Les techniques présentées ici ont été développées grâce à un financement par des subventions du ministère de l&#39;Énergie (Sciences de la bioénergie) et la National Science Foundation.

Partie 1: La culture et le stockage du matériel végétal adapté <ol><li> Dans notre expérience, de jeunes plants hypocotyles étiolés concombre servir une source pratique de matériau de paroi cellulaire pour ces expériences. Graines de concombre sont semées sur le papier humide dans une boîte étanche à la lumière, ce qui est de garder dans une armoire sombre dans une pièce à température constante fixée à 26 ° C. La température exacte n&#39;est pas critique, comme quelque chose entre 22 ° et 30 ° C devrait être bon, mais la température sera de déterminer à quelle vitesse les plants atteignent un stade approprié de développement. Le réchauffement de la température, plus le semis se développeront. Nous utilisons généralement des plants quand ils ont passé à environ 5 cm de longueur, qui est atteint 3-4 jours après le semis. Il est important que la plantule être cultivés dans l&#39;obscurité, que même de petites quantités de lumière affectent à la fois le taux de développement des semis et les propriétés paroi cellulaire que l&#39;on mesure avec cette technique. Au jour 3, vous pouvez coup d&#39;oeil dans la boîte, en utilisant une faible lumière verte filtrée, pour vérifier sur le développement des plantules. </li><li> Les plants sont rapidement coupés et emballés dans des petits boîtes en plastique, 100-150 plants par boîte, et conservés à -80 ° C. A cette température, ils restent utiles pendant des semaines. </li></ol> Partie 2: Préparation des échantillons paroi cellulaire <ol><li> De petits groupes (8-10) des plants coupés congelés sont transférés du congélateur pour un conteneur isotherme contenant un bloc de congélation -80. </li><li> La cuticule qui couvre l&#39;hypocotyle est abrasé avec carborundum. Cela se fait en plusieurs reprises le dessin de l&#39;hypocotyle entre le pouce et l&#39;index, qui sont recouverts d&#39;une boue épaisse de poudre de carborundum humide. Il faut un peu d&#39;expérience pour connaître le montant exact de la pression d&#39;utilisation: trop de pression et de la couche épidermique commence à être déchiquetés et déchirés, trop peu de pression et de la cuticule ne sera pas perméabilisées. On doit aussi travailler rapidement parce que le dégel congelé hypocotyle, il devient flasque et difficile à gérer. </li><li> L&#39;hypocotyle abrasé est plongé dans l&#39;eau glacée pour enlever la plupart du carborundum adhérant puis stockés sur l&#39;eau glacée tout en restant les hypocotyles sont préparés d&#39;une manière semblable. </li><li> Les hypocotyles sont coupées à la longueur désirée, généralement de 1,2 cm, avec une lame de rasoir nouvelles seul tranchant, puis alignés sur une lame de verre. </li><li> Maintenant nous avons besoin d&#39;aplatir les murs pour enlever la sève cellulaire et de faciliter serrage. Une seconde lame de verre est placée sur le dessus du groupe de 8-10 échantillons, formant un sandwich. Un poids (400-500 g) est placé sur le dessus de la lame de verre pendant 5 min. Pour le poids nous avons l&#39;habitude d&#39;utiliser un bécher contenant une quantité appropriée d&#39;eau. </li><li> Étape facultative: Selon l&#39;expérience, les hypocotyles peut être inactivé par un traitement thermique brève à ce point. Pour ce faire, nous lier les lames de verre avec une paire de bandes de caoutchouc, de placer l&#39;ensemble dans un récipient avec 100 ml d&#39;eau déminéralisée à température ambiante et le placer dans un four à micro-ondes à pleine puissance. Avec notre four à micro-ondes de l&#39;eau commence à bouillir à environ 50 s et nous nous arrêtons au micro-ondes 15 s après l&#39;ébullition commence. L&#39;eau chaude est rapidement vidé et remplacé par de l&#39;eau froide pour arrêter la dénaturation. Vous pouvez avoir à modifier ces horaires, en tant que votre micro-ondes peut être différente de la nôtre. Avec l&#39;échauffement excessif des échantillons deviennent faibles et se brisent facilement. Avec un chauffage insuffisant du expansine endogènes n&#39;est pas inactivé et les échantillons mur de conserver une certaine réactivité à pH acide. </li></ol> Partie 3: configuration Extensomètre <ol><li> Les échantillons murs sont désormais bridée dans un extensomètre à force constante. Ceci est un dispositif sur mesure qui consiste d&#39;une cuvette en plexiglas pour la tenue de l&#39;extrémité basale de l&#39;échantillon mur et une pince amovible fixé à l&#39;extrémité apicale de l&#39;échantillon. La pince mobile est monté à l&#39;extrémité d&#39;une tige qui traverse les bobines ouverte d&#39;un capteur de position, un LVDT ou «transformateur différentiel», qui détecte électroniquement la position d&#39;un cylindre métallique de petites ou «de base», qui est attachée