Name: an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

Yazarlar Modifiye Epiderm SIT (5 Çok merkezli Uluslararası Doğrulama Çalışması katılımı için BfR (Almanya), BASF SE (Almanya), IIVS A.Ş. (ABD), Zet-LSL (Avusturya) ZEBET teşekkür etmek istiyorum .)

I. Doku Klima - Gün 0 <ol><li> Epiderm EPI-200-SİT kiti aldıktan sonra, bütünlüğü için tüm kit bileşenleri (kit ayrıntılı bilgi için özel reaktifler ve ekipman Tablo bakınız) kontrol edin. </li><li> Her üç Epiderm dokular için, bir tahlil orta 0.9 ml steril 6 plaka önceden doldurulmuş hazırlar. </li><li> Epiderm dokular içeren 24 plaka içeren plastik torba steril koşullar altında, açık ve steril bir gazlı bez çıkarın. </li><li> Epiderm doku içeren her eklemek kaldırmak ve 24 boş plaka ekleme yerleştirmek için steril forseps kullanın. Bu adım sırasında, steril filtre kağıdı blot nazik eklemek dış kenarlarına yapışır kalan nakliye agaroz çıkarın. </li><li> Sonraki 5 dakika içinde, dokular görsel olarak kontrol edin. Tamamen sıvı ile kaplıdır kusurlu doku ya da doku kullanmayın. </li><li> Steril pamuk uçlu çubuk yardımıyla, dokuların yüzey dikkatlice kurutun. Doğrudan doku dokunmamaya çalışın - kılcal etkileri doku yüzeyinin nemi çıkarmak için yeterli. </li><li> Doku yüzeyinin kurutulduktan sonra, 6-kuyucuğu 0.9 mL tahlil orta önceden doldurulmuş üst satırındaki üç doku transferi. Ekler altında sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakın. </li><li> 60 kuvöz içine ekler içeren 6-kuyucuğu yerleştirin ± 5 dakika ön-inkübasyon 37 ° ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH (Bağıl Nem). </li><li> 60 ± 5 dk ön kuluçka dönemi sonunda, 6-plaka alt kuyulara üst kuyulardan ekler aktarın. Inkübatör geri tabak koyun (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) bir gece için ön-inkübasyon (18 ± 3 saat). </li><li> Buzdolabında (5 ± 3 ° C). Tahlil orta geri kalanını yerleştirin. Gecelik ön inkübasyon sonrasında, test kimyasalları Epiderm dokulara uygulanabilir. Not: ön inkübasyon prosedürü (dokular Salı Çarşamba günü yerine gelirse gibi) geç doku teslim durumunda kısaltılabilir. </li></ol> II. Kimyasal maruz kalma - 1. Gün <ol><li> Sadece 0.9 ml başına iyi tahlil orta üst sıra dolum testi kimyasal başına bir adet 6-plaka hazırlayın. </li><li> Yaklaşık 5 dakika planlanan kimyasallara maruz kalmadan önce, inkübatör öncesi klimalı dokular içeren 6 kuyucuğu çıkarın. </li><li> Dokuların yüzey değerlendirin ve steril pamuk ipuçlarını kullanarak herhangi bir nem kaldırmak. </li><li> Tüm 6 plaka kapakları test malzeme kodları veya isimleri ile etiketleyin. </li><li> Doz 1 dakikalık aralıklarla test kimyasallar ile dokuların maruz kaldıktan sonra test kimyasalları durulama kolaylaştırmak için. Son doku dozlanarak kadar, steril kaput dozajlanarak dokuların plakaları tutun. </li><li> Sıvı kimyasallar test etmek için doku tepesinde, doğrudan çözüm 30 mcL dağıtmak ve naylon mesh dokuların yüzey üzerine yerleştirin. Gerekirse, cam Pasteur pipeti başkanlığındaki ampul kullanarak mesh yavaşça yerleştirin. Doku yüzey üzerine basmayın. </li><li> Test yarı katı için, doğrudan doku tepesinde 30 mcL dağıtmak için olumlu bir deplasman pipet kullanın. Pasteur pipeti ile gerekli yayılmasını kimyasal doku yüzeyinin mümkün olduğunca karşılamak için ise </li><li> Katı maddeler için, test maddesi, uygulama kısa bir süre önce, doku yüzeyinin steril DPBS 25 mcL ile nemlendirin. Bu test kimyasal doku yüzeyine temas artıracaktır. Ince öğütülmüş test materyali yaklaşık 25 mg ile 25 mg kalibre keskin uygulama kaşığı (veya başka uygun bir araç) doldurun. Katı test doku yüzeyine kimyasal uygulayın. Gerekirse kaşık, tamamen boşaltmak için Pasteur Pipet başkanlığında bir ampul kullanın. Katı yüzey üzerinde yayılmasını geliştirmek için ekler yavaşça sallayın. </li><li> Mum kıvamında test maddeler için, 8 mm çapında parçası düz &quot;gibi çerez form ve doku, daha önce steril DPBS ile ıslatılmış tepesinde yer deneyin. Test maddesi ve doku arasındaki iletişim artırmak için &quot;çerez&quot;, paslanmaz çelik veya plastik yardımı ile tartın. </li><li> Negatif kontrol ve kontrol dokulara pozitif kontrol olarak% 5 SDS olarak DPBS uygulayın. </li><li> Son doku dozaj sonra 35 için tüm plakaları ± 1 dakika transfer, nemlendirilmiş inkübatör (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH). </li><li> 35 sonra 37 ° ± 1 dakika inkübasyon ° C inkübatör tüm plakaları çıkarın. Plakalar steril kaput içine koyun ve 60 dakika kimyasal maddelere maruz kalma süresi, ilk dozajlanarak doku tamamlanana kadar bekleyin. </li><li> Daha sonra (sigorta şirketlerini olumsuz bir dakikalık zaman aralığı başına eklemek kullanarak yıkama prosedürü başlatmake her ekleme için toplam maruz kalma süresi) 60 dakika olduğunu. </li><li> Dokuların steril DPBS ile durulama için bir yıkama şişesi kullanın. Daha sonra, geri kalan ile devam 15 kez eklemek doku DPBS sürekli kullanarak doldurun ve (Not boş naylon örgü dokular için, doku yüzeyinin 5 kez yıkayın ve örgü, keskin sivri forseps ile dikkatli bir şekilde kaldırmak 10 yıkama). </li><li> 15. 150 ml DPBS tamamen daldırın, insert 3 kez yıkama şişesi kullanarak yıkayın ve test malzemesi kalan kaldırmak için sallamak sonra. </li><li> Son olarak, içeriden bir doku eklemek yıkayın ve bir kez steril DPBS ile dışarıdan. </li><li> Ekleme hafifçe sallayarak ve steril kurutma kağıdı blot doku DPBS herhangi bir aşırı çıkarın. </li><li> Daha önce tahlil orta önceden dolu yeni 6-plaka, lekelenen doku ekler aktarın. (14-18) Tüm bu adımları her ekleme için 1 dakika içinde yapılmalıdır. </li><li> Son doku durulanır sonra, steril bir pamuk ile her doku yüzeyine dikkatlice kurulayın çubukla uçlu. </li><li> Inkübatör dokuların sonraki 24 ± 2 saat inkübe (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH). Not: Her tahlil teknisyen aşağıda açıklandığı gibi, protokolü takip edebilmek için, tek bir test run (set) negatif ve pozitif kontroller de dahil olmak üzere fazla 6 testi maddelerin test olmamalıdır </li></ol> III. Orta tokuş - 2. Gün <ol><li> 24 saat sonra ± 2 saat sonrası inkübasyon, 6-plaka, 0.9 ml medya ile önceden doldurulmuş alt kısmında ekler transfer. Üst sıralarda yer alan medya, ek uç