Burada gösterilen teknikler, Enerji ve Tabii Kaynaklar Bakanlığı (Biyoenerji Bilimleri) ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından hibe finansman ile geliştirilmiştir.

Bölüm 1: Büyüyen ve depolama uygun bitki materyali <ol><li> Deneyimlerimize göre, solmuş salatalık fideleri genç hypocotyls hücre duvar malzemesi ile bu deneyler için uygun bir kaynak olarak hizmet vermektedir. Salatalık tohumları, 26 sabit bir sıcaklık odada karanlık bir kabin içinde tutmak bir ışık geçirmez kutu, ° C ıslak kağıt üzerine ekilir C 22 ° ve 30 ° arasında bir şey olarak iyi olmalıdır kesin sıcaklık, kritik değil, ama sıcaklık, fide uygun bir gelişme aşamasına ulaşmak ne kadar hızlı karar verecektir. Sıcak sıcaklık, fide daha hızlı gelişecektir. Genellikle ekim 3-4 gün sonra ulaşılır uzunluğu yaklaşık 5 cm büyüdü fide kullanımı. Işık bile küçük miktarlarda biz bu tekniği ile ölçüm fide gelişimi oranı ve hücre duvarı özelliklerini de etkileyecektir, fide, karanlık yetiştirilen olması çok önemlidir. 3. gün, fide gelişimi kontrol etmek, loş bir yeşil filtrelenmiş ışık kullanarak kutunun içinde gözetleme. </li><li> Fideler hızla kesilir ve küçük bir plastik kutu, kutu başına 100-150 fide dolu ve -80 ° C&#39;de saklanır. Bu sıcaklık hafta için yararlı kalır. </li></ol> Bölüm 2: hücre duvarı örneklerinin hazırlanması <ol><li> Dondurulmuş kesilmiş fideler küçük gruplar (8-10), derin dondurucuda -80 dondurucu bloğu içeren bir izolasyonlu konteyner aktarılır. </li><li> Hipokotil kapsayan manikür carborundum aşınmış. Bu sürekli ıslak carborundum toz kalın bir bulamaç ile kaplı başparmak ve işaret parmağı arasında hipokotil çizerek yapılır. : Çok fazla baskı ve epidermal katman, parçalanmış ve yırtılmış başlar, çok az basınç ve manikür permeabilize olmayacaktır kullanmak doğru basınç miktarını bilmek biraz deneyim alır. Bir de dondurulmuş hipokotil çözülür olarak, onu yönetmek için yumuşak ve sert olur, çünkü hızlı bir şekilde çalışmak zorundadır. </li><li> Kalan hypocotyls benzer bir şekilde hazırlanan aşınmış hipokotil sonra buzlu su bulunan kalarak carborundum ve en kaldırmak için buzlu suya batırılmış. </li><li> Hypocotyls istenilen uzunluğa, 1.2 cm genellikle, yeni bir tek kenarlı jiletle kesilmiş ve ardından bir bardak slayt hizalanır. </li><li> Şimdi hücre özsuyunun kaldırmak ve sıkma kolaylaştırmak için duvarları düzleştirmek için gerekir. Ikinci bir cam slayt, sandviç oluşturan grup 8-10 örneklerinin üstüne yerleştirilir. Ağırlığı (400-500 gr), 5 dakika boyunca cam slayt üst üste yerleştirilir. Ağırlık için rutin olarak uygun bir miktar su içeren bir beher kullanın. </li><li> İsteğe bağlı adım: deney bağlı olarak, hypocotyls Bu noktada kısa bir ısıl işlem ile inaktive olabilir. Bunu yapmak için, cam, lastik bantlar, bir çift ile birlikte slaytlar bağlayan 100 mL deiyonize su ile oda sıcaklığında bir konteyner montaj ve tam güçte bir mikrodalga fırına yerleştirin. Mikrodalga fırın ile yaklaşık 50 s su kaynamaya başlar ve kaynama başladıktan sonra 15 sn mikrodalga durdurmak. Hızlı sıcak su dökülür ve denatürasyon durdurmak için soğuk su ile değiştirilmelidir. Mikrodalga bizimkinden daha farklı olabilir, bu zamanlamaları değişir olabilir. Aşırı ısıtma ile numunelerin zayıflar ve kolayca kırılabilir. Yetersiz ısıtma ile endojen expansin inaktive ve duvar örnekleri asidik pH yanıt korumak değildir. </li></ol> Bölüm 3: Ekstensometre kurulum <ol><li> Duvar örnekleri artık sabit bir kuvvet ekstensometre kenetlenir. Bu duvar örnek ve örnek apikal sonuna kadar bağlı bir hareketli kelepçe bazal ucunu tutmak için bir pleksiglas küvet oluşan bir özel yapılmış bir cihazdır. Hareketli kelepçe açık bir pozisyon sensörü bobinler üzerinden geçen bir çubuk üzerine monte edilmiş, bir LVDT ya da elektronik bir küçük metal silindirin pozisyonunu algılar &#39;Doğrusal Değişken Diferansiyel