Biz mitokondriyal morfolojileri puanlama için hücre yükleme protokolü ve Marcus de Goffau ve Guille Zampar ilk sürümü yazmak için Laura Schippers teşekkür etmek istiyorum.

1. Bir Silikon Gofret Kalıp üretimi ve hazırlanması Mikroakışkan cips yumuşak litografi tarafından üretilen bir silikon yonga kalıp oluşturulur. Bu gofret mikroakışkan yongaları üretmek için birçok kez tekrar edilebilir. Bu ilgili bir gofret üretimi Mikroakiskan 6 uzmanlaşmış bir grup tarafından gerçekleştirildiğini tavsiye edilir. Gofret negatif fotorezist iki farklı katmanları, SU-8 7 kullanarak iki aşamalı bir fotolitografi işlemi yapılır. Kanalların üst katman (yüksekliği 10 mikron SU-8 2010) ile yapılır, oysa; alt tabaka, hücre bindirme alanı (yüksekliği 3-4 mikron SU-8 Aralık 2002) oluşturmak için kullanılır. Gofret üretim işleminin bir gösterim Huang ve ark 8&#39;de bulunabilir. Mikroakışkan cips çizimler ilgili bir gofret edinme hakkında yazarların yanı sıra tavsiye elde edilebilir. <ol><li> Gofret elde edildikten sonra, Sert-Tag int tek parça kesmekBir neşter ve giriş kanalları ve MicroPad dizi (Şekil 2A) arasındaki kanal yapısı üstüne biraz gofret dikkatle koyun ile 3 mm 0,5 mm kadar o ince şeritler. Bu, yalnızca hücre yükleme esnasında kullanılamaz her bir çip, büyük bir ek kanal oluşmasına neden olabilir, fakat mikroakışkan cihazın düzgün çalışması için de önem taşımaktadır. </li><li> Alüminyum folyo bir çift katmanlı ile cam Petri kabı Kapak ve Petri kabındaki gofret koydu. Alüminyum folyo gofret ve Petri kabı arasında çalışmasını PDMS önleyecektir. PDMS gofret ve cam Petri kabı arasında sürünme eğer, gofret Petri kabındaki sürekli sabit olacak. Gofret hala kullanılabilir olmasına rağmen sonları ve PDMS sonra kesmek gerekir, bu cam Petri kabı değiştirmek mümkün olmayacaktır. </li></ol> 2. Mikroakışkan Chips üretimi <ol><li> Boş bir plastik yerleştirindenge ve dara dengesine fincan. Plastik bardak (12 cm çapında cam petri için) içine 40 gr PDMS temel dökün. 4 ml 1:10 yani aw / w oranında bir pipet ile PDMS sertleştirici ekleyin. </li><li> Birkaç dakika boyunca iyice PDMS ve sertleştirici karıştırın. Bu sertleştirme ajanı pipetle için kullanılan tek kullanımlık bir plastik pipet ile yapılabilir. Bu karışım, iyi gofret üzerine dökülmeden önce karıştırılır önemlidir. Kötü karıştırma polimerize değil PDMS bir parçası neden olur. </li><li> Cam Petri kabındaki gofret üstüne PDMS dökün. </li><li> Sertleştirme maddesi ile PDMS karıştırma PDMS karışımı içinde kabarcık oluşumuna yol açacaktır. Bu kabarcıklar PDMS polimerize önce kaldırılması gerekir. PDMS bir vakum pompasına bağlı bir desikatör içinde petri yerleştirerek gofret üstüne dökülerek sonra gazı alınmış olabilir. Bu kurulum ile, karışım tüm kabarcıklarını çıkarmak için yaklaşık 30 dakika sürer. </li><li> Inci polimerizeBir saat boyunca 65 ° C de 1 saat karıştırıldı ve daha sonra 120 ° C&#39;de sıcak bir levha üstünde gofret ile Petri kabı yerleştirerek e PDMS. </li><li> Cam Petri kabı gofret ve polimerize PDMS ile birlikte alüminyum folyo çıkarın. Alüminyum folyo ve gofret arkasından polimerize PDMS ince kalan tabaka soyun. Gofret üstüne PDMS katmanı sonra dikkatlice yukarı kaldırarak gofret ayrılabilir. </li><li> Bankta ters (yukarı bakacak şekilde kanalları) PDMS katmanı yerleştirin