Yazarlar Modifiye Epiderm SIT (5 Çok merkezli Uluslararası Doğrulama Çalışması katılımı için BfR (Almanya), BASF SE (Almanya), IIVS A.Ş. (ABD), Zet-LSL (Avusturya) ZEBET teşekkür etmek istiyorum .)

I. Doku Klima - Gün 0 <ol><li> Epiderm EPI-200-SİT kiti aldıktan sonra, bütünlüğü için tüm kit bileşenleri (kit ayrıntılı bilgi için özel reaktifler ve ekipman Tablo bakınız) kontrol edin. </li><li> Her üç Epiderm dokular için, bir tahlil orta 0.9 ml steril 6 plaka önceden doldurulmuş hazırlar. </li><li> Epiderm dokular içeren 24 plaka içeren plastik torba steril koşullar altında, açık ve steril bir gazlı bez çıkarın. </li><li> Epiderm doku içeren her eklemek kaldırmak ve 24 boş plaka ekleme yerleştirmek için steril forseps kullanın. Bu adım sırasında, steril filtre kağıdı blot nazik eklemek dış kenarlarına yapışır kalan nakliye agaroz çıkarın. </li><li> Sonraki 5 dakika içinde, dokular görsel olarak kontrol edin. Tamamen sıvı ile kaplıdır kusurlu doku ya da doku kullanmayın. </li><li> Steril pamuk uçlu çubuk yardımıyla, dokuların yüzey dikkatlice kurutun. Doğrudan doku dokunmamaya çalışın - kılcal etkileri doku yüzeyinin nemi çıkarmak için yeterli. </li><li> Doku yüzeyinin kurutulduktan sonra, 6-kuyucuğu 0.9 mL tahlil orta önceden doldurulmuş üst satırındaki üç doku transferi. Ekler altında sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakın. </li><li> 60 kuvöz içine ekler içeren 6-kuyucuğu yerleştirin ± 5 dakika ön-inkübasyon 37 ° ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH (Bağıl Nem). </li><li> 60 ± 5 dk ön kuluçka dönemi sonunda, 6-plaka alt kuyulara üst kuyulardan ekler aktarın. Inkübatör geri tabak koyun (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) bir gece için ön-inkübasyon (18 ± 3 saat). </li><li> Buzdolabında (5 ± 3 ° C). Tahlil orta geri kalanını yerleştirin. Gecelik ön inkübasyon sonrasında, test kimyasalları Epiderm dokulara uygulanabilir. Not: ön inkübasyon prosedürü (dokular Salı Çarşamba günü yerine gelirse gibi) geç doku teslim durumunda kısaltılabilir. </li></ol> II. Kimyasal maruz kalma - 1. Gün <ol><li> Sadece 0.9 ml başına iyi tahlil orta üst sıra dolum testi kimyasal başına bir adet 6-plaka hazırlayın. </li><li> Yaklaşık 5 dakika planlanan kimyasallara maruz kalmadan önce, inkübatör öncesi klimalı dokular içeren 6 kuyucuğu çıkarın. </li><li> Dokuların yüzey değerlendirin ve steril pamuk ipuçlarını kullanarak herhangi bir nem kaldırmak. </li><li> Tüm 6 plaka kapakları test malzeme kodları veya isimleri ile etiketleyin. </li><li> Doz 1 dakikalık aralıklarla test kimyasallar ile dokuların maruz kaldıktan sonra test kimyasalları durulama kolaylaştırmak için. Son doku dozlanarak kadar, steril kaput dozajlanarak dokuların plakaları tutun. </li><li> Sıvı kimyasallar test etmek için doku tepesinde, doğrudan çözüm 30 mcL dağıtmak ve naylon mesh dokuların yüzey üzerine yerleştirin. Gerekirse, cam Pasteur pipeti başkanlığındaki ampul kullanarak mesh yavaşça yerleştirin. Doku yüzey üzerine basmayın. </li><li> Test yarı katı için, doğrudan doku tepesinde 30 mcL dağıtmak için olumlu bir deplasman pipet kullanın. Pasteur pipeti ile gerekli yayılmasını kimyasal doku yüzeyinin mümkün olduğunca karşılamak için ise </li><li> Katı maddeler için, test maddesi, uygulama kısa bir süre önce, doku yüzeyinin steril DPBS 25 mcL ile nemlendirin. Bu test kimyasal doku yüzeyine temas artıracaktır. Ince öğütülmüş test materyali yaklaşık 25 mg ile 25 mg kalibre keskin uygulama kaşığı (veya başka uygun bir araç) doldurun. Katı test doku yüzeyine kimyasal uygulayın. Gerekirse kaşık, tamamen boşaltmak için Pasteur Pipet başkanlığında bir ampul kullanın. Katı yüzey üzerinde yayılmasını geliştirmek için ekler yavaşça sallayın. </li><li> Mum kıvamında test maddeler için, 8 mm çapında parçası düz &quot;gibi çerez form ve doku, daha önce steril DPBS ile ıslatılmış tepesinde yer deneyin. Test maddesi ve doku arasındaki iletişim artırmak için &quot;çerez&quot;, paslanmaz çelik veya plastik yardımı ile tartın. </li><li> Negatif kontrol ve kontrol dokulara pozitif kontrol olarak% 5 SDS olarak DPBS