Tümör Mikroçevresinin PET Görüntülemesi için Bir Sentez Modülünde [68Ga] Ga-3BP-3940'ın Otomatik Hazırlanması

Özet

Bu araştırma, fibroblast aktivasyon proteininin PET görüntülemesi için GAIA V2 sentezleyici ile [⁶⁸Ga] Ga-3BP-3940 üretimi için otomatik süreci açıklamaktadır. Üç test partisi üzerinde gerçekleştirilen kalite kontrol testlerinin sonuçları da sunulmaktadır.

Özet

Tümör mikroçevresinin pozitron emisyon tomografisi görüntülemesi için fibroblast aktivasyon proteinini hedefleyen bir moleküler görüntüleme probu olan 3BP-3940'ın otomatik galyum-68 radyo-işaretlemesi için GAIA sentez modülünde hızlı ve verimli bir yöntem geliştirilmiştir. Reaksiyon koşulları, asetat tamponu (nihai konsantrasyon: 0.1 M), bir anti-radyoliz ajanı olarak metiyonin (nihai konsantrasyon: 5.4 mg / mL) ve 30 μg 3BP-3940, 98 ° C'de 8 dakika ısıtma ile içeriyordu. Yüksek saflıkta radyoaktif işaretli bir ürün elde etmek için bir C₁₈ kartuşu üzerinde son bir saflaştırma adımı gerekliydi. Buna karşılık, jeneratör tarafından üretilen ⁶⁸Ga, bir katyon değişim kartuşu üzerinde bir konsantrasyon adımı olmadan doğrudan kullanıldı. Üç doğrulama partisinin üretimi, yöntemin güvenilirliğini doğruladı ve hem radyo-HPLC (% 99.1 ± % 0.1) ± radyo-TLC (% 99.2 ± 0.1) ile yüksek radyokimyasal saflıkta (RCP) 22.3 0.6 dakikada [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın sentezine izin verdi. Radyo-HPLC ile ölçülen RCP değerlerine dayanan ortalama radyokimyasal verim %74.4 ± %3.3 idi. Radyoaktif işaretli ürünün stabilitesi, hazırlandıktan sonra 4 saate kadar gösterilmiştir. Bu protokol, klinik bir ortama kolayca aktarılabilen [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın hazırlanması için güvenilir, hızlı ve verimli bir metodoloji sağlar.

Giriş

Son yıllarda, tümör mikroçevresinin (TME) hedef alınması, tanı ve tedavi uygulamalarında büyük ilgi görmüştür¹. TME içindeki hücre tiplerinin, sinyal moleküllerinin ve hücre dışı matris (ECM) makromoleküllerinin bolluğu, çok çeşitli potansiyel moleküler hedefler sunar². Yerleşik ve sızan konakçı hücreler arasında, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), normal fibroblastlardan fenotipik olarak farklı olan TME içinde farklı bir fibroblast alt kümesi oluşturur. CAF'ler, benzersiz hücresel ve moleküler özellikler sayesinde tümör ilerlemesi, metastazı, immün kaçış ve tedavi direncinde çok önemli roller oynar³. Bu mezenkimal hücreler, fibroblast aktivasyon proteininin (FAP) ekspresyonu ile işaretlenmiş aktive edilmiş bir fenotip sergiler. Moleküler olarak, CAF'ler karmaşık bir dizi sitokin, kemokin, büyüme faktörü (örneğin, TGF-β, IL-6 ve CXCL12) ve ECM proteinleri (örneğin, kollajen, fibronektin), ECM'yi yeniden şekillendiren ve pro-tümörjenik bir ortamı teşvik eden⁴.

CAF zarının hücre dışı yüzeyinde aşırı eksprese edilen ve lokalize olan oldukça spesifik bir protein olan FAP, özellikle nükleer tıp ve radyofarmasötik uygulamalar için güvenilir bir moleküler hedefin tüm özelliklerini gösterir⁵. Bu bağlamda, bir DOTA grubu ile işlevselleştirilen FAP'ın kinolin bazlı küçük moleküllü inhibitörleri (FAPI) geliştirilmiş ve hızlı bir şekilde klinik kullanıma sunulmuştur ^6,7,8. Spesifik olarak, pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme için FAPI-04 ve FAPI-46, galyum-68 (β⁺ yayıcı, t_1/2 = 68 dakika) ile radyoaktif olarak işaretlenmiştir^fibrotik hastalıklar, kardiyoloji ve onkoloji ^8,9, özellikle [18 F]florodeoksiglukozun ([¹⁸F]FDG) sınırlı faydaya sahip olduğu kanserler için¹⁰. Bununla birlikte, onkoloji ve malign olmayan hastalıkların görüntülenmesine katkıları yadsınamaz olsa da, küçük moleküllü FAPI'ler, özellikle sağlıklı dokunun istenmeyen ışınlanmasına yol açabilen suboptimal intratümöral kalma süreleri nedeniyle, hedefe yönelik radyonüklid tedavi (TRT) uygulamaları için belirli sınırlamalar sergilemektedir¹¹. Bu sorunu ele almak için, çok değerlikli ligandların ^11,12 tasarımı veya kısa yarı ömürlere sahip terapötik radyonüklidlerin^kullanımı 13,14,15 gibi çeşitli stratejiler araştırılmıştır. FAP için yüksek afiniteye sahip ve yüksek oranda hücre içselleştirmesini tetikleyen yeni moleküler iskeleler de geliştirilmiştir.