à la tige. L&#39;extrémité supérieure de la tige est reliée à un levier avec un contrepoids ajustable. Ce levier exerce une valeur réglable de force à la hausse sur l&#39;échantillon mur. La force est ajustée en ajoutant ou en enlevant des poids métalliques calibrée à l&#39;extrémité du levier. </li><li> Retour à l&#39;échantillon de mur - l&#39;extrémité basale de l&#39;échantillon hypocotyle est ramassé avec une pince fine et ~ 2-3 mm de l&#39;extrémité apicale est placé entre les mâchoires ouvertes de la pince mobile. Cette pince est une pince crocodile à ressort dont les mâchoires sont en métal recouvert de plastique pour empêcher tout contact direct entre la surface du métal et la solution tampon ou de l&#39;échantillon mur. Dans notre expérience ions métalliques peuvent être lessivés de la pince et d&#39;inhiber la capacité du mur à étendre, et si nous gardons le métal couvert. </li><li> En tenant l&#39;ensemble de serrage mobiles dans une main, l&#39;extrémité basale de l&#39;échantillon de mur est désormais manoeuvré entre les morceaux articulée en deux de la cuvette en plexiglas et la cuvetteles pièces sont réunies et vissée, verrouillant ainsi l&#39;extrémité inférieure de l&#39;échantillon mur dans la cuvette. </li><li> L&#39;assemblage de serrage mobile est désormais publié en douceur, permettant la pleine force de contrepoids à être transférée à l&#39;échantillon de mur. Nous utilisons régulièrement un contrepoids total de 20 g pour les échantillons préparés à partir d&#39;hypocotyles mur de concombre. Autres matériaux des murs ou des expériences pourraient exiger des poids différents. </li><li> La cuvette est remplie avec le tampon (200 uL) et la position de la cuvette vers le haut ou vers le bas avec une vis de réglage, de sorte que la pince mobile est amené à l&#39;extrémité inférieure de la plage de mesure LVDT. Notre LVDT est connecté à une unité d&#39;acquisition de données d&#39;un micro-ordinateur, et si nous suivons la position LVDT à travers l&#39;ordinateur. Nous avons huit assemblées LVDT connecté en parallèle avec un ordinateur, ce qui nous permet d&#39;exécuter simultanément 8 échantillons mur. L&#39;ordinateur enregistre la position de chacune des assemblées LVDT fois toutes les 30 s. </li></ol> Partie 4: extension de la réponse à la mesure de pH acide ou expansine - Résultats Représentant <ol><li> [Première expérience] Pour la mesure de l&#39;acide-induced extension, nous commençons avec des échantillons de mur natif (qui est, non pas inactivé par la chaleur) et un tampon neutre est ajouté à la cuvette. Les échantillons mur de prolonger de quelques minutes, en réponse à la tension ajoutée, mais les désintégrations extension à un faible taux après quelques minutes. Notre ordinateur nous permet de suivre soit la variation de longueur de l&#39;échantillon (qui est, le changement de position de la pince amovible, après le début de l&#39;expérience) ou nous pouvons suivre la dérivée temporelle de la position, en d&#39;autres termes le taux d&#39;extension . Le taux d&#39;extension se stabilise à une valeur faible avec le temps. </li><li> Après environ 20 minutes, le tampon neutre est supprimé. Nous utilisons un tuyau de métal mince, fabriqué à partir d&#39;une aiguille hypodermique de gros calibre, relié à une pompe à vide pour enlever le tampon rapidement, avec une perturbation minimale de la paroi ou l&#39;assemblage mécanique. Tampon acide est ensuite ajouté, parfois avec 1-2 échanges rapides pour assurer l&#39;échange complet de tampon acide. Ensuite, nous s&#39;asseoir et regarder la réponse de la paroi. Typiquement on peut détecter l&#39;accélération du rythme de l&#39;extension, en quelques minutes. Après 60 min nous avons habituellement suffisamment d&#39;informations pour évaluer la réponse d&#39;extension, bien que dans certains cas, les mesures peuvent s&#39;étendre à de plus longues périodes. </li><li> [Deuxième expérience] Pour la mesure de l&#39;extension expansine induite paroi cellulaire, nous commençons avec des échantillons de mur inactivé à la chaleur et le tampon acide est ajouté à la cuvette. Comme dans la première expérience, le taux d&#39;extension paroi cellulaire se stabilise progressivement à une valeur faible en raison du manque de expansine fonctionnelle. </li><li> Après environ 20 minutes, les protéines expansine est ajouté à la cuvette par «dopage» avec le tampon dans la cuvette avec 10-20 uL d&#39;une solution expansine. Le expansine pénètre rapidement l&#39;échantillon paroi cellulaire et en quelques minutes, nous voyons que le taux d&#39;extension a augmenté. Cette réponse d&#39;extension peut être suivie pendant une heure ou plus. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> Figure 1: Schéma des procédures de préparation des parois cellulaires pour évaluer induite par l&#39;acide ou de l&#39;extension expansine induite mur.

