Protokolümüz, makroskopik nesnelerde, özellikle canlı hayvan dokusunda ve tüm hayvanlarda, özel problar ve algılama malzemeleri aracılığıyla fosforesans ömrünün ve oksijen konsantrasyonunun ayrıntılı 2D haritalanmasını sağlar. Bu bilgi birçok araştırma alanı için önemlidir. Protokolümüz, TCSPC modunda çalışan entegre ve kompakt bir görüntüleme modülü kullanır ve yaşam dokusu gibi karmaşık biyolojik numunelerde kullanım ömrünün ve oksijen dağılımının kolay ve doğru bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
Kriket adaptörünü alın ve farklı yönlerden inceleyin. Kriket'e yerleştirilmiş Photonis PP0360EF yoğunlaştırıcısını göstermek için ön taraftaki C-mount adaptörünü çıkarın ve ardından C-mount adaptörünü geri takın. Cricket'in ön taraf C-mount adaptörünü çıkarın ve 650 artı/eksi 50 nanometre emisyon filtresini takın.
C montajını geri koyarak düzeltin. Ardından, TPX üç kameralı kamera modülünü halka adaptörleri aracılığıyla Kriket modülünün arka tarafına bağlayın. Lensi, C-mount adaptörü aracılığıyla Kriket modülünün ön tarafına bağlayın.
LED'i bir güç kaynağına ve bir darbe jeneratörüne bağlayın. Şimdi, 390 nanometre süper parlak LED'i kara kutunun içindeki bir breadboard'a bağlı bir direğe monte edin. LED'i açın ve görüntülenen numunenin etkili ve homojen bir şekilde uyarılmasını sağlamak için odaklayın.
Kamera tertibatını, örneklerin görüntüleneceği sahneye doğru aşağı bakacak şekilde optik kara kutunun üzerine monte edin. Fotoğraf makinesini ve LED'i iki darbeli jeneratörlere ve dört kanallı bir osiloskoba bağlayın. Osiloskop ve darbe jeneratörlerindeki ayarları kullanarak, kameraya ve LED'e gönderilen darbeleri senkronize edin.
Yoğunlaştırıcıyı standart bir güç kaynağına bağlamak ve kazancı 2,7 volta ayarlamak için Kriket ünitesindeki özel kabloyu ve soketi kullanın. Örneği kamera lensinin önüne yerleştirin. Ardından, kamerayı ve yoğunlaştırıcı hariç tüm elektrik modüllerini açın.
Odaklama ve numune hizalama gibi operasyonel parametreleri ayarlamak için SOFI yazılımını etkinleştirin. Modüllerde, kare pozlamasını 0,01 saniyeye ayarlayın. Sonsuz kareler'i seçin ve piksel çalışma modunu eşiğin üzerinde zamana ayarlayın.
Ardından, Önizleme'ye gidin ve Medipix / Timepix kareleri penceresini açmak için Etkin modül'ü seçin. Bir sonraki adımda, kayda başladıktan sonra, renk ölçeğini ayarlayın ve görüntüyü istediğiniz yöne döndürün. Bundan sonra, odadaki ışıkları kapatın ve yoğunlaştırıcıyı açın.
İyi kontrast ve parlaklığa sahip örneklerin net görüntülerini oluşturmak için lensin ve Kriket adaptörünün odaklama özellikleriyle kamera optiklerini örnek sahne alanına odaklayın. Netleme tamamlandıktan sonra SOFI yazılımını kapatın. Ardından, terminale gidin, ham verileri ikili biçimde almak ve terminali kapatmak için özel tasarım yazılımının komutlarını yürütün.
Alınan verileri işlemek için yeni bir terminal açın. Veri dosyasını yükleyin ve veri düşürücüyü çalıştırın. İşlem sonrası verileri, verileri bir ICS görüntü dosyasına yazacak C dilinde yazılmış özel bir programla analiz edin.
Daha sonra, serbestçe kullanılabilen Time Resolved Imaging yazılımını kullanarak ICS görüntü dosyalarını açın ve fosforesans bozunumlarına uymak için iki üstel işlev kullanın. Son olarak, Fitted'i açın. ICS görüntü dosyaları, mevcut görüntü analiz yazılımına sahiptir.
Arama tablolarını kullanarak fosforesans ömrü görüntüleri oluşturun ve bunları sahte renk ölçeğinde kodlayın. Tüm görüntünün veya ilgilenilen bölgelerin ortalama yaşam boyu değerlerini hesaplamak için Ölçüm işlevini kullanın. Fosforesans yoğunluğu ve fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu görüntülerinde platin oktaetilporfirin boya sensörünün oksijenli ve oksijensiz haldeki noktaları gösterilmiştir.
Doğru emisyon filtresinin Kriket'in içine monte edildiğinden ve doğru LED'in, kablo bağlantılarının ve darbe ayarlarının kullanıldığından emin olun. Şu anda, bu protokol hayvan modelleriyle sınırlıdır, ancak potansiyel olarak kanser, felç ve iltihaplanma gibi doku hipoksisi ile ilişkili patolojik durumları teşhis etmek ve tedavi etmek için uygulanabilir.
