DNaz, 1 μL DNaz tamponu ve 6 μL H_2Okullanılır. PCR tüplü bir termodöngüleyicide gerçekleştirilebilir.
2. AAV ekleme bölgesini hedefleyen astar setlerini hazırlayın.
   NOT: Hedefler, AAV yapısındaki destekleyici, transgen ve raportör olabilir. Primerler Tablo 5'te listelenmiştir.
3. DNA plazmid standartlarını (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ve 0.0001 pg/μL) ve negatif bir kontrol (H₂O) hazırlayın.
4. Primerler de dahil olmak üzere qPCR ana karışımını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
5. Standartları ve numuneleri üç nüsha halinde bir PCR plakasına yerleştirin. qPCR karışımını standartlara ve numunelere ekleyin. Plakayı kapatın ve üreticinin talimatlarına göre qPCR reaksiyonunu gerçekleştirin.
   NOT: Reaksiyon koşulları malzemelere/reaktiflere ve alete bağlıdır. Hızlı ve konvansiyonel PCR döngüleri uygulanabilir.
6. AAV virüs titresini hesaplayın.
   NOT: Bu protokoldeki numune konsantrasyonu, orijinal numunelerden 1/10 seyreltmedir.
7. AAV virüsünü 1.5 mL'lik tüplerde alın ve bir aya kadar 4 ° C'de saklayın ve uzun süre -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Depolama için donma/çözülme döngülerinden kaçının. İn vivo deneyler için kullanıldığında, iki kez alikottan fazla çözülme kullanmayın.

10. AAV'nin kalite kontrolü

NOT: AAV virüsleri, bir SDS-PAGE jeli kullanılarak SDS-PAGE gümüş lekesi ile saflık açısından karakterize edildi ve ticari olarak temin edilebilen bir boyama kiti kullanılarak boyandı.

1. 3 x 10⁹ vg AAV virüs örneğini Laemmli tamponu ile denatüre edin.
   NOT: Kontrol olarak bir referans AAV virüsü kullanın. AAV6-CMV-GFP referanslı tam kapsid kullanılır.
2. Denatüre AAV'yi %4-20 gradyanlı bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve 50 dakika boyunca 180 V'ta çalıştırın.
3. Jeli elektroforez plakasından çıkarın. Jeli, üreticinin talimatlarına göre gümüş bir boyama kiti ile boyayın.
4. AAV kapsid proteinleri VP1, VP2 ve VP3'ü kontrol edin.
   NOT: Saf AAV virüsü yalnızca VP1, VP2 ve VP3 kapsid proteini içerir. Saf değilse, jel üzerinde diğer protein bantları görülebilir.
   NOT: Morfolojik bütünlüğü ve dolu/boş oranını değerlendirmek için negatif boyanmış rekombinant AAV viryonlarının transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yapıldı.
5. Bir cımbızla bir EM ızgarası alın ve ızgaranın parlak tarafı yukarı bakacak şekilde bankın üzerine koyun.
6. 5 μL AAV örneğini ızgaraya pipetleyin ve buharlaşarak kurumasını bekleyin.
   NOT: Gerekirse AAV'yi seyreltin. 10¹² vg/mL ortalama bir titredir. Izgaranın kuruması 30-60 dakika sürebilir.
7. Izgarayı, ızgara üzerine yaklaşık 200 μL H₂O ile damla damla pipetleyerek yıkayın.
8. Izgaranın yanına dikey olarak bir kromatografi kağıdını yavaşça yerleştirerek fazla suyu alın.
9. Izgaraya 5 μL% 2 Uranil Asetat çözeltisi pipetleyin. 5 dakika inkübe edin ve yukarıda belirtildiği gibi fitilleyin. Izgaranın kurumasını bekleyin.
10. AAV parçacıklarını bir transmisyon elektron mikroskobu altında (50.000 kat büyütmede) görselleştirin. Viral genoma sahip viral kapsidler homojen beyaz altıgenler olarak görünürken, boş kapsidler beyaz kenarlı ancak koyu renkli bir merkeze sahip altıgenler olarak görünecektir.
11. Tam vs'nin yaklaşık yüzdesini belirlemek için en az 100 parçacığı rastgele sayın. boş AAV parçacıkları.