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls.">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li><li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well.">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li><li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima.">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins.">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li><li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants.">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li></ol>

Pour cette démonstration, nous avons utilisé les parois cellulaires des hypocotyles de concombre, parce qu&#39;ils se sont révélés être une source fiable d&#39;échantillons mur qui sont faciles à manipuler et qui répondent avec une bonne sensibilité. Nous avons également eu de bons résultats avec des murs d&#39;autres plants ainsi que certains matériaux du supermarché, comme les feuilles d&#39;épinards jeunes et les tiges de céleri. Fondamentalement, jeune, doux, les tissus végétaux à croissance rapid...

measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic ph and by alpha-expansin

Growing parois des cellules végétales présentent une caractéristique propriété connue comme «la croissance d&#39;acide&quot;, par laquelle nous entendons qu&#39;ils sont plus extensibles à pH faible (&lt;5) 1. L&#39;hormone végétale auxine stimule rapidement l&#39;élongation cellulaire dans les jeunes tiges et les tissus similaires au moins en partie par un mécanisme acide-croissance de 2, 3. L&#39;auxine active une pompe à H + dans la membrane plasmique, provoquant l&#39;acidification de la solution de la paroi cellulaire. L&#39;acidification Mur active expansines, qui sont endogènes relâchement de la paroi cellulaire des protéines-4, causant de la paroi cellulaire de céder à des tensions mur créé par la pression de turgescence cellulaire. En conséquence, la cellule commence à élargir rapidement. Ce phénomène de «croissance acide» est facilement mesurable dans les régions isolées (non vivantes) spécimens paroi cellulaire. La capacité des parois cellulaires de se soumettre à l&#39;acide-induced extension n&#39;est pas simplement le résultat de l&#39;agencement structurel des polysaccharides des parois cellulaires (pectines, par exemple), mais dépend de l&#39;activité des expansines 5. Expansines n&#39;ont aucune activité enzymatique connue et la seule façon de dosage de l&#39;activité expansine est de mesurer leur induction de l&#39;extension des parois cellulaires. Ce reportage vidéo détaille les sources et les techniques de préparation pour obtenir des matériaux mur approprié pour les dosages expansine et continue de montrer induite par l&#39;acide extension et expansine induite par l&#39;extension des échantillons préparés à partir d&#39;hypocotyles mur de concombre en pleine croissance. Pour obtenir des échantillons de la paroi cellulaire appropriée, des plants de concombre est cultivé dans l&#39;obscurité, les hypocotyles sont coupés et congelés à -80 ° C. Hypocotyles congelés sont abrasées, aplati, puis serré à une tension constante dans une cuve spéciale pour les mesures extensomètre. Pour mesurer l&#39;extension induite par l&#39;acide, les murs sont d&#39;abord tamponné à pH neutre, résultant en une faible activité de expansines qui sont des composants des parois cellulaires d&#39;origine. Après échange de tampon à pH acide, expansines sont activés et les parois des cellules s&#39;étendent rapidement. Nous démontrons également l&#39;activité expansine dans un essai de reconstitution. Pour cette partie, nous utilisons un traitement thermique pour dénaturer les brèves expansines natif dans les échantillons de la paroi cellulaire. Ces parois cellulaires inactivés ne s&#39;étendent pas, même en tampon acide, mais l&#39;addition de expansines aux parois cellulaires rétablit rapidement leur capacité à étendre.

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Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;un extensomètre à force constante pour mesurer extension à long terme (fluage) de spécimens de plantes de la paroi cellulaire induite par les tampons acides et protéines expansine.

Mesure Extension mur cellulaire végétale (Creep) induite par un pH acide et par Alpha-expansine

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

13.9K vues.  Penn State University. Nous démontrons l'utilisation d'un extensomètre à force constante pour mesurer extension à long terme (fluage) de spécimens de plantes de la paroi cellulaire induite par les tampons acides et protéines expansine.

Vidéo: Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes

Recherche

Biologie

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l&#39;expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block microcosmes pour la décomposition des tissus végétaux contrôlés par des champignons aérobie

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

Verser et exécution d&#39;un gel de protéine en réutilisant Cassettes commerciaux

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profilage Glycan des polymères végétaux de la paroi cellulaire en utilisant Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots pour surveiller cellulaire spécifique d&#39;un tissu mural Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...