Bunlardan biri psödopeptit türevi FAP-2286'dır. Siklize edilmiş ve bir 1,3,5-benzentrimetatiol parçası¹⁶ ile bir DOTA şelatörüne bağlanmış bir 7-amino asit dizisi içerir. İnsanlarda yapılan ilk bir çalışma, [⁶⁸Ga]Ga-FAP-2286'nın [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46'ya benzer bir biyodağılım profili sergilediğini ve karaciğer, böbrekler ve kalpte biraz daha yüksek fizyolojik alım olduğunu gösterdi¹⁷. Bu çalışmada, başta boyun, karaciğer, mide, pankreas, yumurtalık ve yemek borusu kanserleri olan 64 hastaya, kanser evrelemesi veya nüksün tespiti için [⁶⁸Ga]Ga-FAP-2286 ile PET görüntüleme uygulandı: [⁶⁸Ga]Ga-FAP-2286 alımı, primer tümörlerde, lenf nodu metastazlarında ve uzak metastazlarda [¹⁸F]FDG'den önemli ölçüde daha yüksekti, bu da görüntü kontrastını ve lezyon tespit edilebilirliğini artırdı. Tüm primer tümörler [⁶⁸Ga]Ga-FAP-2286 PET/BT ile görülebilirken, [¹⁸F]FDG PET/BT lezyonların neredeyse %20'sini kaçırdı. İlgili lenf nodları için, tespit oranları [⁶⁸Ga] Ga-FAP-2286 ile ve ayrıca kemik ve viseral metastazlar için daha yüksekti. Çeşitli kanser hastalıkları olan 21 hastadan oluşan daha küçük bir grupta yapılan bir başka çalışmada, [⁶⁸Ga]Ga-FAP-2286^18'in tanısal etkinliğini yansıtan bu görüntüleme ajanının mükemmel duyarlılığı da gösterilmiştir. Daha spesifik çalışmalar, ürotelyal veya akciğer kanseri gibi tek bir kanser türüne odaklanmış ve klinik moleküler görüntüleme için [⁶⁸Ga]Ga-FAP-2286'nın yüksek potansiyelini bir kez daha vurgulamıştır ^4,5. Tedavi ile ilgili olarak, bir ön çalışma, çeşitli progresif, metastatik kanserleri olan 11 hastada lutesyum-177 (^β-yayıcı, t_1/2 = 6.7 d) ile radyoaktif işaretli FAP-2286'nın kullanımını araştırdı¹⁹. Çoğu hastaya 8 hafta arayla iki tedavi döngüsü verildi ve döngü başına ortalama uygulanan doz 5.8 ± 2.0 GBq [¹⁷⁷Lu]Lu-FAP-2286 idi. İlaç, kemik metastazlarında yaklaşık 44 saatlik etkili bir yarılanma ömrü ile uzun süreli intratümöral retansiyon gösterdi. Kabul edilebilir yan etkiler göz önüne alındığında, bu bulgular daha büyük ölçekli klinik çalışmaların yolunu açtı: [¹⁷⁷Lu]Lu-FAP-2286'nın güvenliği ve etkinliği şu anda Novartis (NCT04939610)^7,8 tarafından desteklenen faz 1/2 LuMIERE klinik çalışmasında değerlendirilmektedir. Literatürde^daha küçük ölçekli araştırma protokolleri belgelenmiştir ^9,20 ve bu TRT'nin etkinliğini ve mükemmel tolere edilebilirliğini gösteren çok sayıda vaka raporu 21,22,23,24,25,26 yayınlanmıştır.

FAP-2286 üzerinde yapılan minimal yapı değişiklikleri, optimize edilmiş analog 3BP-3940'a yol açtı (Şekil 1)²⁷. Bu vektör molekülü ile ilgili bilimsel literatür sınırlı kalmakla birlikte, hem görüntüleme hem de terapötik uygulamalar için erken çalışmalar yapılmıştır. Bir ön rapor, çeşitli son dönem metastatik karsinomları olan 18 hastada [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın kullanımını açıklar ve bu radyofarmasötikin uygun bir PET görüntüleme ajanı olduğu sonucuna varır, mükemmel tümör-arka plan oranını ve çok düşük böbrek alımını vurgular²⁸. Başka bir çalışmada, karaciğer metastazı olan tek bir pankreas kanseri hastası, PET görüntüleme için 150 MBq [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 aldı ve bu da primer tümör ve metastatik lezyonlarda yoğun tutulum gösterdi²⁹. Aynı hasta daha sonra TRT için tek doz 9.7 GBq [¹⁷⁷Lu]Lu-3BP-3940 aldı. Tedavi, yaşamsal belirtilerde veya biyolojik parametrelerde önemli bir değişiklik olmaksızın iyi tolere edildi. Farklı bir çalışma, 3BP-3940 kullanılarak teranostik bir yaklaşımın ilk insan sonuçlarını sundu: hastalar [⁶⁸Ga] Ga-3BP-3940 PET görüntüleme ile seçildi ve daha sonra farklı izotoplarla (¹⁷⁷Lu, ⁹⁰Y veya ²²⁵Ac) etiketlenmiş 3BP-3940 aldı, tek başına veya tandem kombinasyonlarda (ör., ¹⁷⁷Lu + ²²⁵Ac) 1-5 tedavi döngüsünde³⁰. Sonuçlar arasında bir tam remisyon, dört kısmi remisyon, üç stabil hastalık ve 12 hastalık ilerlemesi vardı. Kohortun (n = 28) medyan genel sağkalımı TRT'nin başlangıcından itibaren 9 aydı.

Şekil 1: [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın kimyasal yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

FAP-2286 ve 3BP-3940 gibi deneysel radyofarmasötikler için ⁶⁸Ga radyoetiketleme işlemi genellikle hazırlama adımını otomatikleştirmek için bir sentez modülü içerir. Özellikle, metot otomasyonu, proses sağlamlığını ve GMP uyumluluğunu sağlar ve manuel hazırlama yöntemlerine kıyasla operatörün radyasyona maruz kalmasını en aza indirir 31,32,33. Çoğu durumda, böyle bir protokol, ilgili deneysel radyofarmasötik^34'ü üretmek için bir merkeze yetki vermeden önce, bir araştırma tıbbi ürün dosyasının (IMPD) bir parçası olarak düzenleyici makamlar tarafından beklenir. Bugüne kadar, anti-FAP psödopeptitlerinin otomatik ⁶⁸Ga radyo-işaretlemesi hakkında çok az ayrıntılı bilgi literatürde^mevcuttur 29,35,36,37,38. Ayrıca, rapor edilen veriler genellikle yalnızca belirli bir sentezleyici modeli için geçerlidir. Kullanılan ⁶⁸Ga jeneratör tipi, ticari olarak mevcut farklı çözümler, otomatik radyoetiketleme koşulları üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabilen HCl'de (genellikle 0,1 M) belirli hacimlerde ⁶⁸Ga³⁺ elüat ile karakterize edildiğinden, belirli özgüllükler de getirebilir.

