Japon bıldırcın ex ovo kültürünün nasıl hazırlanacağını ve kanser veya mikrobiyal enfeksiyonların fotodinamik teşhisi ve tedavisi için kısaca koryoallantoik membran veya TAT'ın nasıl kullanılacağını göstereceğiz. Bu yöntemin avantajları hızlı gelişimsel büyüme, küçük boyut, dokuya iyi erişim ve kolay kullanımdır. Ayrıca, hayvan araştırması yapmak için 3R kuralının ilkelerine saygı duyar.
Mesane, akciğerler veya plasenta gibi mukoza zarlarına yapısal benzerliği nedeniyle, potansiyel ilaçların in vivo testi, toksisite testi veya transplantasyon çalışmaları için uygundur. Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan doktora öğrencileri olan Barbora Kundekova ve Majlinda Meta olacak. Başlamak için, döllenmiş bıldırcın yumurtası kullanın, taze veya inkübasyonun başlamasından en fazla 4 ila 5 gün önce 10 ila 15 santigrat derecede saklanır.
Sadece temiz ve hasarsız yumurtalar kullanın, daha sonra yumurtaları% 50 ila% 60 nem ve 37.5 santigrat derecede zorla çekilen bir inkübatörde, yumurta rotasyonları kapalıyken yatay olarak yerleştirilmiş yaklaşık 54 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Yumurtayı döndürmeden yumurta yüzeyini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra, eldiven giyerken steril bir laminer akış kabininde, küçük steril cerrahi makas kullanarak yumurta kabuğunu açın ve içeriği 6 delikli bir kültür plakasına aktarın.
Her yumurtadan sonra, makasları% 70 etanol ile dezenfekte edin. 6 delikli plakadaki boşluklara yaklaşık 5 mililitre steril su ekleyin, çünkü CAM'ın kurumasını önlemek için nem gereklidir. Daha sonra, yanlış uçlanmış embriyoları veya döllenmemiş yumurtaları bir vakum aspiratörü ile aspire edin, daha sonra% 80 ila% 90 nemde 37 santigrat derece sıcaklığı korurken embriyoları daha fazla deneye kadar bir inkübatöre yerleştirin.
TAT yeterince geliştiğinde, genellikle embriyonik 7. günden itibaren, büyük kan damarlarından kaçınırken, küçük kılcal damarlar boyunca CAM yüzeyine sterilize edilmiş bir silikon halka yerleştirin. Steril koşullar altında, silikon halkaya uygun miktarda hiperisin çözeltisi 30 mikrolitre uygulayın ve embriyoları% 80 ila% 90 nemde 37 santigrat derecede bir inkübatörde tutun. Fotodinamik tanı koymak için, mor uyarım ışığı kullanarak TAT aydınlatın ve hiperisin uygulamasından sonra farklı zaman aralıklarında hiperisin ve CAM doku ve tümör hücrelerinin floresansını dijital kamera ile kaydedin.
Araştırma TAT'ın beyaz ışıkta bir görüntüsünü gerektiriyorsa, ışık hiperisinin fotoaktivasyonunu tetiklediğinden, CAM'ı hiperisin uygulamasından önce ve doku fiksasyonundan kısa bir süre önce deneyin sonunda kaydedin. Hiperisin uygulamasından sonra fotodinamik tedaviyi gerçekleştirmek için, lazer ışınının silikon halka içindeki tüm alanı kaplaması için CAM'i optik fiberin altına yerleştirin. İn vivo ışınlama gerçekleştirdikten sonra, bu özel durumda, santimetre kare başına 285 miliwatt'lık bir akıcılık hızında 405 nanometrelik bir lazer ışığı ile, fotodinamik işlemden önce ve sonra beyaz ışık ve / veya floresan ışık kullanarak CAM'ı kaydedin.