uygulayın. </li><li> Son doku dozaj sonra 35 için tüm plakaları ± 1 dakika transfer, nemlendirilmiş inkübatör (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH). </li><li> 35 sonra 37 ° ± 1 dakika inkübasyon ° C inkübatör tüm plakaları çıkarın. Plakalar steril kaput içine koyun ve 60 dakika kimyasal maddelere maruz kalma süresi, ilk dozajlanarak doku tamamlanana kadar bekleyin. </li><li> Daha sonra (sigorta şirketlerini olumsuz bir dakikalık zaman aralığı başına eklemek kullanarak yıkama prosedürü başlatmake her ekleme için toplam maruz kalma süresi) 60 dakika olduğunu. </li><li> Dokuların steril DPBS ile durulama için bir yıkama şişesi kullanın. Daha sonra, geri kalan ile devam 15 kez eklemek doku DPBS sürekli kullanarak doldurun ve (Not boş naylon örgü dokular için, doku yüzeyinin 5 kez yıkayın ve örgü, keskin sivri forseps ile dikkatli bir şekilde kaldırmak 10 yıkama). </li><li> 15. 150 ml DPBS tamamen daldırın, insert 3 kez yıkama şişesi kullanarak yıkayın ve test malzemesi kalan kaldırmak için sallamak sonra. </li><li> Son olarak, içeriden bir doku eklemek yıkayın ve bir kez steril DPBS ile dışarıdan. </li><li> Ekleme hafifçe sallayarak ve steril kurutma kağıdı blot doku DPBS herhangi bir aşırı çıkarın. </li><li> Daha önce tahlil orta önceden dolu yeni 6-plaka, lekelenen doku ekler aktarın. (14-18) Tüm bu adımları her ekleme için 1 dakika içinde yapılmalıdır. </li><li> Son doku durulanır sonra, steril bir pamuk ile her doku yüzeyine dikkatlice kurulayın çubukla uçlu. </li><li> Inkübatör dokuların sonraki 24 ± 2 saat inkübe (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH). Not: Her tahlil teknisyen aşağıda açıklandığı gibi, protokolü takip edebilmek için, tek bir test run (set) negatif ve pozitif kontroller de dahil olmak üzere fazla 6 testi maddelerin test olmamalıdır </li></ol> III. Orta tokuş - 2. Gün <ol><li> 24 saat sonra ± 2 saat sonrası inkübasyon, 6-plaka, 0.9 ml medya ile önceden doldurulmuş alt kısmında ekler transfer. Üst sıralarda yer alan medya, ek uç noktaları (sitokinler, kemokinler vb.) Analizi için toplanan olabilir. İkincil sonlanım noktaları Analizi isteğe bağlıdır. </li><li> Post-inkübasyon ile devam edin (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) başka bir 18 ± 3 saat. </li></ol> IV. MTT Canlılık Testi - 3. Gün <ol><li> Etiket iki kimyasal adları veya kodları ile 24 kuyucuğu. Bir plaka MTT ile doku inkübasyon hizmet ve çıkarma adım için. </li><li> MTT konsantre çözülme (5 mg / ml) ve MTT seyreltici ile seyreltilmesi MTT çözüm hazırlayın. MTT çözümün nihai konsantrasyonu 1 mg / ml. </li><li> Pipet 300 mcL 24 plaka her kuyuya MTT çözüm. </li><li> Inkübatör 6 kuyucuğu çıkarın blot kağıt üzerine ekler alt blot ve MTT ile önceden doldurulmuş 24 plaka içine aktarabilirsiniz. </li><li> Inkübatörde 24 plaka koyun (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) ve 3 saat inkübe ± 5 dk. Strictly 3 saat uymak ± 5 dakika inkübasyon süresi farklı MTT okumaları arasındaki sapma önlemek için. </li><li> MTT inkübasyon tamamlandığında, yavaşça tüm kuyulardan MTT orta aspire bir emme pompası kullanın. </li><li> Yedek DPBS kuyulardan ve tekrar aspire. Bu durulama iki kez daha tekrarlayın ve dokuların son aspirasyon sonra kuru olduğundan emin olun. </li><li> Yıkar, yeni bir 24-plaka ekler transferinden sonra. Her ekleme yavaşça içine 2 ml ekstrenin solüsyonu (Isopropanol) pipetleme ekler bırakın. Düzeyi, böylece tamamen dokuların daldırarak ucun üst kenarları üzerinde artacak. </li><li> Ekstrenin buharlaşma etkisizleştirmek için 24-iyi plaka Seal (örneğin Parafilm veya sızdırmazlık çanta kullanarak). Bir tabak çalkalayıcı (~ 120 rpm) hafif sallayarak ile oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca dokular MTT ayıklayın. Gecelik çıkarma sallayarak olmadan da kullanılabilir. </li><li> Ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra, delmek bir enjeksiyon iğnesi veya ampul Pasteur pipeti boncuklu ve özü eklemek alındığı kuyuya çalışmasına izin ekler. </li><li> Delinirse eklemek atın ve homojen kadar iyi ve aşağı üç kez çözüm pipetle. </li><li> Her doku için, 96 