Bu bağlamda, GAIA V2 sentez modülünü kullanarak ⁶⁸Ga ile psödopeptid 3BP-3940'ın hızlı ve verimli otomatik radyo-etiketlemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu sentezleyici, sıvı akışını kontrol etmek için peristaltik bir pompaya bağlı, her biri beş manifolddan oluşan üç rampadan oluşan bir boru setinin kullanımına dayanır. Ayrıca, reaksiyon ortamı ısıtması için bir flakon fırınına, birkaç radyoaktivite probuna ve sistem içindeki bu parametreleri izlemek için bir basınç sensörüne sahiptir. Diğer bazı modeller kadar yaygın olmasa da, bu otomat merkezimizde rutin olarak kullanılmakta ve giderek artan sayıda^{tesise kurulmaktadır} 31,39,40,41,42,43,44. Bu çalışmada ⁶⁸Ga elüat ön saflaştırılmadan bir GALLIAD 68 Ge/⁶⁸Ga jeneratörü kullanılmıştır. Bu yöntem, [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 üretimi için sağlam, hızlı ve kullanışlı bir çözüm sunmak üzere tasarlanmıştır ve ayrıca radyoetiketleme sırasında operatörler için radyasyon korumasını optimize eder. Bu aynı zamanda, bu spesifik sentezleyici modelinde ve bu kadar ayrıntılı olarak rapor edilen bu radyofarmasötik için ilk hazırlık protokolüdür.

Protokol

NOT: Bu protokol radyoizotoplarla çalışmayı içerir. Bu prosedürü uygulayan herkes, mühürsüz radyoaktif maddelerin kullanımı konusunda uygun şekilde eğitilmiş olmalı ve kurumlarının radyasyon güvenliği görevlisinden onay almalıdır. Otomatik sentezleyici, belirlenmiş korumalı bir sıcak hücreye yerleştirilmelidir. Radyoaktif malzemeleri içeren herhangi bir manuel prosedür de korumalı bir sıcak hücrede veya uygun radyasyon kalkanının arkasında gerçekleştirilmelidir.

1. Reaktiflerin hazırlanması

NOT: [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın otomatik üretimi için gerekli reaktifler (Malzeme Tablosuna bakınız) bir radyofarmasötik hazırlama ünitesinde (GMP derece C temiz oda) hazırlanmıştır. Reaktifler herhangi bir sırayla ve sentezden 2 saat öncesine kadar hazırlanabilir.

1. Tampon çözeltisinin hazırlanması (sodyum asetat 0.8 M)
   1. Aşağıdaki hammaddeyi edinin: sodyum asetat trihidrat EMPROVE API Ph Eur, BP, JP, USP, FCC, E262.
   2. Doğru şekilde tanımlanmış steril bir kapta (örneğin, mikrosantrifüj tüpü, 5 mL), hassas bir terazi kullanarak 544.32 mg'a yakın tam bir sodyum asetat trihidrat kütlesini tartın.
   3. Kalibre edilmiş bir mikropipet ve steril koniler kullanarak, sodyum asetatı 5 mL'ye yakın bir enjeksiyon için su hacminde (WFI) çözündürün, böylece WFI aşağıda açıklandığı gibi olur.
      WFI hacmi = (tartılan tampon kütlesi x 5)/544.32
   4. Çözeltiyi vorteksleyin ve çözündürmeyi kolaylaştırmak için ultrasonik bir banyodan (40 kHz, ~ 1 dakika) geçirin.
   5. 21G iğne ile donatılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak tampon çözeltisini geri çekin. Şırınga ile yeni bir iğne arasına 0.22 μm'lik bir filtre takın, ardından septumunun dezenfeksiyonundan sonra tampon çözeltisini doğrudan uygun şekilde tanımlanmış steril sızdırmaz bir şişeye (örn., TC-ELU 5) filtreleyin.
2. Anti-radyoliz bileşik çözeltisinin hazırlanması (metiyonin 10 mg / mL)
   1. Aşağıdaki hammaddeyi elde edin: L-Metionin (Ph. Eur., USP) saf, ilaç sınıfı.
   2. Doğru şekilde tanımlanmış steril bir kapta (örneğin, 5 mL'lik mikrosantrifüj tüpü), hassas bir terazi kullanarak 50 mg'a yakın tam bir L-metiyonin kütlesini tartın.
   3. Kalibre edilmiş bir mikropipet ve steril koniler kullanarak, L-metiyonini 5 mL'ye yakın bir WFI hacminde çözündürün, böylece WFI aşağıda açıklandığı gibi olur.
      WFI hacmi = (tartılan tampon kütlesi x 5)/50
   4. Çözeltiyi vorteksleyin ve çözündürmeyi kolaylaştırmak için ultrasonik bir banyodan (40 kHz, ~ 1 dakika) geçirin.
   5. 21G iğne ile donatılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak metiyonin çözeltisini geri çekin. Şırınga ile yeni iğne arasına 0,22 μm'lik bir filtre takın, ardından septumunun dezenfeksiyonundan sonra çözeltiyi doğrudan uygun şekilde tanımlanmış steril sızdırmaz bir şişeye (örneğin, TC-ELU 5, Curium) filtreleyin.