noktaları (sitokinler, kemokinler vb.) Analizi için toplanan olabilir. İkincil sonlanım noktaları Analizi isteğe bağlıdır. </li><li> Post-inkübasyon ile devam edin (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) başka bir 18 ± 3 saat. </li></ol> IV. MTT Canlılık Testi - 3. Gün <ol><li> Etiket iki kimyasal adları veya kodları ile 24 kuyucuğu. Bir plaka MTT ile doku inkübasyon hizmet ve çıkarma adım için. </li><li> MTT konsantre çözülme (5 mg / ml) ve MTT seyreltici ile seyreltilmesi MTT çözüm hazırlayın. MTT çözümün nihai konsantrasyonu 1 mg / ml. </li><li> Pipet 300 mcL 24 plaka her kuyuya MTT çözüm. </li><li> Inkübatör 6 kuyucuğu çıkarın blot kağıt üzerine ekler alt blot ve MTT ile önceden doldurulmuş 24 plaka içine aktarabilirsiniz. </li><li> Inkübatörde 24 plaka koyun (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) ve 3 saat inkübe ± 5 dk. Strictly 3 saat uymak ± 5 dakika inkübasyon süresi farklı MTT okumaları arasındaki sapma önlemek için. </li><li> MTT inkübasyon tamamlandığında, yavaşça tüm kuyulardan MTT orta aspire bir emme pompası kullanın. </li><li> Yedek DPBS kuyulardan ve tekrar aspire. Bu durulama iki kez daha tekrarlayın ve dokuların son aspirasyon sonra kuru olduğundan emin olun. </li><li> Yıkar, yeni bir 24-plaka ekler transferinden sonra. Her ekleme yavaşça içine 2 ml ekstrenin solüsyonu (Isopropanol) pipetleme ekler bırakın. Düzeyi, böylece tamamen dokuların daldırarak ucun üst kenarları üzerinde artacak. </li><li> Ekstrenin buharlaşma etkisizleştirmek için 24-iyi plaka Seal (örneğin Parafilm veya sızdırmazlık çanta kullanarak). Bir tabak çalkalayıcı (~ 120 rpm) hafif sallayarak ile oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca dokular MTT ayıklayın. Gecelik çıkarma sallayarak olmadan da kullanılabilir. </li><li> Ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra, delmek bir enjeksiyon iğnesi veya ampul Pasteur pipeti boncuklu ve özü eklemek alındığı kuyuya çalışmasına izin ekler. </li><li> Delinirse eklemek atın ve homojen kadar iyi ve aşağı üç kez çözüm pipetle. </li><li> Her doku için, 96 sıra düz bir alt mikrotiter plate mor formazan çözümün iki 200 mcL alikotları transfer. Bu video protokolü ile birlikte Çizelgede verilen sabit plaka tasarımı göre çoğaltır aktarın. Boşlukları, izopropanol kullanın. </li><li> Bir referans filtre olmadan bir dalga boyu 570 nm (540-580) kullanarak 96-plaka spektrofotometre MTT özler optik yoğunluk (OD) okuyun. </li><li> Otomatik hesaplama sonuçları (Şekil 1) Çizelgede sonuçları girin. </li><li> MTT testi ile belirlenen yüzde doku canlılığı negatif kontrol göre &lt;% 50 ise bir test kimyasal tahriş edici (R38 veya GHS kategori 2) olarak etiketlenir. Not: MTT toksik, böylece kullanırken koruyucu eldiven giymek emin olun. MTT ve onun kadar koruyunEtkin çözüm ışıktan, MTT beri ışığa karşı hassastır. Hazırlandıktan sonra bir kaç saat içinde zamanla düşürür çünkü MTT çözüm kullanın. </li></ol> V. Testi Kalite Denetimleri <ul><li> Epiderm EPI-200-SİT kit Kabul Kriterleri: In vitro RHE modelleri (8) doğrulama işlemi sırasında değil, zaman içinde tutarlı, yüksek kaliteli veri sağlamalıdır. Uzun vadeli tahlil tekrarlanabilirlik ve performans sağlamak için önerilen kurallar &quot;performans için her bir lot örnekleme doku veya hücrelerin tam karakterizasyonu, ..., ve test performansı tutarlılığı güvence sağlamak için düzenli kontrolleri ve benchmark kimyasalların kullanımı&quot; (9) . Buna ek olarak, aşağıda ana hatlarıyla tahlil kabul kriterleri, Epiderm her üretim yeri (% 1 Triton X-100) ek bir kriter kimyasal karşı üretici tarafından test kalite kontrol. Maruz kalma süresi% 50 (ET-50) Triton X-100 belirlenir doku canlılığı azaltmak için gerekli. Epiderm için, yıllık ortalama ET-50 değerleri 5.9 saat ile 7.5 saat arasında değişmektedir. Çok negatif kontrol dokuları için çok CV (bazal canlılığı değişkenliği), 1996 yılından beri, her yıl için% 7.5 altında ortalama vardır. Amacıyla, her üretim yeri ET50 1996 (; Alt kabul sınırı = 4.8h üst kabul limit = 8.7h yani ET-50 = 6.7 saat) yılında kurulan tarihsel ortalamanın Triton X-100 ET50 2 standart sapma değeri içinde olmalıdır üretici tarafından kullanım için piyasaya sürülecek. </li><li> EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 1: Negatif Kontrol: MTT testi negatif kontrol (NC) dokular (steril DPBS ile tedavi) mutlak OD, nakliye ve depolama sonra prosedürleri ve belirli kullanım koşulları altında test laboratuarında elde edilen doku canlılığının bir göstergesi. NC dokuların ortalama OD 570 ≥ 1.0 ve ≤ 2.5 ise tahlil kabul kriteri karşılamaktadır. </li><li> EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 2: Pozitif Kontrol % 5 SDS (H 2 O) çözeltisi, pozitif kontrol (PC) olarak kullanılan ve test kimyasalları ile eş zamanlı olarak test edilmiştir . PC, her tahlil test edilebilir, ancak birden fazla PC gün test başına gerekli olduğunu Eşzamanlı anlamına gelir. Pozitif kontrol Canlılık tarihsel veriler% 95 güven aralığı içinde olmalıdır. Testin negatif kontrol dokuların% 20% olarak ortalama PC dokuların canlılığını ifade kabul kriteri karşılamaktadır. </li><li> EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 3: Standart sapma (SD) Tahrişi 3 tek dokular üzerinde belirlenen ortalama canlılığı tahmin ve bu nedenle doku değişkenlik kabul edilebilir düşük olmalıdır çoğaltır. Aynı tedavi edilen 3 ayrı% doku canlılığında hesaplanan SD &lt;% 18 çoğaltır eğer tahlil kabul kriteri karşılamaktadır. </li></ul> Temsilcisi Sonuçlar <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Şekil 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Şekil 3" /> </div> Şekil 1 - 6 test makaleler, NC ve PC kontrol edilen sonuçlar Bölüm sonuçlarının hesaplanması için otomatik bir elektronik tablo. NC başvurulan% 50 &#39;nin altında doku canlılığı azalttı Testi kimyasalların tahriş edici olarak sınıflandırılır. Testi, yeteri kadar bu testin sağlamlık artan sınıflandırma cut-off (50% canlılığı) sonuçlar sağlayacak şekilde optimize edilmiştir. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Malzemeler </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Malzeme Listesi" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