sıra düz bir alt mikrotiter plate mor formazan çözümün iki 200 mcL alikotları transfer. Bu video protokolü ile birlikte Çizelgede verilen sabit plaka tasarımı göre çoğaltır aktarın. Boşlukları, izopropanol kullanın. </li><li> Bir referans filtre olmadan bir dalga boyu 570 nm (540-580) kullanarak 96-plaka spektrofotometre MTT özler optik yoğunluk (OD) okuyun. </li><li> Otomatik hesaplama sonuçları (Şekil 1) Çizelgede sonuçları girin. </li><li> MTT testi ile belirlenen yüzde doku canlılığı negatif kontrol göre &lt;% 50 ise bir test kimyasal tahriş edici (R38 veya GHS kategori 2) olarak etiketlenir. Not: MTT toksik, böylece kullanırken koruyucu eldiven giymek emin olun. MTT ve onun kadar koruyunEtkin çözüm ışıktan, MTT beri ışığa karşı hassastır. Hazırlandıktan sonra bir kaç saat içinde zamanla düşürür çünkü MTT çözüm kullanın. </li></ol> V. Testi Kalite Denetimleri <ul><li> Epiderm EPI-200-SİT kit Kabul Kriterleri: In vitro RHE modelleri (8) doğrulama işlemi sırasında değil, zaman içinde tutarlı, yüksek kaliteli veri sağlamalıdır. Uzun vadeli tahlil tekrarlanabilirlik ve performans sağlamak için önerilen kurallar &quot;performans için her bir lot örnekleme doku veya hücrelerin tam karakterizasyonu, ..., ve test performansı tutarlılığı güvence sağlamak için düzenli kontrolleri ve benchmark kimyasalların kullanımı&quot; (9) . Buna ek olarak, aşağıda ana hatlarıyla tahlil kabul kriterleri, Epiderm her üretim yeri (% 1 Triton X-100) ek bir kriter kimyasal karşı üretici tarafından test kalite kontrol. Maruz kalma süresi% 50 (ET-50) Triton X-100 belirlenir doku canlılığı azaltmak için gerekli. Epiderm için, yıllık ortalama ET-50 değerleri 5.9 saat ile 7.5 saat arasında değişmektedir. Çok negatif kontrol dokuları için çok CV (bazal canlılığı değişkenliği), 1996 yılından beri, her yıl için% 7.5 altında ortalama vardır. Amacıyla, her üretim yeri ET50 1996 (; Alt kabul sınırı = 4.8h üst kabul limit = 8.7h yani ET-50 = 6.7 saat) yılında kurulan tarihsel ortalamanın Triton X-100 ET50 2 standart sapma değeri içinde olmalıdır üretici tarafından kullanım için piyasaya sürülecek. </li><li> EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 1: Negatif Kontrol: MTT testi negatif kontrol (NC) dokular (steril DPBS ile tedavi) mutlak OD, nakliye ve depolama sonra prosedürleri ve belirli kullanım koşulları altında test laboratuarında elde edilen doku canlılığının bir göstergesi. NC dokuların ortalama OD 570 ≥ 1.0 ve ≤ 2.5 ise tahlil kabul kriteri karşılamaktadır. </li><li> EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 2: Pozitif Kontrol % 5 SDS (H 2 O) çözeltisi, pozitif kontrol (PC) olarak kullanılan ve test kimyasalları ile eş zamanlı olarak test edilmiştir . PC, her tahlil test edilebilir, ancak birden fazla PC gün test başına gerekli olduğunu Eşzamanlı anlamına gelir. Pozitif kontrol Canlılık tarihsel veriler% 95 güven aralığı içinde olmalıdır. Testin negatif kontrol dokuların% 20% olarak ortalama PC dokuların canlılığını ifade kabul kriteri karşılamaktadır. </li><li> EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 3: Standart sapma (SD) Tahrişi 3 tek dokular üzerinde belirlenen ortalama canlılığı tahmin ve bu nedenle doku değişkenlik kabul edilebilir düşük olmalıdır çoğaltır. Aynı tedavi edilen 3 ayrı% doku canlılığında hesaplanan SD &lt;% 18 çoğaltır eğer tahlil kabul kriteri karşılamaktadır. </li></ul> Temsilcisi Sonuçlar <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Şekil 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Şekil 3" /> </div> Şekil 1 - 6 test makaleler, NC ve PC kontrol edilen sonuçlar Bölüm sonuçlarının hesaplanması için otomatik bir elektronik tablo. NC başvurulan% 50 &#39;nin altında doku canlılığı azalttı Testi kimyasalların tahriş edici olarak sınıflandırılır. Testi, yeteri kadar bu testin sağlamlık artan sınıflandırma cut-off (50% canlılığı) sonuçlar sağlayacak şekilde optimize edilmiştir. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Malzemeler </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Malzeme Listesi" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