2. Kalite kontrolleri için ekipmanın hazırlanması

1. Nihai ürünün pH kontrolü
   1. Uygun bir koruyucu kalkanın arkasına, nihai ürünün daha sonra kontrol edilmesi için bir pH kağıdı şeridi yerleştirin.
2. Radyo-TLC ile radyokimyasal saflık kontrolü
   1. Uygun mobil fazları içeren iki TLC geçiş tankı hazırlayın. Mobil faz A: sitrat tamponu 0.1 M pH 4 suda, [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 için beklenen Rf = 0-0.2 ve serbest ⁶⁸Ga³⁺ için Rf = 0.8-1. Mobil faz B: 1: 1 su ve metanol (v / v) karışımında 1 M amonyum asetat tamponu, [⁶⁸Ga] galyum kolloidleri için beklenen Rf = 0-0.2 ve [⁶⁸Ga] Ga-3BP-3940 için Rf = 0.8-1.
   2. Uygun bir koruyucu kalkanın arkasında, nihai ürünün RCP'sinin daha sonraki kontrolü için iki TLC migrasyon tankını iki iTLC-SG plakasının yanına yerleştirin.
   3. Radyokromatografı açın ve ilgili edinme yazılımını işletim bilgisayarında açın. Gerçekleştirilecek ilk analiz için kimlik bilgilerini önceden girin.
3. Radyo-HPLC ile radyokimyasal saflık kontrolü
   1. Analiz için gerekli olan kolon modelinin (C₁₈ ACE Eşdeğerliği) sistem üzerinde kurulu olduğunu kontrol ediniz.
   2. HPLC için taze mobil faz hazırlayın, yani HPLC +% 0.1 TFA (çözücü A) ve asetonitril +% 0.1 TFA (çözücü B) için su. Solvent A ve solvent B şişelerini radyo-HPLC üzerindeki ilgili hatlara bağlayın.
   3. İşletim bilgisayarını açın ve kontrol yazılımına bağlanın.
   4. Gerekirse, pompa modülündeki tahliye vanasını açın ve analiz için kullanılacak hatları (yani A hattı ve B hattı) boşaltın. Bu işlemden sonra tahliye vanasını kapatın.
   5. Sistemin, en az 20 dakika boyunca 0,6 mL/dk'lık bir akışla gradyanın başlangıcına eşit bir çözücü oranıyla (yani, %95 A /%5 B) dengelenmesine izin verin. [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 HPLC analiz dizisi için, 0,6 mL/dk'da tutulan akış hızını kullanın ve mobil faz gradyanını suda (A) %0,1 TFA'dan asetonitril (B)'de %0,1 TFA'ya aşağıdaki gibi programlayın: 0 - 1 dk 95/5 A/B; 95/5 A/B'den 60/40 A/B'ye kadar 1 - 8 dakikalık doğrusal gradyan; 8 - 9 dk 60/40 A/B; 60/40 A/B'den 95/5 A/B'ye 9 - 10 dakika doğrusal gradyan; 10 - 12 dk 95/5 A/B.
   6. Adım 2.3.5.'te açıklanan mobil faz gradyanına sahip analitik yöntemi seçin, ardından gerçekleştirilecek ilk analiz için tanımlama bilgilerini önceden girin.
   7. Korumalı bir kapta, analiz edilecek numuneyi almak için cam uçlu bir HPLC şişesi hazırlayın ve uygun bir koruyucu kalkanın arkasına yerleştirin.

3. Sentez modülünün hazırlanması

1. Korumalı hücrenin gücünü ve ışığını açın. Sentezleyiciyi kontrol eden dizüstü bilgisayarı açın ve modül yazılımında oturum açın.
2. Gerekirse, eski kiti sentezleyiciden çıkarın ve atıkları uygun kaplara atın.
3. Sentez modülünü muhafaza eden korumalı kabinin içini ve sentezleyicinin kendisini geçerli hijyen standartlarına uygun olarak temizleyin.
4. Sentezleyici yazılımında Kullanıcı tuşuna basın, ardından bir kullanıcı adı seçin ve açılır pencereye ilgili şifreyi girin. Yöntem'e basın ve [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 sentezi için önceden yapılandırılmış otomatik protokolü seçin.
5. Hazırlık'a basın ve sentez başlığını, vektör parti numarasını, reaktif kiti parti numarasını ve tüm yorumları uygun metin kutusuna girin. Bu aşamada çeşitli kit hazırlama adımlarını içeren bir kontrol listesi de oluşturulabilir ve takip edilebilir (Ek Şekil 1).