Bu video, Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT), kimyasal maddeler, kozmetik ve ilaç hammaddeleri de dahil olmak üzere in vitro cilt tahrişi testi için geliştirilen ve geçerliliği göstermiştir. Bu yöntem yaparken, protokolün sapma değişik sonuçlara neden olabilir, aseptik koşullarda çalışma ve kesin olarak doğrulanmış bir protokolü takip etmek önemlidir. Testinin bazı değişiklikler yapılabilir, ancak, protokol değişiklikleri yazarlar ile doğrudan tartışılan olmalıdır. Bu yöntemin tek sınırlama MTT son nokta ile test maddenin olası bir girişim. MTT son nokta ile doğrudan MTT azaltır renkli bir test maddesi veya bir (ve böylece hücresel mitokondri dehidrogenaz aktivitesi taklit) engel olabilir. Ancak, bu test madde (ya da) dokularda bulunur MTT testi (yani test madde maruz kaldıktan sonra 42 saat) test maddesi, yeterli miktarda anda sadece bir sorun. Bu olası olay, (gerçek) metabolik MTT azaltılması ve katkı renkli bir test materyali veya (yanlış) tarafından sağlanan tahlil Standart Operasyon Prosedürü ayrıntılı olarak açıklanan bir prosedür ile belirlenebilir test malzemesi doğrudan MTT azaltma durumunda Mattek Corp.