ve bir neşter ile dikkatle PDMS baskılı tek bir yonga tasarımları kesip. Daha sonra cam kapak için çip eki geliştirmek için kanal kenarlarında PDMS yaklaşık 3 mm korumak için deneyin. </li><li> Düz bir şekilde PDMS aracılığıyla 20 Ölçer Luer saplama tüm yol iterek giriş, çıkış ve yan kanal (Şekil 2A) uçlarında PDMS içinde delikler. </li></ol> Emin olun PDMS çipdelik delme ise hala bankta ters yatıyor. Bu kanalın tıkanmasına neden olabilir kanal içine yapışmasını PDMS engeller. <ol start="9"><li> Her delik delme sonra, tekrar saplama çekerek önce cımbız ile Luer saplama içinde PDMS sütun çıkarın. PDMS sütun aksi geride kalmak ve sadece delikli delik engelleyebilir. </li><li> Üzerinde viski bant yerleştirerek ve hemen tekrar bant kaldırarak toz parçacıkları ve artık PDMS gelen çip yüzeylerini temizleyin. Aynı çip takılacak için cam kapak temizleyin. </li><li> Tezgah üstü UV-Ozon Cleaner UV lamba altında temizlenir çip ve cam kapak yerleştirin. Birbirine bağlanmış gereken iki lamba bakmalıdır. </li><li> PDMS ortaya çıkarmak ve 6-8 dakika UV ışık cam kapak ve doğrudan daha sonra birbirlerinin üstüne yüzeyler yerleştirerek kapak camına çip koymak. </li><li> Yavaşça çip kenarından dokununcam kapak için PDMS eki teşvik etmek ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için. Bu micropads de cam kapak bağlı olsun neden olabilir gibi kanal yapısı üstüne dokunmayın. </li><li> 60 dakika için 100 ° C sıcak bir plaka üzerinde yeni yapılan mikroakışkan kurulum yerleştirin. Biraz PDMS çip kenarları kaldırmak için deneyerek kapağı cam ve PDMS çip arasındaki bağ gücünü test edin. PDMS blok cam yüzeyinden kaldırılması mümkün olmayan zaman, bir bağın başarılı olduğu ve çip kullanıma hazır hale gelir. </li></ol> 3. Hücre Yükleme için Chip hazırlanması Bir mikroakışkan cihazın arızası potansiyel mikroskop içine orta kaçağı neden olabilir. Bunu önlemek için, bir metal tutucu ve / kullanabilir veya PDMS oje veya epoksi yapıştırıcı ile cam karşılayan çipin iki mühür tavsiye niteliğindedir. Bu PDMS yonga, cam için yeterince bağlı değildir durumunda orta sızmasını önler. Aynı zamanda, borununbağlantı orta kaçağı önlemek için benzer bir şekilde ekleme noktaları etrafında güvence altına alınabilir. Kaçak durumunda şırınga pompası kapanır bir ev yapımı su sensörü ekstra bir güvenlik önlemi olarak kullanılabilir. Özellikle mikroakışkan çip için tasarlanmış metal sahibinin Çizimler yazarlar elde edilebilir. <ol><li> Çipin cam ve su geçirmez bir mühür oluşturmak için sahibinin metal parçalar arasında silikon jel ile, metal tutucuya mikroakışkan çip yerleştirin. Cam kırmak için değil, yavaşça fındık vida. </li><li> Ince tüpler (yaklaşık 5-15 cm uzunluğunda) yan kanal ve çip çıkış kanalına bağlayın. Cımbız kullanımı daha kolay deliklere boru eklemek için yapar. </li><li> Kültür ortamı ile 50 ml Luer-Lok şırınga doldurun, şırınga hava çıkarın ve bir şırınga filtresi, 20 Ölçer Luer saplama, kısa kalın boru (yaklaşık 2 cm uzunluğunda) ve ince bir tüp sıralı bağlayın. Emin olun ince küvete şırınga pompası ve mikroskop sahne arasındaki mesafe span yeterince uzun. </li><li> Hızlı ileri ince bir tüp kadar pompa tamamen ortam ile doldurulur, şırınga pompası şırınga yerleştirin. </li><li> Çipin giriş kanalının içine şırınga bağlı olan ince