Trafo&#39;, veya &#39;çekirdek&#39; olduğunu çubuk bağlı. Ayarlanabilir bir karşı ağırlık ile çubuğun üst ucu bir kolu bağlıdır. Bu kolu duvar örnek üzerinde ayarlanabilir bir miktar yukarı yönlü kuvvet uygular. Kuvvet kolu ucunda kalibre metal ağırlıklar ekleyerek veya kaldırarak ayarlanır. </li><li> Duvar örnek hipokotil örnek bazal ince forseps ve apikal sonu ~ 2-3 mm hareketli kelepçe açık çeneleri arasına yerleştirilir ile alınır. Bu kelepçe, metal çeneleri metal yüzeyi ve tampon çözelti veya duvar numune arasında doğrudan temasını önlemek için plastik ile kaplanmış, bir yaylı timsah kelepçe. Deneyimimiz metal iyonları, genişletmek ve bu yüzden metal kaplı tutmak için duvar yeteneğini inhibe kelepçe ile liç ve. </li><li> Holding, bir yandan hareketli kelepçe montaj duvar örnek bazal sonuna Pleksiglas küvet ve küvet iki menteşeli adet arasında manevra.parçaları bir araya getirdi ve böylece küvet duvar örnek alt ucunda kilitleme, sıkı vidalanmış. </li><li> Hareketli kelepçe montaj hafifçe karşı ağırlık tam güç duvar örneği aktarılacak izin yayınladı. Biz rutin olarak toplam 20 gr salatalık hypocotyls hazırlanan duvar örnekleri için bir karşı ağırlık kullanın. Diğer duvar malzeme veya deneyler farklı ağırlıklar gerektirebilir. </li><li> Küvet tamponu ile dolduruldu (200 uL) ve küvet pozisyonu bir ayar vidası ile hareketli kelepçe LVDT ölçüm aralığı alt ucuna getirilir ki, aşağı yukarı taşınmış veya. Bizim LVDT bir mikrobilgisayar bir veri toplama ünitesine bağlı ve bu yüzden bilgisayar aracılığıyla LVDT pozisyonunu izlemek. Biz, bize aynı anda 8 duvar numunelerinin çalışılabilmesi için sağlayan bir bilgisayar ile paralel bağlı sekiz LVDT meclisleri var. Bilgisayar her 30 saniye sonra LVDT meclislerinin her pozisyonda kayıtları </li></ol> Bölüm 4: pH veya expansin Ölçüm uzantısı yanıt Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> [Birinci Deney] asitle indüklenen uzantısı ölçümü için, yerli duvar örnekleri (yani ısı ile inaktive değildir) ve tarafsız bir tampon ile başlar küvet eklenir. Duvar örnekleri eklendi gerilime tepki olarak, birkaç dakika için, genişletmek, ancak uzatma bozunur birkaç dakika sonra düşük bir oran. Bizim bilgisayar bize ya örnek uzunluğu değişimi (Deney başladıktan sonra, hareketli kelepçe pozisyon değişikliği,) monitör ya da başka bir deyişle, uzatma oranı pozisyon türevi izleyebilirsiniz sağlar . Uzantısı oranı düşük bir değere zamanla dengeler. </li><li> ~ 20 dakika sonra, tarafsız bir tampon kaldırılır. Biz büyük bir göstergesi derialtı iğne yapılmış, duvar minimal rahatsızlık veya mekanik montaj, hızlı bir tampon kaldırmak için bir vakum pompası bağlı ince bir metal boru kullanırlar. Asidik tampon sonra asidik tampon tam döviz sigortalamak için 1-2 hızlı değişim, bazen eklenir. Sonra arkanıza yaslanın ve duvar yanıt izlemek. Tipik olarak bir kaç dakika içinde uzantısı daha hızlı tespit edebilir. Ölçümler bazı durumlarda daha uzun süre uzatabilir rağmen biz genellikle 60 dakika sonra, uzatma yanıtı değerlendirmek için yeterli bilgiye sahip. </li><li> [İkinci Experiment] expansin indüklenen hücre duvarının uzantısı ölçümü için, ısı ile inaktive edilmiş duvar örnekleri ve asidik tampon ile başlar, küvet eklenir . İlk Deneyim olduğu gibi, hücre duvarı uzantısı oranı giderek fonksiyonel expansin eksikliği nedeniyle düşük bir değere stabilize. </li><li> ~ 20 dakika sonra, expansin protein, küvet tamponu ile bir expansin çözüm 10-20 uL &#39;spike&#39; küvet eklenir. Expansin hücre duvarı örnek hızla nüfuz eder ve birkaç dakika içinde uzantısı oranının arttığını görüyoruz. Bu uzantı, bir saat veya daha fazla yanıt takip edilebilir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> Şekil 1: asit-indüklenen veya expansin indüklenen duvar uzantısı değerlendirmek için hücre duvarlarının hazırlamak için prosedürlerin Anahat.