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT) geliştirildi<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; Ve valide<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Için<em&gt; In vitro</emKimyasallar&gt;, kozmetik ve ilaç maddeler de dahil olmak üzere cilt tahrişi testleri,. Epiderm SİT 3D kullanmaktadır.<em&gt; In vitro</em&gt; Yeniden inşa insan epidermal (RHE) modeli Epiderm. Bu protokolü açıklanan prosedür GHS kategori tahriş edici 2 ve non-tahriş edici arasında ayırım sağlar<sup&gt; (6)</sup&gt;. 4 günlük bir zaman dilimi boyunca oluşan ön-inkübasyon, 60 dakika maruz kalma, 42 saat sonrası inkübasyon ve MTT canlılığı tahlil, test yapılır. Doku alınması ve bir gecede ön-inkübasyon (Gün 0) sonra, dokularda sıvı, yarı katı, katı ya da balmumu olabilir test kimyasallar (Gün 1), topikal maruz kalmaktadır. Üç dokular her test kimyasal yanı sıra, pozitif kontrol (% 5 aq. SDS çözüm) ve negatif kontrol (DPBS) için kullanılır. Kimyasal maddelere maruz kalma, dokular 37 bir kuluçka tutulur 60 dakika, 35 dakika ° C sürer Test maddeler daha sonra doku yüzeyinin geniş bir yıkama prosedürü kaldırılır. Doku ekler, lekelenen ve taze ortama aktarılır. 24 saat inkübasyon süresi (Gün 2) sonra, orta değiştirilir. Orta, sitokinler ya da diğer ilgi uç noktaları daha fazla analiz için kaydedilebilir. Orta döviz sonra, doku ilave bir 18 saat inkübe edilir. Tüm 42H sonrası inkübasyon (3 gün) sonunda, dokuların sarı MTT çözüm içine transfer edilir ve 3 saat inkübe. Özellikle mitokondriyal metabolizma ile oluşan çıkan mor-mavi formazan tuz, izopropanol kullanılan 2 saat çıkarılır. Ayıklanan formazan optik yoğunluk bir spektrofotometre kullanılarak belirlenir. % 50 &#39;nin altında negatif kontrol tedavi dokulara göre doku canlılığı azalmış ise tahriş edici kimyasal olarak sınıflandırılır. Bu prosedür, AB düzenlemelerine paralel olarak kimyasal maddelerin tehlike tanımlama ve etiketleme için in vivo tavşan cilt irritasyon testi dolu yedek olarak kullanılabilir<sup&gt; (7)</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