Bu video, Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT), kimyasal maddeler, kozmetik ve ilaç hammaddeleri de dahil olmak üzere in vitro cilt tahrişi testi için geliştirilen ve geçerliliği göstermiştir. Bu yöntem yaparken, protokolün sapma değişik sonuçlara neden olabilir, aseptik koşullarda çalışma ve kesin olarak doğrulanmış bir protokolü takip etmek önemlidir. Testinin bazı değişiklikler yapılabilir, ancak, protokol değişiklikleri yazarlar ile doğrudan tartışılan olmalıdır. Bu yöntemin tek sınırlama MTT son nokta ile test maddenin olası bir girişim. MTT son nokta ile doğrudan MTT azaltır renkli bir test maddesi veya bir (ve böylece hücresel mitokondri dehidrogenaz aktivitesi taklit) engel olabilir. Ancak, bu test madde (ya da) dokularda bulunur MTT testi (yani test madde maruz kaldıktan sonra 42 saat) test maddesi, yeterli miktarda anda sadece bir sorun. Bu olası olay, (gerçek) metabolik MTT azaltılması ve katkı renkli bir test materyali veya (yanlış) tarafından sağlanan tahlil Standart Operasyon Prosedürü ayrıntılı olarak açıklanan bir prosedür ile belirlenebilir test malzemesi doğrudan MTT azaltma durumunda Mattek Corp.

