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Method Article
Questa ricerca descrive il processo automatizzato per la produzione di [68Ga]Ga-3BP-3940 con il sintetizzatore GAIA V2, per l'imaging PET della proteina di attivazione dei fibroblasti. Vengono inoltre presentati i risultati dei test di controllo qualità eseguiti su tre lotti di prova.
Un metodo rapido ed efficiente è stato sviluppato sul modulo di sintesi GAIA per la radiomarcatura automatizzata del gallio-68 di 3BP-3940, una sonda di imaging molecolare che ha come bersaglio la proteina di attivazione dei fibroblasti per l'imaging con tomografia a emissione di positroni del microambiente tumorale. Le condizioni di reazione hanno coinvolto tampone acetato (concentrazione finale: 0,1 M), metionina come agente anti-radiolisi (concentrazione finale: 5,4 mg/mL) e 30 μg di 3BP-3940, con riscaldamento per 8 minuti a 98 °C. Un'ultima fase di purificazione su una cartuccia C18 è stata necessaria per ottenere un prodotto radiomarcato di elevata purezza. Al contrario, il 68Ga prodotto dal generatore è stato utilizzato direttamente senza una fase di concentrazione su una cartuccia a scambio cationico. La produzione di tre lotti di validazione ha confermato l'affidabilità del metodo, consentendo la sintesi di [68Ga]Ga-3BP-3940 in 22,3 ± 0,6 min con elevata purezza radiochimica (RCP), come determinato sia da radio-HPLC (99,1% ± 0,1%) che da radio-TLC (99,2% ± 0,1%). La resa radiochimica media, basata sui valori RCP misurati mediante radio-HPLC, è stata del 74,4% ± del 3,3%. La stabilità del prodotto radiomarcato è stata dimostrata fino a 4 ore dopo la preparazione. Questo protocollo fornisce una metodologia affidabile, rapida ed efficiente per la preparazione di [68Ga]Ga-3BP-3940, che può essere facilmente trasposta in un contesto clinico.
Negli ultimi anni, il targeting del microambiente tumorale (TME) ha suscitato un notevole interesse nelle applicazioni diagnostiche e terapeutiche1. L'abbondanza di tipi di cellule, molecole di segnalazione e macromolecole di matrice extracellulare (ECM) all'interno della TME offre un'ampia gamma di potenziali bersagli molecolari2. Tra le cellule ospiti residenti e infiltranti, i fibroblasti associati al cancro (CAF) formano un sottogruppo distinto di fibroblasti all'interno della TME, fenotipicamente diversi dai fibroblasti normali. I CAF svolgono un ruolo cruciale nella progressione tumorale, nelle metastasi, nell'evasione immunitaria e nella resistenza alla terapia grazie a caratteristiche cellulari e molecolari uniche3. Queste cellule mesenchimali mostrano un fenotipo attivato caratterizzato dall'espressione della proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP). Molecolarmente, i CAF secernono una complessa serie di citochine, chemochine, fattori di crescita (ad esempio, TGF-β, IL-6 e CXCL12) e proteine della MEC (ad esempio, collagene, fibronectina), che rimodellano la MEC e favoriscono un ambiente pro-tumorigenico4.
Essendo una proteina altamente specifica che è sovraespressa e localizzata sulla superficie extracellulare della membrana CAF, la FAP mostra tutte le caratteristiche di un bersaglio molecolare affidabile, specialmente per la medicina nucleare e le applicazioni radiofarmaceutiche5. In questo contesto, sono stati sviluppati inibitori di piccole molecole di FAP a base di chinolina (FAPI), funzionalizzati con un gruppo DOTA, e rapidamente introdotti nell'uso clinico 6,7,8. In particolare, FAPI-04 e FAPI-46 radiomarcati con gallio-68 (emettitore β+, t1/2 = 68 min) per l'imaging con tomografia a emissione di positroni (PET) hanno dimostrato un valore significativo nelle malattie fibrotiche, in cardiologia e in oncologia 8,9, in particolare per i tumori in cui il [18F]fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) ha un'utilità limitata10. Tuttavia, mentre i loro contributi all'oncologia e all'imaging delle malattie non maligne sono innegabili, i FAPI a piccole molecole mostrano alcune limitazioni per le applicazioni di terapia con radionuclidi mirati (TRT), in particolare a causa del loro tempo di permanenza intratumorale non ottimale, che può portare a un'irradiazione involontaria del tessuto sano11. Per affrontare questo problema, sono state esplorate diverse strategie, come la progettazione di ligandi multivalenti11,12 o l'uso di radionuclidi terapeutici con emivite brevi 13,14,15. Sono stati inoltre sviluppati nuovi scaffold molecolari con un'elevata affinità per la FAP e che innescano un'alta percentuale di internalizzazione cellulare.
