Die hier gezeigten Techniken wurden mit Förderung durch Zuschüsse aus dem Department of Energy (Bioenergy Sciences) und der National Science Foundation entwickelt.

Teil 1: Anbau und Lagerung geeignet Pflanzenmaterial <ol><li> Nach unserer Erfahrung dienen junge Hypokotylen aus etiolierten Gurkenkeimlingen als eine bequeme Quelle für Zellwandmaterial für diese Experimente. Gurken Samen werden auf feuchtem Papier in einer lichtdichten Box, die in einem abgedunkelten Schrank in einem Raum mit konstanter Temperatur bei 26 gesetzt ist ° C zu halten gesät Die genaue Temperatur ist nicht entscheidend, wie alles, was zwischen 22 ° und 30 ° C sollte in Ordnung sein, aber die Temperatur bestimmen, wie schnell die Sämlinge eine angemessene Stufe der Entwicklung zu erreichen. Je wärmer die Temperatur, desto schneller werden die Sämlinge entwickeln. Wir verwenden in der Regel Sämlinge, wenn sie auf ca. 5 cm in der Länge, die 3-4 Tagen erreicht wird nach der Aussaat gewachsen. Es ist wichtig, dass die Sämlinge im Dunkeln gezüchtet werden, da schon geringe Mengen von Licht beeinflussen sowohl die Rate der Keimling Entwicklung und der Zellwand Eigenschaften, die wir mit dieser Technik zu messen. Am Tag 3 können Sie Einblick in die Box, mit einem dunklen grün gefilterte Licht, auf Sämling Entwicklung zu überprüfen. </li><li> Sämlinge sind schnell geschnitten und verpackt in kleinen Plastikdosen, 100-150 Sämlinge pro Feld und bei -80 ° C. Bei dieser Temperatur bleiben sie nützlich für Wochen. </li></ol> Teil 2: Vorbereiten Zellwand Proben <ol><li> Kleine Gruppen (8-10) von gefrorenen Schnitt Sämlinge aus dem Gefrierschrank, um eine isolierte Behälter mit einer -80 Gefrierschrank Block übertragen. </li><li> Die Kutikula für das Hypokotyl ist mit Carborundum abgerieben. Dies wird durch wiederholtes Ziehen der Hypokotyl zwischen Daumen und Zeigefinger, die mit einem dicken Brei aus nassen carborundum pulverbeschichtet sind fertig. Es dauert ein wenig Erfahrung, um die richtige Menge an Druck zu nutzen wissen: zu viel Druck und die Epidermis beginnt zu geschreddert und zerrissen, zu wenig Druck und die Nagelhaut wird nicht permeabilisiert werden. Man muss auch schnell arbeiten, weil die gefrorenen Hypokotyl taut, es schlaff und schwer zu verwalten wird. </li><li> Der Abrieb Hypokotyl ist in Eiswasser getaucht, um die meisten der anhaftenden Carborundum und dann auf Eiswasser gelagert zu entfernen, während die restlichen Hypokotylen in ähnlicher Weise zubereitet werden. </li><li> Die Hypocotyle sind auf die gewünschte Länge, in der Regel 1,2 cm schneiden, mit einem neuen einschneidig Rasierklinge und dann auf eine Glasplatte ausgerichtet. </li><li> Jetzt müssen wir die Wände zu reduzieren, um Zellsaft zu entfernen und zu erleichtern Spannen. Eine zweite Glasplatte befindet sich oben auf die Gruppe von 8-10 Proben platziert und bildet ein Sandwich. Ein Gewicht (400-500 g) befindet sich oben auf dem Objektträger für 5 min gestellt. Für das Gewicht verwenden wir routinemäßig ein Becherglas mit einer geeigneten Menge Wasser. </li><li> Optionaler Schritt: Je nach Experiment, die Hypokotyle kann mit einer kurzen Wärmebehandlung an dieser Stelle inaktiviert werden. Dazu binden wir die Glasplatten zusammen mit einem Paar von Gummibändern, legen Sie die Montage in einen Behälter mit 100 ml deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur und legen Sie sie in der Mikrowelle bei voller Leistung. Mit unserer Mikrowelle das Wasser beginnt bei ca. 50 s kochen und wir stoppen die Mikrowelle 15 s nach dem Kochen beginnt. Das heiße Wasser wird schnell abgegossen und ersetzt mit kaltem Wasser, um eine Denaturierung zu stoppen. Eventuell müssen Sie diese Zeiten variieren, wie Ihre Mikrowelle kann anders als bei uns. Mit übermäßige Erwärmung der Proben werden schwach und brechen leicht. Bei ungenügender Beheizung des endogenen expansin nicht inaktiviert und der Wand Proben behalten einige Reaktionsfähigkeit auf sauren pH-Wert. </li></ol> Teil 3: Extensometer Setup <ol><li> Die Wand Proben werden nun in einer konstanten Kraft Extensometer geklemmt. Dies ist eine custom-built-Gerät, das aus einem Plexiglas Küvette besteht für die Abhaltung der basalen Ende der Wand Probe und eine bewegliche Klemme an der apikalen Ende der Probe. Die beweglichen Bügel am Ende einer Stange, die durch die offenen Spulen von einem Lagesensor Pässe montiert ist, ein LVDT oder &quot;Linear Variable Differential Transformer&quot;, die elektronisch erfasst die Position eines kleinen Metallzylinder oder &quot;Kern&quot;, das heißt an der Stange. Das obere