CAM dokusunu PBS'de% 4 paraformaldehit içeren bir yetiştirme plakasına en az 2 saat ve maksimum bir gece boyunca sabitleyin, ardından paraformaldehiti çıkarın ve CAM'den silikon halka içindeki dokunun bir kısmını dikkatlice kesin. Bütün bu adımlar bir duman davlumbazında yapılmalıdır. CAM dokusundan kesilen kısmı 10 dakika suda yıkayın ve daha sonra CAM dokusunu 3 dakika boyunca% 70 etanol, 2 dakika boyunca eozin çözeltisi, 5 dakika boyunca trosin% 96 etanol, 5 dakika boyunca% 100 etanol ve yeni bir Petri kabında 10 dakika boyunca iki kez ksilen içinde yerleştirerek artan alkol serisinde dehidratasyon yapın.
Daha sonra, numuneleri bir spatula veya ince bir fırça kullanarak Petri kaplarındaki çözünmüş parafine mümkün olduğunca çabuk aktarın. 24 saat sonra, dokuyu histolojik kalıba yerleştirin, bir parafin gömme ortamı ile doldurun ve buzdolabında katılaşmasına izin verin, ardından katılaşmış CAM'i gömme ortamından kesin, tepsiye 90 derece çevirin, gömme ortamıyla tekrar doldurun ve katılaşmasına izin verin. PDT'ye bağlı hasarı belirlemek için histopatolojik analiz için bir mikrotom üzerinde 5 ila 10 mikrometrelik bölümler hazırlayın.
Dondurulmuş CAM bölümlerini histolojiye hazırlamak için, cam kızağa doğal veya% 4 paraformaldehit sabit CAM'i dikkatlice monte edin, gömme kalıbını OCT ile ikiye kadar doldurun ve sıvı azot veya kuru buz ve etanol karışımında dondurun. Dondurulduktan sonra, CAM'ı dikkatlice eğin ve cam kaydırağından donmuş OCT ortamının üstüne kaydırın. Tekrar kalıba yerleştirin, OCT ortamı ile örtün ve daha önce açıklandığı gibi dondurun.
CAM vaskülatürünün analizi için tüm CAM örneklerine ihtiyaç vardır. Laminer akış kabininde,% 4'lük bir paraform aldehit ve% 2 glutaraldehit önceden ısıtılmış bir fiksasyon çözeltisi ile taşma CAM, daha sonra 48 saat sonra fiksasyon çözeltisini çıkarın. Daha sonra, CAM'i mikro makas ve ince bir fırça ile embriyodan dikkatlice ayırın ve PBS'de yıkayın, ardından yıkanmış CAM'i bir cam slayta monte edin ve yavaşça kurumasını bekleyin.
Daha sonra, homojen beyaz ışık kaynağı olarak bir transilluminatorda dijital kamera kullanarak slaytın fotoğrafını çekin. Tümörün TAT yüzeyindeki yeri, hiperisin ilavesi üzerine beyaz ışık ve floresan ışık altında görselleştirildi. Histolojik analiz, ödem ve membran kalınlaşması eşliğinde sağlıklı dokuları istila eden anormal skuamöz hücrelerin konsantrik yapılarını gösterdi.
PDT ile tedaviden sonra, halka içindeki ve çevresindeki damar yoğunluğunda belirgin bir fark gözlendi. Fotosensitizörün varlığı olmayan lazer radyasyonu, herhangi bir tedavi olmaksızın kontrolle karşılaştırılabilir herhangi bir hasara neden olmadı. Hiperisin ile 3 saatlik inkübasyondan sonra, lazer ışınlaması, vaskülatüre büyük hasar veren agrega hiperisinin monomerizasyonunun neden olduğu floresan ile sonuçlandı.
Histolojik analiz, tedavi edilmemiş kontrol TAT'ının nispeten eşit kalınlığa sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, PDT tedavisi TAT'ın daha ince ve daha kırılgan hale gelmesine neden olmuştur. Bıldırcın ex ovo CAM testinin nasıl hazırlanacağını ve nasıl kullanılacağını gösterdik.
Yönergeleri korurken, bu metodolojinin ustalaşması kolaydır ve hızlı sonuçlar verebilir.