Uno di questi è il derivato pseudopeptidico FAP-2286. Contiene una sequenza di 7 aminoacidi, ciclizzata e legata a un chelante DOTA da una porzione 1,3,5-benzenetrimetanetiolo16. Uno studio iniziale sull'uomo ha dimostrato che [68Ga]Ga-FAP-2286 mostra un profilo di biodistribuzione simile a [68Ga]Ga-FAPI-46, con un assorbimento fisiologico leggermente superiore nel fegato, nei reni e nel cuore17. In questo studio, 64 pazienti, principalmente con tumori del collo, del fegato, dello stomaco, del pancreas, delle ovaie e dell'esofago, sono stati sottoposti a imaging PET con [68Ga]Ga-FAP-2286 per la stadiazione del cancro o il rilevamento della recidiva: l'assorbimento di [68Ga]Ga-FAP-2286 è stato notevolmente superiore a [18F]FDG nei tumori primari, nelle metastasi linfonodali e nelle metastasi a distanza, migliorando il contrasto dell'immagine e la rilevabilità della lesione. Tutti i tumori primari erano visibili con [68Ga]Ga-FAP-2286 PET/CT, mentre [18F]FDG PET/CT ha mancato quasi il 20% delle lesioni. Per i linfonodi coinvolti, i tassi di rilevamento erano più alti con [68Ga]Ga-FAP-2286, così come per le metastasi ossee e viscerali. Un altro studio in un gruppo più piccolo di 21 pazienti con una varietà di malattie tumorali ha anche dimostrato l'eccellente sensibilità di questo agente di imaging, riflettendo l'efficienza diagnostica di [68Ga]Ga-FAP-228618. Studi più specifici si sono concentrati su un singolo tipo di cancro, come il cancro uroteliale o polmonare, evidenziando ancora una volta l'alto potenziale di [68Ga]Ga-FAP-2286 per l'imaging molecolare clinico 4,5. Per quanto riguarda la terapia, uno studio preliminare ha esaminato l'uso di FAP-2286 radiomarcato con lutezio-177 (emettitore di β-, t1/2 = 6,7 d) in 11 pazienti con diversi tumori metastatici progressivi19. La maggior parte dei pazienti ha ricevuto due cicli di trattamento distanziati di 8 settimane l'uno dall'altro e la dose media somministrata per ciclo è stata di 5,8 ± 2,0 GBq di [177Lu]Lu-FAP-2286. Il farmaco ha dimostrato una prolungata ritenzione intratumorale, con un'emivita efficace di circa 44 ore nelle metastasi ossee. Dati gli effetti collaterali accettabili, questi risultati hanno aperto la strada a studi clinici su larga scala: la sicurezza e l'efficacia di [177Lu]Lu-FAP-2286 sono attualmente in fase di valutazione nello studio clinico di fase 1/2 LuMIERE, sponsorizzato da Novartis (NCT04939610)7,8. Ulteriori protocolli di ricerca su scala ridotta sono documentati in letteratura 9,20 e sono stati pubblicati diversi casi clinici 21,22,23,24,25,26, dimostrando l'efficacia e l'eccellente tollerabilità di questa TRT.