Ende der Stange ist mit einem Hebel mit einem verstellbaren Gegengewicht verbunden. Dieser Hebel wirkt eine einstellbare Menge an aufwärts gerichtete Kraft auf die Wand Probe. Die Kraft wird durch das Hinzufügen oder Entfernen kalibrierten Gewichten aus Metall zum anderen Ende des Hebels eingestellt. </li><li> Zurück an der Wand Probe - der basalen Ende des Hypokotyl Probe wird mit feinen Pinzetten und ~ 2-3 mm von der apikalen Ende ist in zwischen den geöffneten Rachen des beweglichen Klammer gesetzt abgeholt. Diese Klemme ist eine federbelastete Krokodilklemme, deren Metall-Backen sind mit Kunststoff beschichtet, um einen direkten Kontakt zwischen der Metalloberfläche und der Pufferlösung oder an der Wand Probe zu verhindern. In unserer Erfahrung Metallionen können Lauge aus der Klemme und hemmen die Wand der Fähigkeit zu erweitern, und so halten wir das Metall bedeckt. </li><li> Halten Sie die beweglichen Klemmanordnung in einer Hand, ist die basale Ende der Wand Exemplar jetzt zwischen den beiden klappbaren Teile des Plexiglas Küvette und die Küvette manövriertStücke werden zusammen gebracht und fest verschraubt, damit Verriegelung am unteren Ende der Wand Probe in der Küvette. </li><li> Die bewegliche Klammer Montage ist nun sanft gelöst, so dass die volle Kraft der Gegengewichte an der Wand Probe übertragen werden. Wir verwenden routinemäßig insgesamt Gegengewicht von 20 g für die Wand-Proben aus Gurke Hypokotylen vorbereitet. Andere Wandmaterialien oder Experimente könnten erfordern unterschiedliche Gewichte. </li><li> Die Küvette wird mit Puffer gefüllt (200 UL) und die Position der Küvette nach oben oder unten mit einer Stellschraube, so dass die bewegliche Klemme am unteren Ende des LVDT Messbereich gebracht wird. Unsere LVDT ist es, eine Datenerfassungseinheit von einem Mikrocomputer verbunden ist, und so beobachten wir LVDT Position durch den Computer. Wir haben acht LVDT Baugruppen parallel mit einem Computer, die uns zu 8 Wand Proben gleichzeitig laufen zu lassen verbunden. Der Computer zeichnet die Position von jedem der LVDT Baugruppen einmal alle 30 s. </li></ol> Teil 4: Mess-Erweiterung als Reaktion auf saure pH-Wert oder expansin - Repräsentative Ergebnisse <ol><li> [First Experiment] Für die Messung des Säure-induzierten Verlängerung, beginnen wir mit einheimischen Wand Proben (dh nicht mit Hitze inaktiviert) und neutralen Puffer wird in die Küvette gegeben. Die Wand Proben zu verlängern für ein paar Minuten, in Reaktion auf die zusätzliche Spannung, aber die Erweiterung zerfällt zu einer niedrigen Rate nach ein paar Minuten. Unsere Computer lässt uns Monitor entweder die Veränderung der Länge der Probe (dh die Veränderung der Position des beweglichen Klammer, nach dem Start des Experiments), oder wir können die zeitliche Ableitung der Position zu überwachen, in anderen Worten: die Rate der Erweiterung . Die Erweiterung Rate stabilisiert auf einen niedrigen Wert mit der Zeit. </li><li> Nach ca. 20 min, ist die neutrale Puffer entfernt. Wir verwenden ein dünnes Metallrohr, aus einer großen Spurweite Injektionsnadel aus, verbunden mit einer Vakuumpumpe in den Puffer schnell zu entfernen, mit minimaler Störung der Wand oder der mechanischen Montage. Saure-Puffer zugegeben, manchmal mit 1-2 schnellen Austausch der kompletten Austausch zu sauren Puffer zu versichern. Dann haben wir lehnen Sie sich zurück und beobachten Sie die Reaktion der Wand. In der Regel können wir die Beschleunigung der Erweiterung in wenigen Minuten zu erkennen. Nach 60 min wir haben in der Regel genügend Informationen, um die Erweiterung Antwort zu bewerten, obwohl in einigen Fällen die Messungen auf längere Zeiträume erstrecken können. </li><li> [Zweiter Versuch] Zur Messung der expansin-induzierte Zellwand-Erweiterung, beginnen wir mit hitzeinaktiviertem Wand Proben und sauren Puffer in die Küvette gegeben. Wie bei dem ersten Versuch, die Rate der Zellwand Erweiterung allmählich stabilisiert auf einen niedrigen Wert, weil der Mangel an funktionellen expansin. </li><li> Nach ca. 20 min ist expansin Protein in die Küvette durch &quot;Aufstocken&quot; mit dem Puffer in die Küvette mit 10-20 uL einer expansin Lösung gegeben. Die expansin schnell dringt durch die Zellwand Probe und innerhalb weniger Minuten sehen wir, dass die Erweiterung gestiegen ist. Diese Erweiterung Antwort kann für eine Stunde oder mehr verfolgt werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> Abbildung 1: Überblick über Verfahren zur Vorbereitung der Zellwände zu Säure-induzierte oder expansin-induzierte Wandfortsatz beurteilen.