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT) geliştirildi<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Ve valide<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Için<em&gt; In vitro</emKimyasallar&gt;, kozmetik ve ilaç maddeler de dahil olmak üzere cilt tahrişi testleri,. Epiderm SİT 3D kullanmaktadır.<em&gt; In vitro</em&gt; Yeniden inşa insan epidermal (RHE) modeli Epiderm. Bu protokolü açıklanan prosedür GHS kategori tahriş edici 2 ve non-tahriş edici arasında ayırım sağlar<sup&gt; (6)</sup&gt;. 4 günlük bir zaman dilimi boyunca oluşan ön-inkübasyon, 60 dakika maruz kalma, 42 saat sonrası inkübasyon ve MTT canlılığı tahlil, test yapılır. Doku alınması ve bir gecede ön-inkübasyon (Gün 0) sonra, dokularda sıvı, yarı katı, katı ya da balmumu olabilir test kimyasallar (Gün 1), topikal maruz kalmaktadır. Üç dokular her test kimyasal yanı sıra, pozitif kontrol (% 5 aq. SDS çözüm) ve negatif kontrol (DPBS) için kullanılır. Kimyasal maddelere maruz kalma, dokular 37 bir kuluçka tutulur 60 dakika, 35 dakika ° C sürer Test maddeler daha sonra doku yüzeyinin geniş bir yıkama prosedürü kaldırılır. Doku ekler, lekelenen ve taze ortama aktarılır. 24 saat inkübasyon süresi (Gün 2) sonra, orta değiştirilir. Orta, sitokinler ya da diğer ilgi uç noktaları daha fazla analiz için kaydedilebilir. Orta döviz sonra, doku ilave bir 18 saat inkübe edilir. Tüm 42H sonrası inkübasyon (3 gün) sonunda, dokuların sarı MTT çözüm içine transfer edilir ve 3 saat inkübe. Özellikle mitokondriyal metabolizma ile oluşan çıkan mor-mavi formazan tuz, izopropanol kullanılan 2 saat çıkarılır. Ayıklanan formazan optik yoğunluk bir spektrofotometre kullanılarak belirlenir. % 50 &#39;nin altında negatif kontrol tedavi dokulara göre doku canlılığı azalmış ise tahriş edici kimyasal olarak sınıflandırılır. Bu prosedür, AB düzenlemelerine paralel olarak kimyasal maddelerin tehlike tanımlama ve etiketleme için in vivo tavşan cilt irritasyon testi dolu yedek olarak kullanılabilir<sup&gt; (7)</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Bu video, Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT) için geçerli göstermek<em&gt; In vitro</emKimyasallar&gt;, kozmetik ve ilaç maddeler de dahil olmak üzere cilt tahrişi testleri,.

Bir In Vitro</emEpiderm> Cilt tahriş Testi (SIT) İnsan Epidermal (RHE) Model yeniden inşa

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

67.4K Görüntüleme.  MatTek Corporation.  日本語 

Video: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Bir Anjiyogenez Çalışma in vitro model (Röportaj)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Biyoloji

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Allojenik Deri Grefti ile Yeniden Yapılandırılan Yanık Yarasının Murine Modeli

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

Bir In Vitro Cilt tahriş Testi (SIT) İnsan Epidermal (RHE) Model yeniden inşa