4. Sentez kasetinin hazırlanması ve kaset montajı

1. Radyofarmasi laboratuvarı tezgahını bir mendil ve uygun deterjan dezenfektanı ile temizleyin ve tezgahın üzerine steril bir örtü yerleştirin.
2. Steril bir [⁶⁸Ga]Ga etiketleme kaseti (referans RT-01-H) ve bir reaktif kiti (Ek Şekil 2) edinin. Boru setinin 3 rampası, modül üzerinde soldan sağa A, B ve C olarak tanımlanır; her rampanın manifoldları 1'den 5'e kadar yukarıdan aşağıya (rampa A ve C) veya soldan sağa (rampa B) numaralandırılmıştır.
3. Aşağıdaki adımları izleyerek kaseti monte edin.
   1. [⁶⁸Ga]Ga kaset zarfını açın, herhangi bir hasar olup olmadığını kontrol edin ve kasetteki her bir Luer bağlantısını sıkın. Tüm sivri kapakları çıkarın.
   2. 5 mL'lik bir Luer Lock şırıngası ve 21G iğnesi kullanarak, reaktif kitinden 5 mL mutlak etanol çekin ve çok yavaş bir şekilde C₁₈ kartuşunun üzerinden geçirin, ardından 5 mL WFI (kitte verilmez) çekin ve ön koşullandırma için aynı C₁₈ kartuşunun üzerinden çok yavaş bir şekilde geçirin.
   3. Boru setinin A rampasını sentez modülüne yerleştirin ve rampayı yerinde tutmak için iki mandalı çevirin. Dikey A1 hortumunun serbest ucunu 19G'lik bir iğneye bağlayın ve atık şişesine yerleştirin.
   4. Atık şişesine bir havalandırma iğnesi ekleyin ve tahliye şişesini alacak korumalı kabın arkasına en uygun şekilde geriye doğru konumlandırın. A0.22 konumuna 4 μm'lik bir filtre yerleştirin.
   5. Yatay A1 hortumunu modül ön panelinin sol alt kısmındaki basınç sensörüne bağlayın.
   6. Bir erkek/erkek adaptör kullanarak, 0,22 μ terminal filtresi ve 80 mm 20G iğne ile biten 30 cm'lik bir uzatmayı yatay A5 konumunda bağlayın.
   7. Yukarıda belirtilen 20G iğnesini kapalı, steril bir tahliye şişesine (örn., TC-ELU 5) yerleştirin, bir havalandırma iğnesi ekleyin ve tahliye şişesini korumalı kabına yerleştirin.
   8. Dikey A1'i dikey C1'e bağlayan boru hattını, rampa B'nin üzerindeki tutma kancalarının arkasına yerleştirin.
   9. A2 ve B1 yatay manifoldlarını, halihazırda A5 konumuna monte edilmiş adaptörü kullanarak kısa bir uzatma hattıyla (ya kite dahil değildir ya da başlangıçta yatay C2 konumuna bağlanmış olan) bağlayın.
   10. Rampa B'yi sentez modülüne yerleştirin ve rampayı yerinde tutmak için iki mandalı çevirin.
   11. Yatay_B18 valfini C2'ye bağlayan adaptörü solunda tutarak önceden koşullandırılmış C 5 kartuşunu yatay C2 konumuna bağlayın.
   12. Rampa C'yi sentez modülüne yerleştirin ve rampayı yerinde tutmak için iki mandalı çevirin.
   13. Bir erkek/erkek adaptör kullanarak yatay C50'ten 5 cm'lik bir uzatma hattını GALLIAD ⁶⁸Ga jeneratörüne bağlayın.
   14. Boru setinin vitray reaksiyon şişesini modülün fırınına yerleştirin. Boruyu dikey A5'ten dikey C5'e kadar peristaltik pompaya dikkatlice yerleştirin, pompayı kapatın, borunun doğru yerleştirildiğini kontrol edin ve boruyu pompanın sol tarafındaki aktivite sensöründen geçirin.
4. Kaset ve hortumun Şekil 2'de gösterildiği gibi henüz reaktifler olmadan radyosentezleyiciye monte edildiğinden emin olmak için bir ara kontrol yapın.

Şekil 2: Sentez modülü konfigürasyonu. (A) Sentez modülünde [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın otomatik sentezi için kurulum. (B) Bir GAIA sentez modülü kullanılarak [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın otomatik üretimi için reaktif pozisyonlarına ilişkin ayrıntılar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Reaktif kurulumu

1. Rampalar modüle takıldıktan sonra, reaktifleri aşağıda açıklandığı gibi kurun.
   1. WFI 250 mL'lik torbayı reaktif kitinden Spike adaptörünü kullanarak C4 hortumuna bağlayın ve torbayı modülün sağ tarafındaki özel kancaya asın.
   2. 20G iğne ile donatılmış 3 mL'lik üç parçalı Luer Lock şırıngası kullanarak, önceden hazırlanmış L-metiyonin 10 mg / mL çözeltisinden 1.5 mL çekin, şırıngayı yatay C1 tüpüne bağlayın ve şırıngayı modülün sağ tarafındaki özel yuvaya asın. Tam sıvı transferini sağlamak için sıvı yüzeyi ile şırınga piston contası arasında yaklaşık 2 mL hava bırakın.
   3. 20G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, önceden hazırlanmış 10 mg / mL L-metiyonin çözeltisinden 750 μL çekin ve septumun dezenfeksiyonundan sonra reaktif kitinden %0.9 NaCl şişesine (mavi kıvrım) enjekte edin.
   4. 20G iğneli 10 mL'lik üç parçalı Luer Lock şırınga kullanarak,% 0.9 NaCl + L-metiyonin şişesinin (mavi kıvrım) içeriğini geri çekin, 8.6 mL'ye ayarlayın, Spike'ı B4 konumunda çıkarın, ardından şırıngayı B4'e bağlayın. Tam sıvı transferini sağlamak için sıvı yüzeyi ile şırınga piston contası arasında yaklaşık 2 mL hava bırakın.
   5. 20G iğneli 3 mL'lik üç parçalı Luer Lock şırınga kullanarak, septumun dezenfeksiyonundan sonra% 60 etanol şişesinin (turuncu kıvrım) içeriğini geri çekin. Hacmin en az 1,5 mL'ye eşit olduğunu kontrol edin, Spike'ı B5 konumunda çıkarın, ardından şırıngayı bunun yerine B5'e bağlayın. Tam sıvı transferini sağlamak için sıvı yüzeyi ile şırınga piston contası arasında yaklaşık 2 mL hava bırakın.
   6. 20G iğneli düşük ölü hacimli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, önceden hazırlanmış 0.8 M sodyum asetat tampon çözeltisinin 0.25 mL'sini geri çekin ve ardışık enjeksiyonlar / yeniden aspirasyon döngüleri ile çözündürmek için 30 μg 3BP-3940 içeren şişeye enjekte edin. 0.25 mL çözeltiyi aynı şırıngaya çekin, iğneyi ayırın ve tampon + vektör şırıngasını B3'e yerleştirin. Tam sıvı transferini sağlamak için sıvı yüzeyi ile şırınga pistonu arasında yaklaşık 0.25 mL hava bırakın.
2. Sentezin başlamasından önce aşağıda açıklandığı gibi son bir kontrol yapın.
   1. Şekil 3'te gösterildiği gibi tüm reaktiflerin kasete veya boruya bağlı olduğunu doğrulayın.
   2. Kitin bağlantılarının her birinin yeterince sıkı olduğundan emin olun. Borunun sıkışmadığından veya açılı olmadığından emin olun.
3. Sistem hazır. Ön paneli kapatın ve korumalı hücrenin havalandırmasını açın.