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls.">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li><li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well.">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li><li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima.">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins.">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li><li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants.">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li></ol>

Bu gösteri için, ele almak ve iyi bir duyarlılık ile tepki verdiği için kolay duvar örneklerinin güvenilir bir kaynak olduğunu kanıtladı, çünkü biz salatalık hypocotyls hücre duvarlarının kullandı. Ayrıca, genç ıspanak yaprakları ve kereviz sapı gibi süpermarket diğer fide gibi bazı malzemeler, duvarları ile iyi bir başarı oldu. Temel olarak, genç, yumuşak, hızla büyüyen bitki dokularında, bu teknik ile kolayca ölçülebilir olması muhtemeldir, ama sağlam, eski, okside veya nongrow...

measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic ph and by alpha-expansin

Büyüyen bitki hücre duvarları, karakteristik bir özellik daha düşük pH (&lt;5) 1 genişletilebilir demek olan &#39;asit büyüme&#39; olarak bilinen sergilerler . Bitki hormonu oksin hızla bir asit-büyüme mekanizması 2, 3, en azından kısmen genç sapları ve benzeri dokuların hücre uzama uyarır . Oksin H aktive + plazma membran pompası, hücre duvarı çözümü asitlenme neden. Duvar asitlenme hücre duvarı hücre turgor basıncı ile oluşturulan duvar gerilimlere verim neden endojen hücre duvarı gevşemeye proteinler 4 expansins etkinleştirir. Sonuç olarak, hücre hızla büyütmek için başlar. Bu &#39;asit büyüme&#39; fenomen kolaylıkla izole (cansız) hücre duvarı örneklerinin ölçülür. Hücre duvarlarının asitle indüklenen uzantısı geçmesi yeteneği sadece hücre duvarı polisakkaritler (örneğin pektinler) yapısal düzenlemenin sonucu değildir, ancak 5 expansins aktivitesine bağlıdır. Expansins bilinen herhangi bir enzimatik aktivitesi yoktur ve expansin aktivite için tahlil etmenin tek yolu, hücre duvarının uzantısı indüksiyon ölçmek için. Bu video raporunun ayrıntıları expansin deneyleri için uygun duvar malzemeleri elde etmek için kaynakları ve hazırlama teknikleri ve asit-indüklenen uzatma ve artan salatalık hypocotyls hazırlanan duvar örneklerinin expansin indüklenen uzantısı göstermeye devam ediyor. Uygun hücre duvarı örnekleri elde etmek için, salatalık fideleri karanlıkta yetiştirilen, hypocotyls -80 kesilmiş ve donmuş ° C Dondurulmuş hypocotyls, aşınmış, basık, ve sonra sürekli bir gerginlik ekstensometre ölçümleri için özel bir küvete kenetli. Asit kaynaklı uzantısı ölçmek için, duvarlar, başlangıçta yerel hücre duvarlarının bileşenleri expansins düşük aktivite, nötr pH arabelleğe alınır. Asidik pH tampon değişimi üzerine, expansins aktif ve hücre duvarlarının hızla uzanır. Biz aynı zamanda bir sulandırıldıktan tahlil expansin faaliyet göstermektedir. Bu bölümde, biz hücre duvarı örnekleri yerli expansins doğasını kısa bir ısıl işlem kullanın. Bu inaktive edilmiş hücre duvarlarını bile asidik tampon uzatmak yok, ama expansins hücre duvarlarının yanı sıra yeteneklerini genişletmek için hızla geri.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin at JoVE.com

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Biz asidik tamponlar ve expansin protein ile indüklenen bitki hücre duvarı örneklerinin uzun vadeli uzantısı (creep) ölçmek için, sabit bir kuvvet ekstensometresinin kullanımını göstermektedir.

Asidik pH ve Alpha-Expansin İndüklenmiş Ölçüm Bitki Hücre Duvarı Uzantısı (Creep)

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

13.9K Görüntüleme.  Penn State University. Biz asidik tamponlar ve expansin protein ile indüklenen bitki hücre duvarı örneklerinin uzun vadeli uzantısı (creep) ölçmek için, sabit bir kuvvet ekstensometresinin kullanımını göstermektedir.

Video: Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Title Cell Encapsulation by Droplets

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

Biyoloji

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Aerobik Mantarlar Kontrollü Bitki Doku Ayrışma Agar-Blok Microcosms

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

Ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla Dökme ve Protein Jel Koşu

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...