bir tüp itin ve 10 ul / dak (Şekil 2B) olan çip yoluyla orta akışını sağlar. Çip (bir Petri kabındaki gibi) bırakarak orta toplayın. Orta çünkü Sert Tag büyük yan kanal ve çıkış kanal yapılan arasındaki direnci fark yan kanalı üzerinden tükenecektir. </li><li> Mikroskop aşamasında çip yerleştirin ve yastıkları mikroskop odağı ayarlayın. </li></ol> Petrol Deney zaman boyunca kurumasına değil çünkü immersiyon yağı hedeflerinin kullanımı suya daldırma hedeflerinin bu tercih edilir. Mikroskop bağlı olarak f istinat ile ilgili sorunlar olabilirDeneyin ilk saatlerde ocus. Bu hücreler yükleme ve deney başlamadan önce yerleşmek böylece mikroskop aşamasında bir iki saat için çip bırakmak nedenle tavsiye edilir. 4. Mikroakışkan Chip içine Maya Hücreleri yüklenmesi <ol><li> 20 Ölçer Luer saplama ve kalın bir tüp (yaklaşık 3 cm) bir 5 ml Luer ucu şırınga bağlayın. </li><li> Yonga içine yüklenecek hücre kültürü bir örnek alın. </li></ol> Yükleme için tercih edilen hücre sayısı, ml başına 1-5 x 10 6 hücre arasındadır. Yüksek hücre sayısı ile kültürleri yüklemeden önce seyreltilmesi gerekir. Hücreler ilk olarak suyla yıkandı ve yüklemeden önce benzer bir glukoz yüzdesi içeren minimal ortamda yeniden süspanse edilir ise YPD kültür hücreleri, hücre yükleme verimliliği birçok kat geliştirilebilir zaman. Çip işlemi sırasında, YPD ortamı daha güvenli bir şekilde kullanılabilir. <ol start="3"><li> Th içine hücre süspansiyonu, yaklaşık 1 ml yüke şırınga ve şırınga tüm hava çıkarın. </li><li> 0.5 ul / dak şırınga pompa akış hızı azaltın. Yükleme sırasında şırınga pompası (adım 4.5) tarafından uygulanan düşük ve sürekli akışı yan kanal (Şekil 2C) ile olmayan bağlı hücreleri itecektir. </li><li> Çıkış kanalının tüp hücre süspansiyonu içeren şırınga bağlayın. Yavaşça şırınga pistonu üzerine basarak hücreleri yerleştirin. Gelen ve göz ile micropads altında veya bilgisayar ekran üzerinden yerleşme hücreleri dikkat edin. </li><li> Yeterli hücreleri yastıkları altına yerleşmek kadar piston üzerindeki basıncı koruyun. Optimum yük ped başına 1-3 hücredir. Hücreleri rastgele yastıkları altında yerleşmek gibi, birkaç yastıkları herhangi bir hücre ve diğer yastıkları tamamen hücrelerle doldurulur içermeyen oldukça yaygındır. </li><li> Hücre yükleme ve çıkış kanalının ince borudan buna bağlı olan kalın bir tüp için kullanılan şırınga çıkarın, yan kanal hizadayüksek akış oranları (10 ul / dk) de birkaç dakika için annel hava kabarcıkları ve / veya henüz yonga (Şekil 2B) çıkmak yoktu hücreleri çıkarmak için. Hücreler yan kanal kaldırılmaz, bunlar yan kanalda büyümeye başlar ve daha sonra deney engelleyebilir. </li><li> Geri 0.5 ul / dk için şırınga pompası akışını koymak ve sonuna (Şekil 2B) bir kateter fişi içeren kalın bir tüp (yaklaşık 5 cm uzunluğunda) bağlayarak yan kanal kapatmak. </li><li> 1-5 ul / dakikalık nihai bir akış oranına akışını artırır. Akış hızları orta ve maya suşu bağlı olarak değişebilir. </li><li> Deney hedef için uygun mikroskop ve kamera ayarları ile bir film başlar. Mikroskop sahne hızını yağ takip edebilirsiniz böyle bir düşük hıza ayarlanmış olduğundan emin olun. Replikatif ömrü, görüntü hücreler her 10 dk belirlenmesi için. Halojen tarafından yayılan UV ışığının az miktarda hücreleri korumak içinDIC satın alma sırasında