Şekil 3: Kit kurulumu. ⁶⁸Ga ile 3BP-3940'ın radyo-etiketlemesi için boru setinin ve reaktiflerin sentezleyici üzerindeki son kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 üretimi için otomatik radyo etiketleme dizisi

1. Tüm reaktifler rampalara yerleştirildiğinde ve tüm bilgiler yazılıma doğru bir şekilde kaydedildiğinde Sentezi Çalıştır'a tıklayın.
2. Sentez dizisi boyunca boru setindeki tipik bir radyoaktivite dağılımı profili şurada gösterilmiştir: Şekil 4. Hazırlamak için otomatik yöntemdeki ardışık adımları izleyin [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 aşağıda açıklandığı gibi.
   1. Kit bütünlük testleri: Borunun atık şişeye doğru kısa bir tahliyesinden sonra (esasen C₁₈ kartuşunda kalan sıvıyı çıkarmak için), sistem A4'ü açarak ve peristaltik pompa aracılığıyla filtrelenmiş havayı pompalayarak iç basıncını artırır. A1'e bağlı basınç sensörü 1500 mbar'> bir boru basıncı algıladığı anda sistem kapanır ve peristaltik pompa durur. Basınç düşüşü 15 saniye boyunca 400 mbar'ı aşmazsa, kitin bütünlük testinin başarılı olduğunu değerlendirin ve senteze başlayın. Test başarısız olursa, bir sistem sızıntısından şüphelenin ve sentez dizisini iptal edin.
   2. Reaksiyon şişesine vektör ilavesi: Tampon çözeltisinde çözündürülen 3BP-3940'ın, manifold B2 aracılığıyla yaklaşık 30 saniye içinde reaksiyon şişesine çekildiğinden emin olun.
   3. Reaksiyon şişesine L-metiyonin ilavesi: C1'deki şırıngada bulunan metiyonin çözeltisinin, manifold B2 aracılığıyla, aşağı rampa C ve daha sonra rampa A'da manifold A2 ile dallanmak üzere rampa A'ya aktarıldığından emin olun.
   4. C₁₈ kartuşunun WFI ile etkinleştirilmesi: Torbada C4'te bulunan WFI'nin C₁₈ kartuşunun üzerinden geçtiğinden emin olun, ayrıca vektör ve metiyonin çözeltilerinin izlediği yollarda A, B ve C rampalarını durulayın. Aynı yollar daha sonra filtrelenmiş hava ile yıkanır, böylece sonraki adımlar için boruda su kalmamasını sağlar.
   5. Reaksiyon şişesinde jeneratör elüsyonu (manuel müdahale): GALLIAD jeneratörünü boşaltmak için, 10-20 saniye beklemeden önce jeneratörün üstündeki yeşil düğmeyi yükleme konumuna 90° çevirin: bu süre jeneratörün 1,1 mL'lik sabit bir elüat hacmi hazırlamasına izin verir. Yeşil düğmeyi başlangıç konumuna getirin ve Kontrol yazılımındaki prompter'a tıklayın. Peristaltik pompa daha sonra ⁶⁸Ga elüatı 3 dakikalık bir süre boyunca reaksiyon şişesine çeker. Bu zaman aralığı boyunca, reaksiyon şişesinin sıcaklığı, radyoetiketleme adımı için ayarlanan sıcaklığa daha hızlı ulaşmak için kademeli olarak 1 dakika boyunca 60 °C'ye, ardından 2 dakika boyunca 90 °C'ye yükseltilir.
   6. Radyoetiketleme: Radyoetiketleme adımının başlangıcında, hızlı ve verimli ısıtma sağlamak için 30 saniye boyunca 120 °C'lik bir ayar noktası sıcaklığının uygulandığını kontrol edin. Ayar noktası sıcaklığının daha sonra 2 dakika boyunca 98 °C'ye ayarlandığını kontrol edin. Reaksiyon şişesindeki ısınma ve basınç artışı nedeniyle, reaksiyon ortamının bir kısmı B2'ye bağlı boruya geri akma eğilimindedir. Bunu sınırlamak için, 2 dakikalık ısıtmadan sonra 10 saniyelik bir hat temizleme ayarlanır; Daha sonra radyoetiketleme yaklaşık 5,5 dakika devam eder.
   7. C₁₈ kartuşunda yakalama: Filtrelenmiş havanın reaksiyon kabına C3 tarafından pompalandığından emin olun. Sıvının yüzeyine uygulanan basınç, reaksiyon ortamının B2'ye bağlı borudan yukarı doğru akmasına ve ardından SPE kartuşuna akmasına izin verir. Reaksiyon şişesi daha sonra C4'teki torbadan WFI ile durulanır ve bu durulama sıvısı aynı şekilde SPE kartuşuna aktarılır. Kartuş sonunda taze WFI ile durulanır ve filtrelenmiş hava ile yıkanır.
   8. C₁₈ kartuşunun ve formülasyonunun elüsyonu (NaCl %0.9 + L-metiyonin ilavesi): SPE kartuşu başlangıçta radyoaktif işaretli ürünü ve herhangi bir galyum kolloidini tutar ve serbest ⁶⁸Ga^{3 +} 'nın geçmesine izin verir. Kartuşu elüte etmek ve terminal şişesinde [⁶⁸Ga] Ga-3BP-3940'ı geri kazanmak için, NaCl% 0.9 (her biri 3x 0.5 mL) içinde ardışık etanol fraksiyonlarının% 60 ve metiyonin ~ 0.9 mg / mL fraksiyonlarının elüsyon için kartuşun üzerine çekildiğinden emin olun. B4'teki şırınganın tüm içeriği daha sonra terminal şişesinde %<10'luk bir nihai etanol konsantrasyonu elde etmek için bir formülasyon adımında C18 kartuşundan geçirilir.
   9. Filtre bütünlük testi (manuel müdahale): Terminal şişesinin sentezi ve çıkarılmasından sonra, bir kabarcık noktası testi kullanarak terminal filtrenin bütünlüğünü kontrol etmek için terminal filtresini atık şişeye bağlamanızı ve havalandırma filtresini atık şişeden çıkarmanızı isteyen istemi izleyin. Kabarcık noktası testi sırasında, filtre başlangıçta WFI tarafından 30 saniye boyunca ıslatılır. Hatlar temizlendikten sonra, sistemdeki basınç <2 dakika boyunca yavaş yavaş >2500 mbar'a kadar yükseltilir, bu sırada sentezleyici filtrenin çıkışında basınç artışı olup olmadığını kontrol eder. Ardından, sistem kabarcık noktasını kontrol etmek için basıncı yavaşça artırır. Sentezleyici, kabarcık noktası basıncını belirlemek için filtre çıkışındaki basınç arttığında son olarak basıncı kaydedecektir.
3. Sentezin sonunda, otomat yazılımı, radyoetiketlemenin seyrini açıklayan ve reaksiyon şişesindeki sıcaklıkları, sistemdeki basınçları ve ilgili radyoaktivite miktarlarını izleyen bir sentez raporu oluşturur (Şekil 4). Tamamlayıcı olarak, bozunmaya göre düzeltilmiş radyokimyasal verimi (RCY) aşağıdaki formüle göre manuel olarak hesaplayın:
   RCY =
   reaksiyon şişesinde, C₁₈ kartuşunda ve sentezin sonunda atık şişede kalan aktiviteleri tanımlayan kalıntı aktiviteler ile.