Le modifiche minime apportate alla struttura del FAP-2286 hanno portato all'analogico ottimizzato 3BP-3940 (Figura 1)27. Sebbene la letteratura scientifica su questa molecola vettore rimanga limitata, sono stati condotti i primi studi sia per l'imaging che per le applicazioni terapeutiche. Un rapporto preliminare descrive l'uso di [68Ga]Ga-3BP-3940 in 18 pazienti con vari carcinomi metastatici allo stadio terminale e conclude che questo radiofarmaco è un agente di imaging PET adatto, sottolineando il suo eccellente rapporto tumore-fondo e la captazione renale molto bassa28. In un altro lavoro, un singolo paziente con carcinoma pancreatico con metastasi epatiche ha ricevuto 150 MBq di [68Ga]Ga-3BP-3940 per l'imaging PET, che ha dimostrato un'intensa captazione nel tumore primario e nelle lesioni metastatiche29. Lo stesso paziente ha successivamente ricevuto una singola dose di 9,7 GBq di [177Lu]Lu-3BP-3940 per TRT. Il trattamento è stato ben tollerato, senza cambiamenti significativi nei segni vitali o nei parametri biologici. Un altro studio ha presentato i risultati iniziali sull'uomo di un approccio teranostico utilizzando 3BP-3940: i pazienti sono stati selezionati con l'imaging PET [68Ga]Ga-3BP-3940 e poi hanno ricevuto 3BP-3940 marcato con diversi isotopi (177Lu, 90Y o 225Ac), somministrato da solo o in combinazioni tandem (ad esempio, 177Lu + 225Ac) in 1-5 cicli di trattamento30. Gli esiti includevano una remissione completa, quattro remissioni parziali, tre malattie stabili e 12 progressioni della malattia. La sopravvivenza globale mediana della coorte (n = 28) è stata di 9 mesi dall'inizio della TRT.
Figura 1: Struttura chimica di [68Ga]Ga-3BP-3940. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il processo di radiomarcatura a 68Ga per radiofarmaci sperimentali come FAP-2286 e 3BP-3940 prevede generalmente un modulo di sintesi per automatizzare la fase di preparazione. In particolare, l'automazione dei metodi garantisce la robustezza del processo e la conformità alle GMP e riduce al minimo l'esposizione dell'operatore alle radiazioni rispetto ai metodi di preparazione manuale 31,32,33. In molti casi, tale protocollo è atteso dalle autorità regolatorie come parte di un dossier di medicinale sperimentale (IMPD) prima di autorizzare un centro a produrre il corrispondente radiofarmaco sperimentale34. Ad oggi, in letteratura sono disponibili pochissime informazioni dettagliate sulla radiomarcatura automatizzata del 68Ga degli pseudopeptidi anti-FAP 29,35,36,37,38. Inoltre, i dati riportati si applicano generalmente solo a un dato modello di sintetizzatore. Il tipo di generatore da 68Ga utilizzato può anche portare alcune specificità, poiché le diverse soluzioni disponibili in commercio sono caratterizzate da volumi specifici di eluato 68Ga3+ in HCl (solitamente 0,1 M), che possono avere un impatto diretto sulle condizioni di radiomarcatura automatizzata.
In questo contesto, presentiamo un protocollo dettagliato per la radiomarcatura automatizzata rapida ed efficiente dello pseudopeptide 3BP-3940 con 68Ga, utilizzando il modulo di sintesi GAIA V2. Questo sintetizzatore si basa sull'uso di un set di tubi composto da tre rampe di cinque collettori ciascuna, collegate a una pompa peristaltica per controllare il flusso del fluido. Dispone inoltre di un forno a fiala per il riscaldamento del mezzo di reazione, diverse sonde di radioattività e un sensore di pressione per monitorare questi parametri all'interno del sistema. Anche se non così diffuso come alcuni altri modelli, questo automa viene utilizzato abitualmente nel nostro centro ed è installato in un numero crescente di strutture 31,39,40,41,42,43,44. In questo lavoro è stato utilizzato un generatore GALLIAD 68Ge/68Ga senza prepurificazione dell'eluato da 68Ga. Questo metodo è progettato per offrire una soluzione robusta, veloce e conveniente per la produzione di [68Ga]Ga-3BP-3940, ottimizzando anche la protezione dalle radiazioni per gli operatori durante la radiomarcatura. Questo è anche il primo protocollo di preparazione per questo radiofarmaco ad essere riportato su questo specifico modello di sintetizzatore, e in modo così dettagliato.