Sonuçlar

Bu ayrıntılı adım adım protokolde, büyük ölçekli bir araştırma laboratuvarı ortamında CF10 ile yüksek titre ve yüksek kaliteli AAV virüsü yapmak için standartlaştırılmış bir platform gösterilmiştir. Geleneksel hücre kültürü kapları ile karşılaştırıldığında, CF10 büyük miktarlarda hücreyi kültürlemek ve AAV virüsü üretmek için uygun bir yol sağlar (Şekil 1). Optimal bir ortamdaki hücrelerin viral üretimi teşvik edip edemeyeceğini belirlemek için çeşitli kültür koşulları test edildi. 10 mM HEPES ve% 2 FBS ile desteklenmiş düşük glikoz DMEM, en iyi AAV üretimini gösterdi.

AAV'leri saflaştırmak için çeşitli protokoller test edildi. Çoğu prosedür düşük virüs verimine ve AAV kapsidlerinin safsızlığına sahiptir. Burada, hem hücre peletlerinden hem de kültür ortamından AAV'yi birleştiren revize edilmiş bir saflaştırma protokolü geliştirilmiştir (Şekil 2). AAV'nin %80'inin hücrelerde olduğunu ve diğer %20'sinin hücrelerden salgılanan kültür ortamında olduğunu bulduk. AAV'nin her iki kısmı da serbest DNA'yı çıkarmak için DNaz ile muamele edildi. AAV'yi hücrelerden daha fazla salmak için sodyum deoksikolat kullanıldı. AAV'ler daha sonra kloroform ekstraksiyonu ile ekstrakte edildi ve ardından sulu iki fazlı bir bölümleme yapıldı. Bu adımlar, çoğu protein kirleticisinin uzaklaştırılmasına izin verdi. AAV, amonyum sülfat fazında çözünür kalır.

Kalan kirleticiler, süreksiz bir iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile uzaklaştırıldı (Şekil 3A). Gradyan, özellikle ikinci tur iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile boş AAV kapsidlerinin çıkarılmasında da yardımcı oldu.

AAV virüsünün saflığı gümüş boyama ile belirlendi. AAV kapsid proteini, VP1, VP2 ve VP3'e karşılık gelen ve %90'dan daha yüksek saflıkta üç ana bant elde edildiğinde, AAV virüsü in vivo kullanım için uygundu (Şekil 3B). AAV tam kapsid/boş kapsid oranına TEM ile erişilmiştir (Şekil 3C). Sadece bir transgen ekine sahip tam bir kapsid, hedeflenen dokuda transgen ekspresyonuna izin verecektir. Boş kapsidin yüksek bir kısmı da AAV kapsidine karşı bir bağışıklık tepkisine neden olabilir. Bu kalite kontrolleri, kullanımdan önce üretilen ve saflaştırılan her AAV virüsü için gereklidir.

Şekil 1: HEK293T hücreleri üçlü transfeksiyon yöntemi ile AAV üretiminin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: AAV saflaştırmasının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ve AAV virüs saflığı doğrulaması ile AAV saflaştırması. (A) İodiksanol gradyan katmanları ve hasat için iğnenin konumu. (B) Kapsid içeriğini ve saflığını değerlendiren temsili jel. M: moleküler işaretleyici; R: referans AAV6 tam kapsid; S1: bir tur ultrasantrifüjleme ile şirket içi yapılmış AAVDJ kapsid; S2: iki tur ultrasantrifüjleme ile şirket içi yapılmış AAVDJ kapsid; S3: şirket içi AAV6 kapsid yapımı. (C) AAV'nin elektron mikroskobu görüntüsü. Saflaştırmadan sonra toplanan virüs. Viral bir genom içeren viral kapsidler homojen beyaz altıgenler olarak görünürken, boş kapsidler beyaz kenarlı ancak koyu renkli bir merkeze sahip altıgenler olarak görünür. Ölçek çubuğu: 100 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: AAV ambalajı için PEI hesaplayıcısı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Ham AAV-PEG-Sülfat hacim tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: İodiksanol gradyanının hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: İkinci tur iyodiksanol gradyanının hazırlanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 5: AAV titrasyon primerleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Çalışma için kullanılan tamponların bileşimleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Burada, bir hücre fabrikası platformu (CF10) kullanılarak yüksek titreli ve yüksek kaliteli AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için teknik olarak gelişmiş bir protokol tanıtılmaktadır ve bu, geleneksel hücre kültürü çanağı yöntemlerine göre önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir. Hücre fabrikalarının kullanılması, AAV virüslerinin üretimini daha verimli bir şekilde kolaylaştırarak, büyük hacimli hücrelerin yetiştirilme sürecini basitleştirir¹. Ayrıca, özellikle 10 mM HEPES ve% 2 FBS ile desteklenmiş düşük glikoz DMEM ile kültür koşullarını optimize ederek, hücresel ortamın virüs verimindeki kritik rolünü gösteren önemli ölçüde artmış bir viral üretim doğrulandı.