Bu video, Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT) için geçerli göstermek<em&gt; In vitro</emKimyasallar&gt;, kozmetik ve ilaç maddeler de dahil olmak üzere cilt tahrişi testleri,.

Bir In Vitro</emEpiderm> Cilt tahriş Testi (SIT) İnsan Epidermal (RHE) Model yeniden inşa

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

67.6K Görüntüleme.  MatTek Corporation.  日本語 

Video: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Biyomühendislik

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Cilt Onarımını Doğru Değerlendirmek için İnsan Ex vivo Yara Modeli ve Tam Montajlı Boyama Yaklaşımı

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Gelişim Biyolojisi

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Esnek Araştırma Uygulaması için Verimli 3D Cilt Modelleri

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Uygun Maliyetli 3D Hücresel Modellerle Cilt Modeli Çeşitliliğini Artırma

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Çok Sayıda Uygulama için Cilt Modelleri Oluşturma - İki Boyutlu (2D) Monokültürden Üç Boyutlu (3D) Çoklu Kültüre

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Bir In Vitro Cilt tahriş Testi (SIT) İnsan Epidermal (RHE) Model yeniden inşa

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Üç Boyutlu İnsan Cilt Model Yeniden İnşa: Aracı Normal Cilt ve Melanom İlerleme Eğitim

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt

Cilt Onarımını Doğru Değerlendirmek için İnsan Ex vivo Yara Modeli ve Tam Montajlı Boyama Yaklaşımı

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

Kendi Kendine Monte Edilmiş Vaskülerleştirilmiş İnsan Derisi Eşdeğerlerinin Üretimi

Mikromakine Mikroakışkan Platformda Basitleştirilmiş Üç Boyutlu Çip Üzerinde Cilt Modeli Üretimi

Çok Sayıda Uygulama için Cilt Modelleri Oluşturma - İki Boyutlu (2D) Monokültürden Üç Boyutlu (3D) Çoklu Kültüre

Çok Sayıda Uygulama için Cilt Modelleri Oluşturma - İki Boyutlu (2D) Monokültürden Üç Boyutlu (3D) Çoklu Kültüre