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls.">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li><li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well.">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li><li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima.">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins.">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li><li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants.">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li></ol>

Für diese Demonstration verwendeten wir Zellwände von Gurken Hypokotylen, weil sie sich als eine zuverlässige Quelle für Wand-Proben, die leicht zu handhaben und mit guter Empfindlichkeit reagieren werden müssen. Wir haben auch schon gute Erfolge mit Wänden aus anderen Keimlingen sowie einige Materialien aus dem Supermarkt, wie junge Spinatblätter und Stangensellerie. Grundsätzlich sind jung, weich, schnell wachsende Pflanzengewebe wahrscheinlich leicht mit dieser Technik gemessen werden, sondern harte, alte, ox...

measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic ph and by alpha-expansin

Wachsende pflanzlichen Zellwände charakteristisch weisen eine Eigenschaft als &quot;Säure Wachstum&quot;, mit denen wir meinen, sie sind mehr erweiterbare bei niedrigen pH-Wert (&lt;5) 1 bekannt. Das Pflanzenhormon Auxin schnell stimuliert Zellstreckung in jungen Stängel und ähnliche Gewebe zumindest teilweise durch eine Säure-Wachstums-Mechanismus 2, 3. Auxin aktiviert eine H +-Pumpe in der Plasmamembran, Versauerung der Zellwand Lösung. Wand Versauerung aktiviert expansins, die endogene Zellwand-Lockerung Proteine ​​4 sind, wodurch die Zellwand an der Wand Spannungen, die durch Zelle Turgor erstellt Ertrag. Als Folge beginnt die Zelle rasch vergrößern. Diese &quot;acid Wachstum&quot; Phänomen ist leicht in isolierten (unbelebten) Zellwand Proben gemessen. Die Fähigkeit der Zellwände zu Säure-induzierte Erweiterung unterzogen wird nicht einfach das Ergebnis der strukturellen Anordnung der Zellwand-Polysaccharide (zB Pektine), sondern hängt von der Aktivität der expansins 5. Expansins haben noch keine bekannten enzymatischen Aktivität und der einzige Weg, um Assay für expansin Aktivität ist es, ihre Induktion von Zellwand-Erweiterung zu messen. Dieses Video Bericht beschreibt ausführlich die Quellen und die Vorbereitung Techniken zur Gewinnung von geeigneten Wandmaterialien für expansin Assays und fährt fort, Säure-induzierte Verlängerung und expansin-induzierte Verlängerung der Wand Proben aus wachsenden Gurke Hypokotylen vorbereitet zu zeigen. Um geeignete Zellwand Proben, Gurkenkeimlingen im Dunkeln gezüchtet werden, die Hypokotyle geschnitten und bei -80 ° C eingefroren Gefrorene Hypokotylen abgetragen, abgeflacht, und dann bei konstanter Spannung in eine spezielle Küvette für Extensometer Messungen gespannt. Zur Messung säureinduzierte Erweiterung, die Wände sind zunächst im neutralen pH-gepuffert, so dass eine niedrige Aktivität der expansins, dass Komponenten des nativen Zellwände. Nach Puffer Austausch zu sauren pH-Wert, sind expansins aktiviert und die Zellwände zu verlängern schnell. Wir zeigen auch expansin Aktivität in einer Rekonstitution Assay. Für diesen Teil verwenden wir eine kurze Wärmebehandlung auf die native expansins in der Zellwand Proben zu denaturieren. Diese inaktivierten Zellwände nicht einmal verlängern in sauren Puffer, sondern zusätzlich von expansins die Zellwände schnell wieder ihre Fähigkeit, zu verlängern.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin at JoVE.com

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Wir zeigen die Verwendung eines konstanten Kraft Extensometer zur langfristigen Erweiterung (Kriechen) der pflanzlichen Zellwand Proben von sauren Puffern und expansin Protein induziert messen.

Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

13.9K Aufrufe.  Penn State University. Wir zeigen die Verwendung eines konstanten Kraft Extensometer zur langfristigen Erweiterung (Kriechen) der pflanzlichen Zellwand Proben von sauren Puffern und expansin Protein induziert messen.

Serie: Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

Forschung

Biologie

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block Mikrokosmen für Controlled Pflanzengewebekultur Zersetzung durch aerobe Pilze

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

Gießen und Ausführen eines Protein-Gel durch die Wiederverwendung von Gewerbe-Kassetten

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...