Hem hücre peletlerinden hem de kültür ortamından AAV'yi birleştiren revize edilmiş saflaştırma protokolü, mevcut birçok protokolde görülen düşük virüs verimi ve safsızlık gibi yaygın bir sorunu ele almaktadır. Kloroform ekstraksiyonu ve sulu iki fazlı bölme adımları, çoğu protein kirleticisini etkili bir şekilde uzaklaştırır ve AAV, amonyum sülfat fazında çözünür kalır. Geleneksel gradyan ultrasantrifüjleme yöntemlerinin aksine, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile birleştirilmiş PEG / sulu iki fazlı bölmeleme kullanılarak AAV vektörlerinin hem verimindeki hem de saflığındaki iyileşme, PEG / sulu iki fazlı bölme ile gelişmiş başlangıç ayırma, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme ile rafine saflık ve kirletici birlikte saflaştırmada azalmaya bağlanabilir¹². İlk olarak, ultrasantrifüjlemeden önce PEG/sulu iki fazlı bölmenin tanıtılması, AAV partiküllerinin hücresel kalıntılardan ve diğer kirleticilerden ilk ayrılmasını önemli ölçüde iyileştirir. Yüksek moleküler ağırlıklı bir polimer olan PEG, sulu bir çözelti ile karıştırıldığında iki farklı faz^{oluşturur 13}. AAV vektörleri, tercihen bu fazlardan birine (genellikle PEG açısından zengin faz) bölünme eğilimine sahipken, birçok kirletici ve safsızlık diğer^13'e bölünür. Bu seçici bölme, AAV partiküllerini etkili bir şekilde konsantre eder ve ultrasantrifüjlemeden önce bile safsızlıkların önemli bir bölümünü giderir, böylece verimi artırır ve ultrasantrifüjleme adımı^13'e giren kirletici yükünü azaltır. İkincisi, iyodiksanol gradyan ultrasantrifüjleme, AAV vektörlerinin saflığını daha da rafine eder. İyonik olmayan, izo-ozmolar gradyan bir ortam olan İodiksanol, geleneksel CsCl gradyanlarına kıyasla daha yumuşak ve kontrollü bir ayırma sağlar¹⁴. Bu gradyanda, AAV parçacıkları, kaldırma kuvveti yoğunluğuna¹⁴ karşılık gelen gradyanda bir konuma göç eder. Daha da önemlisi, bu işlem, vektör kalitesinin çok önemli bir belirleyicisi olan dolu AAV kapsidlerini (genetik yükü içeren) boş kapsidlerden (genetik materyal eksikliği) ayırmada etkilidir. İodiksanolün izo-ozmolar doğası ayrıca AAV kapsidlerinin bütünlüğünü CsCl gibi hiperosmolar ajanlardan daha iyi korur ve potansiyel olarak daha yüksek bozulmamış, fonksiyonel vektör^{verimine yol açar 14}. Son olarak, geleneksel ultrasantrifüjleme yöntemleri, özellikle CsCl gradyanlarını kullananlar, bazen AAV vektörlerine¹⁵ benzer yüzdürme yoğunluklarına sahip kirleticileri birlikte saflaştırabilir. Ön adım olarak PEG bölümlemeyi kullanarak, bu tür kirleticilerin yükü ultrasantrifüjlemeden önce büyük ölçüde azaltılır¹³. Kirletici yükündeki bu azalma, iyodiksanol gradyanının AAV vektörlerinin saflaştırılmasında daha etkili ve seçici bir şekilde çalışabileceği ve daha yüksek saflığa yol açabileceği^{anlamına gelir 15}.