Şekil 4: Modül içindeki radyoaktivitenin tipik dağılım profili. (A) reaksiyon şişesi; (B) [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 sentezi sırasında C₁₈ kartuşu. ⁶⁸Ga elüatın reaksiyon şişesine akışı 6 dakikada gerçekleşir. Aktivite, radyoetiketleme reaksiyonu boyunca reaksiyon şişesinde kalır. 16 dakika sonra, aktivite SPE kartuşuna aktarılır. Kartuş 19,5 dakika sonra ayrıştırılır, bundan sonra sabit fazda yaklaşık 150 MBq'lik bir kalıntı aktivite kalır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. [⁶⁸Ga] Ga-3BP-3940'ın dağıtım ve kalite kontrolleri

1. Terminal şişeyi radyoaktivite ölçümü ve hasta dozu hazırlığı için uygun bir korumalı hücreye aktarın.
2. Terminal şişenin aktivitesini uygun şekilde kalibre edilmiş bir doz kalibratörü ile ölçün ve hazırlığı bilgisayara kaydedin.
3. Şişeyi doğru bir şekilde tanımlayın ve uygun korumalı bir kaba koyun. Uygun aseptik teknikler ve radyasyondan korunma teknikleri kullanarak, kalite kontrolleri için terminal şişeden ~ 0,5 mL'lik bir numune çekin.
   1. Preparatın görünümünü görsel inceleme ile değerlendirin. pH kağıt şeridi üzerine bir damla ürün çözeltisi bırakarak preparatın pH'ını değerlendirin.
   2. Önceden hazırlanmış iki iTLC-SG plakasının her birine bir damla ürün çözeltisi bırakarak radyo-TLC ile radyokimyasal saflığı ölçün. Ardından, plakaların ilgili mobil fazlara geçmesine ve radyokromatograf tarafından okunmasına izin verin. Ürün sinyalinin eğrisi altındaki alanı ve safsızlık sinyalini ölçerek elde edilen radyokromatogramı entegre edin, ardından radyokimyasal saflığı aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
      RCP (%) = 100 - %AUC_{safsızlık 1} - %AUC_{safsızlık 2}
   3. Önceden hazırlanmış HPLC şişesine ~ 50 μL preparat enjekte ederek radyo-HPLC ile radyokimyasal saflığı ölçün (bkz. adım 2.3.7). Şişeyi HPLC otomatik numune alma cihazında gerekli konuma yerleştirin ve analiz sırasını başlatın. Numune sisteme enjekte edildikten sonra, şişeyi otomatik numune alma cihazından çıkarın ve ışınlamayı en aza indirmek için korumalı kabına yerleştirin. Analizin sonunda, ürün sinyalinin eğrisi altındaki alanı ve safsızlık sinyallerini ölçerek elde edilen radyokromatogramı entegre edin, ardından radyokimyasal saflığı aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
      RCP (%) = 100 - Σ(%AUC_{safsızlıkları})
   4. 1 mL WFI içeren bir gama sayaç tüpüne ~ 5 μL preparat ekleyerek preparatta bulunan radyoizotopun yarı ömrünü (gama sayacı) kontrol edin. Tüpü gama sayacı ile art arda 10x sayın (her biri 1 dakikalık sayılarla). 10 ölçümde gözlemlenen radyoaktif bozunmaya dayalı olarak yarı ömrü hesaplayın.
   5. Yok olma fotonlarından 511 keV ve 1077 keV tepe noktalarını arayarak, gama sayacını kullanarak gama spektrometrisi analizi yaparak yarı ömür testi ile aynı numune üzerinde radyonüklidik kimlik testini gerçekleştirin.
   6. Önceki numunenin 48 saatlik bir bozunma periyodundan sonra radyonüklidik saflığı değerlendirin. Gama sayacında 120 dakikalık bir ölçüm gerçekleştirin, bu da ⁶⁸Ge atılımından ve diğer uzun yarı ömürlü radyonüklid safsızlıklarından yerinde oluşan herhangi bir kalıntı ⁶⁸Ga aktivitesinin tespit edilmesine izin verir.