NOTA: Questo protocollo prevede il lavoro con i radioisotopi. Chiunque conduca questa procedura deve essere adeguatamente addestrato alla manipolazione di materiali radioattivi non sigillati e deve avere l'approvazione del responsabile della sicurezza delle radiazioni del proprio istituto. Il sintetizzatore automatico deve essere collocato in una cella calda schermata designata. Qualsiasi procedura manuale che coinvolga materiali radioattivi deve essere eseguita anche in una cella calda schermata o dietro un'adeguata schermatura dalle radiazioni.
1. Preparazione dei reagenti
NOTA: I reagenti necessari per la produzione automatizzata di [68Ga]Ga-3BP-3940 (vedi Tabella dei materiali) sono stati preparati in un'unità di preparazione di radiofarmaci (camera bianca GMP grado C). I reagenti possono essere preparati in qualsiasi ordine e fino a 2 ore prima della sintesi.
2. Predisposizione delle attrezzature per i controlli di qualità
3. Preparazione del modulo di sintesi
4. Preparazione della cassetta di sintesi e installazione della cassetta
Figura 2: Configurazione del modulo di sintesi. (A) Predisposizione per la sintesi automatizzata di [68Ga]Ga-3BP-3940 sul modulo di sintesi. (B) Dettagli sulle posizioni dei reagenti per la produzione automatizzata di [68Ga]Ga-3BP-3940 utilizzando un modulo di sintesi GAIA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Installazione dei reagenti
Figura 3: Configurazione del kit. Installazione finale del set di tubi e dei reagenti sul sintetizzatore per la radiomarcatura di 3BP-3940 con 68Ga. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Sequenza di radiomarcatura automatizzata per la produzione di [68Ga]Ga-3BP-3940
Figura 4: Profilo tipico di distribuzione della radioattività all'interno del modulo. (A) fiala di reazione; (B) Cartuccia C18 durante la sintesi di [68Ga]Ga-3BP-3940. Il flusso di eluato di 68Ga nella fiala di reazione avviene a 6 minuti. L'attività rimane nella fiala di reazione per tutta la durata della reazione di radiomarcatura. Dopo 16 minuti, l'attività viene trasferita alla cartuccia SPE. La cartuccia viene eluita dopo 19,5 minuti, dopodiché rimane un'attività residua di circa 150 MBq in fase stazionaria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
7. Erogazione e controlli di qualità di [68Ga]Ga-3BP-3940
8. Stabilità della preparazione [68Ga]Ga-3BP-3940
Il processo di sintesi sviluppato sul modulo GAIA consente la radiomarcatura rapida a 68Ga di 3BP-3940 in 21-22 min. Questo protocollo è stato progettato per funzionare con il generatore di grado farmaceutico 68Ge/68Ga GALLIAD, che produce 1,1 mL di eluato di 68Ga in 0,1 M HCl. Il volume e la molarità del tampone di reazione sono stati finemente regolati in base a questa quantità di acido per ottenere un pH di reazione compreso tra 3,5 e 4, ...
Questo lavoro presenta un protocollo di preparazione automatizzato conforme alle GMP per la sintesi di [68Ga]Ga-3BP-3940 utilizzando un modulo GAIA e un generatore GALLIAD. Questo metodo è stato adattato dai protocolli utilizzati nel nostro centro per la radiomarcatura al gallio-68 di vettori come i ligandi PSMA44 e altri inibitori FAP 43,46 per l'imaging clinico PET, con lievi modifiche.
<...Gli autori non hanno partnership commerciali o fonti di finanziamento che comportino un conflitto di interessi reale o percepito relativo a questo lavoro da divulgare.