AAV vektörlerinin saflığı ve kalitesi, gümüş boyama ve TEM¹¹ ile titizlikle değerlendirilir. AAV kapsid proteinleri VP1, VP2 ve VP3'e karşılık gelen ve %90'ı aşan saflıkta üç ana bandın gözlemlenmesi, bu AAV vektörlerinin in vivo kullanım için uygunluğunu gösterir. Dolu-boş kapsid oranını belirlemek için TEM analizi özellikle önemlidir, çünkü boş kapsidlerin yüksek bir oranı gen iletim verimliliğinin azalmasına ve potansiyel bağışıklık tepkilerine yol açabilir¹¹. Bu kalite kontrolü, gerekli olmasına rağmen, prosedürel karmaşıklığı artırır ve ek teknik uzmanlık gerektirebilir.

Sonuç olarak, protokol, AAV vektörlerinin üretiminde, özellikle ölçeklenebilirlik ve saflık açısından önemli teknik ilerlemeler sunmaktadır. Bununla birlikte, saflaştırma prosesi ile ilişkili karmaşıklıklar ve özel ekipman ve uzmanlık ihtiyacı, belirli araştırma ortamlarında uygulanması için hala küçük bir sınırlama olabilir. Bu tekniklerin daha da iyileştirilmesi ve basitleştirilmesi, bu yaklaşımı gen terapisi araştırmaları alanında daha erişilebilir ve yaygın olarak uygulanabilir hale getirebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T/17 cells	ATTC	CRL-11268
(NH4)2SO4	Millipore Sigma	1.01217.1000
0.5 M EDTA	MilliporeSigma	324506-100ml
1 mL Henke-Ject syringe	Fisher Scientific	14-817-211
10% pluronic F68 solution	Fisher Scientific	24-040-032
10x Tris/Glycine/SDS Buffer	Biorad	1610732
1M HEPES	Fisher Scientific	15-630-080
2% Uranyl Acetate Solution	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4%–20% Precast Protein Gels	biorad	4561094
40% PEG solution	Sigma	P1458-50ML
AAV6 reference full capsids	Charles River Laboratories	RS-AAV6-FL
Accutase Cell Detachment Solution	Fisher Scientific	A6964-100ML
Benzonase	Sigma	E1014-25KU
BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm	Fisher Scientific	12-556-003
Centrifugal Filter Unit	MilliporeSigma	UFC905024
Corning PES Syringe Filters	Fisher Scientific	09-754-29
Dialysis Cassettes, 10 K MWCO	Fisher Scientific	PI66810
Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 µm	Fisher Scientific	FB12566506
Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 µm	Fisher Scientific	FB12566507
Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 µm	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM high glucose	Fisher Scientific	10-569-044
DMEM low glucose	Fisher Scientific	10567022
DNase	NEB	M0303S
DPBS 1x	Fisher Scientific	14-190-250
Fetal Bovin Serum (FBS)	Biowest	S1620
Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu-50
glycerol	Sigma	G5516-1L
KCl	Sigma	P9541-500G
LB agar	Sigma	L2897-250G
LB broth	Fisher Scientific	BP9732-500
MgCL2·6H2O	Sigma	M9272-100G
NEB stable competent cells	NEB	C3040H
Nest Biofactory 10 chamber	MidSci	771302
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	740424
Opti-MEM	Fisher Scientific	31-985-088
OptiPrep Density Gradient Medium	Millipore Sigma	D1556-250ml
pAAV-CMV-GFP	Addgene	105530
pAAV-DJ	Cell BioLab	VPK-420-DJ
pAAV-RC6	Cell BioLab	VPK-426
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Promega	V3011
PEI Max	Polysciences, Inc	49553-93-7
Pen-Strep	Fisher Scientific	15-140-163
Phenol red	Millipore Sigma	1.07242.0100
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	24612
QuickSeal tube	Fisher Scientific	NC9144589
Sodium Chloride	Sigma	1162245000
sodium deoxycholate	Millipore Sigma	D6750-100G
Taqman Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	Beckman Coulter	337922
Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32209