8. [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 preparatının kararlılığı

1. Zaman içinde stabilite için üç test partisini değerlendirin. Bu amaçla, EoS'tan hemen sonra ve sentezden 4 saat sonrasına kadar her saat terminal flakondan yaklaşık 200 μL preparat çekin.
2. Yukarıda açıklanan prosedüre göre RCP'yi HPLC ile ölçmek için her zaman noktasında bir radyo-HPLC analizi yapın. Daha önce açıklanan prosedüre göre RCP'yi TLC ile ölçmek için her zaman noktasında Radyo-TLC analizleri gerçekleştirin.

Sonuçlar

GAIA modülünde geliştirilen sentez işlemi, 3BP-3940'ın 21-22 dakikada ^{hızlı bir şekilde 68}Ga radyo-etiketlenmesine izin verir. Bu protokol, ^0,1M HCl'de 1,1 mL 68 Ga elüat üreten farmasötik sınıf ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga jeneratör GALLIAD ile çalışmak üzere tasarlanmıştır. Reaksiyon tamponunun hacmi ve molaritesi, optimum radyoetiketleme⁴⁵ için gerekli olan 3.5 ile 4 arasında bir reaksiyon pH'ı elde etmek için b...

Tartışmalar

Bu çalışma, bir GAIA modülü ve bir GALLIAD jeneratörü kullanarak [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940'ın sentezi için GMP uyumlu bir otomatik hazırlama protokolü sunmaktadır. Bu yöntem, klinik PET görüntülemesi için PSMA ligandları⁴⁴ ve diğer FAP inhibitörleri ^43,46 gibi vektörlerin galyum-68 radyo-işaretlemesi için merkezimizde kullanılan protokollerden hafif modifikasyonlarla uyarlanmış...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µ filters	VWR	514-0515	For filtration of buffer and antioxidant solutions and final radiolabeling product
Acetonitrile for HPLC	Sigma Aldrich	34851-2.5L	For HPLC control of radiochemical purity
Ammonium acetate	Sigma Aldrich	238074	For the preparation of one of the mobile phases for TLC control
C18 column for HPLC	VWR	EQV-3C18-1503	For HPLC control of radiochemical purity
Calibrated dose calibrator (CRC25)	Capintec	-	For measuring the radioactivity of the final product and the various components of the module post-synthesis
Citrate buffer solution, pH 4	Thermofisher	258585000	Mobile phase for TLC controls
Eppendorf tube 5 mL Biopur	Sigma Aldrich	EP0030119479	For the preparation of buffer and antioxidant solutions
Extension line (30 cm)	Vygon	1159.03	For the connection of the generator to the tubing set
Gallium-68 generator	IRE Elit	-	For in situ generation of [68Ga]gallium chloride
Gamma counter (Hidex AMG)	Hidex	-	For half-life and radiochemical purity assessment
HPLC station	Shimadzu	-	For HPLC control of radiochemical purity
iTLC-SG plates	Agilent	SGI0001	For TLC control of radiochemical purity
L-methionine	AppliChem	A1340	For antioxidant solution preparation
Male/male adapter	Vygon	893.00	For the connection of the generator to the tubing set
Methanol	Sigma Aldrich	320390-1L	For the preparation of one of the mobile phases for TLC control
Needles (21G, Sterican)	B Braun	4657543B	For solution transfers prior to radiolabeling
pH paper	VWR	85409.600	To test the pH of the radiolabelling product
Pipette 1000 µL (Gilson PIPETMAN)	Fisher Scientific	12346132-1000	For precise liquid measurement and transfer
Pipette 200 µL (Gilson PIPETMAN)	Fisher Scientific	12326132-200	For precise liquid measurement and transfer
Pipette Tips, 100-1000 μL	Charles River	D1000IW	For precise liquid measurement and transfer
Pipette Tips, 2-200 μL	Charles River	D200IW	For precise liquid measurement and transfer
Radiochromatograph	Elysia-Raytest	-	For TLC control of radiochemical purity
Radiosensor for HPLC	Elysia-Raytest	-	For HPLC control of radiochemical purity
Reagents kit	ABX	RT-101	Provides ethanol 60%, NaCl 0.9%, WFI bag, C18 cartridge, 0.2 µ terminal filter, aeration needles, terminal needle and waste vial
Shielded container	LemerPax		For radiation attenuation of the radiolabeling product
Single-use plastic spatula	Corning	3005	For the preparation of reagents
Sodium acetate trihydrate EMPROVE	Sigma Aldrich	1.28204	For reaction buffer preparation
Sterile sealed vials (glass type 1)	Curium	TC-ELU-5	For final conditioning of buffer, antioxidant and radiolabeling solutions
Sterile tubing set	ABX	RT-01-H	For automated synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940
Sterile water for irrigation	B Braun	0082479E	For the preparation of one of the mobile phases for TLC control
Synthesis module (GAIA)	Elysia-Raytest	-	For automated synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940
Syringe (1 mL, low dead-volume)	B Braun	9166017V	For peptide in buffer conditionning and addition of methionine in NaCl 0.9%
Syringes (10 mL)	Becton Dickinson	309649	For methionine in NaCl 0.9% and conditionning
Syringes (3 mL)	Becton Dickinson	309658	For methionine and ethanol 60% conditionning
TLC migration tanks	Fisher Scientific	50-212-281	For TLC control of radiochemical purity
Trifluoroacetic acid (suitable for HPLC)	Sigma Aldrich	302031-100ML	For HPLC control of radiochemical purity
Tubes for gamma counter	-	-	For half-life and radiochemical purity assays preparation
Ultrasonic bath	Selecta	3000683	For sonication of prepared solutions
Vector molecule (3BP-3940)	MedChemExpress	HY-P10131	Vector molecule to be radiolabeled
Vial for HPLC with glass insert	Sigma Aldrich	29385-U and SU860066	For HPLC control of radiochemical purity
Vortex mixer	VWR	444-5900P	For stirring the prepared solutions
Water for HPLC	Sigma Aldrich	34877-2.5L-M	For HPLC control of radiochemical purity
Water for injection, 10 mL flasks	Aguettan	34009 370 641 0 1	For solutions preparation