Gli autori ringraziano Yasmine Soualy, Stéphane Renaud ed Élodie Gaven per il loro aiuto nella preparazione delle reazioni di radiomarcatura presentate in questo manoscritto.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µ filters | VWR | 514-0515 | For filtration of buffer and antioxidant solutions and final radiolabeling product |
Acetonitrile for HPLC | Sigma Aldrich | 34851-2.5L | For HPLC control of radiochemical purity |
Ammonium acetate | Sigma Aldrich | 238074 | For the preparation of one of the mobile phases for TLC control |
C18 column for HPLC | VWR | EQV-3C18-1503 | For HPLC control of radiochemical purity |
Calibrated dose calibrator (CRC25) | Capintec | - | For measuring the radioactivity of the final product and the various components of the module post-synthesis |
Citrate buffer solution, pH 4 | Thermofisher | 258585000 | Mobile phase for TLC controls |
Eppendorf tube 5 mL Biopur | Sigma Aldrich | EP0030119479 | For the preparation of buffer and antioxidant solutions |
Extension line (30 cm) | Vygon | 1159.03 | For the connection of the generator to the tubing set |
Gallium-68 generator | IRE Elit | - | For in situ generation of [68Ga]gallium chloride |
Gamma counter (Hidex AMG) | Hidex | - | For half-life and radiochemical purity assessment |
HPLC station | Shimadzu | - | For HPLC control of radiochemical purity |
iTLC-SG plates | Agilent | SGI0001 | For TLC control of radiochemical purity |
L-methionine | AppliChem | A1340 | For antioxidant solution preparation |
Male/male adapter | Vygon | 893.00 | For the connection of the generator to the tubing set |
Methanol | Sigma Aldrich | 320390-1L | For the preparation of one of the mobile phases for TLC control |
Needles (21G, Sterican) | B Braun | 4657543B | For solution transfers prior to radiolabeling |
pH paper | VWR | 85409.600 | To test the pH of the radiolabelling product |
Pipette 1000 µL (Gilson PIPETMAN) | Fisher Scientific | 12346132-1000 | For precise liquid measurement and transfer |
Pipette 200 µL (Gilson PIPETMAN) | Fisher Scientific | 12326132-200 | For precise liquid measurement and transfer |
Pipette Tips, 100-1000 μL | Charles River | D1000IW | For precise liquid measurement and transfer |
Pipette Tips, 2-200 μL | Charles River | D200IW | For precise liquid measurement and transfer |
Radiochromatograph | Elysia-Raytest | - | For TLC control of radiochemical purity |
Radiosensor for HPLC | Elysia-Raytest | - | For HPLC control of radiochemical purity |
Reagents kit | ABX | RT-101 | Provides ethanol 60%, NaCl 0.9%, WFI bag, C18 cartridge, 0.2 µ terminal filter, aeration needles, terminal needle and waste vial |
Shielded container | LemerPax | For radiation attenuation of the radiolabeling product | |
Single-use plastic spatula | Corning | 3005 | For the preparation of reagents |
Sodium acetate trihydrate EMPROVE | Sigma Aldrich | 1.28204 | For reaction buffer preparation |
Sterile sealed vials (glass type 1) | Curium | TC-ELU-5 | For final conditioning of buffer, antioxidant and radiolabeling solutions |
Sterile tubing set | ABX | RT-01-H | For automated synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940 |
Sterile water for irrigation | B Braun | 0082479E | For the preparation of one of the mobile phases for TLC control |
Synthesis module (GAIA) | Elysia-Raytest | - | For automated synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940 |
Syringe (1 mL, low dead-volume) | B Braun | 9166017V | For peptide in buffer conditionning and addition of methionine in NaCl 0.9% |
Syringes (10 mL) | Becton Dickinson | 309649 | For methionine in NaCl 0.9% and conditionning |
Syringes (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | For methionine and ethanol 60% conditionning |
TLC migration tanks | Fisher Scientific | 50-212-281 | For TLC control of radiochemical purity |
Trifluoroacetic acid (suitable for HPLC) | Sigma Aldrich | 302031-100ML | For HPLC control of radiochemical purity |
Tubes for gamma counter | - | - | For half-life and radiochemical purity assays preparation |
Ultrasonic bath | Selecta | 3000683 | For sonication of prepared solutions |
Vector molecule (3BP-3940) | MedChemExpress | HY-P10131 | Vector molecule to be radiolabeled |
Vial for HPLC with glass insert | Sigma Aldrich | 29385-U and SU860066 | For HPLC control of radiochemical purity |
Vortex mixer | VWR | 444-5900P | For stirring the prepared solutions |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 34877-2.5L-M | For HPLC control of radiochemical purity |
Water for injection, 10 mL flasks | Aguettan | 34009 370 641 0 1 | For solutions preparation |
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