kullanılan lamba, ışığın yolunda ek bir UV filtresi yerleştirilmesi tavsiye edilir. Floresan mikroskobu kullanarak, bu fototoksik etkileri önlemek için (örneğin her 20 dakikada bir) daha az sıklıkla görüntü hücreleri tercih edilir. Deney Deney başlangıcında yüklenen tüm hücreler, normal koşullar altında 5 gün öncesine kadar sürer, ölü zaman tamamlanır. Düzenli olarak deney sırasında görüntülerin odak kontrol edin ve gerekirse ayarlamak için tavsiye edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging.">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background.">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li><li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIR2/3/4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms.">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li><li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan mikroakışkan yöntem sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birlikte maya replikatif ömrü veri basit ve otomatik nesil sağlar araştırma yaşlanma önemli bir yeni bir araçtır. Bu özellikler, klasik diseksiyon yöntemi deneysel olanakları üzerinde büyük gelişmeler, yine dikkate alınması gereken bir yöntem bazı sınırlamalar vardır. Bir MicroPad altında tutulur her hücre (komşu bir hücrenin tomurcuklanan hücre örneğin onda...

Maya tomurcuklanma araştırmalar 1 yaşlanma için önemli bir model organizmadır. Yakın zamanda maya hücreleri yaşlanma replikatif eğitim kadar her tomurcuk elle anne hücre 2,3 kaldırıldı hangi, bir diseksiyon yöntemi gerektiren zahmetli bir süreçti. Bu sorunu çözmek için, son zamanlarda onların bütün ömrü boyunca 4 ayrı anne hücreleri izlemek mümkün yeni bir mikroakışkan kurulum sundu. Bizim mikroakışkan çip, maya hücreleri (bkz. Şekil 1) yumuşak elastomer tabanlı micropads altında sıkışıp kalırlar. Orta bir sürekli akış uzakta yeni kurulan kızı hücreleri yıkar ve taze besin hücreleri sağlar. Tek bir deneyde, 50 kadar anne hücreleri onların bütün replikatif ömrü boyunca tam otomatik bir şekilde izlenebilir. Mikroakışkan çip mükemmel optik özellikleri nedeniyle, aynı anda maya hücre biyolojisi farklı yönleri (örneğin izlemek mümkündür </em&gt; floresan proteinleri) kullanarak. Klasik diseksiyon yöntemi ile karşılaştırıldığında, mikroakışkan kurulum önemli avantajlar sağlamaktadır. Bu bütün yaşlanma deney sırasında, tanımlı ve sürekli ortam sağlar. Hiçbir pahalı özel ekipman gerektirir ve otomatik odaklama ve zaman atlamalı yetenekleri yanı sıra sıcaklık kontrol hücre kültürü için donatılmış herhangi bir mikroskop üzerinde çalıştırılabilir. Mikroakışkan cips üretim ve operasyon birkaç gün içinde öğrenilebilir. Buna ek olarak, hücreleri doğrudan katlanarak büyüyen kültür, anne hücre biyotinilasyon gerektiren başka bir son yayınlanan mikroakışkan yöntemi 5, üzerinde bir avantaj yüklenebilir. Bir Burada anlatılan yöntemi kademeli değişiklikleri ölçmek için kullanılabilecek yüksek çözünürlüklü görüntüleme, ile birlikte hücresel morfolojisi, maya sırasında protein ekspresyonu ve lokalizasyonu benzeri görülmemiş bir şekilde yaşlanma. Için yeteneğitek hücre uzun vadeli izleme de maya hücre döngüsü çalışmaları için eşsiz olanaklar sağlar. Bir Bu yöntem son zamanlarda bu yazının yorum iken yayınlandı protokol 16, gelen biyotinilasyon kaldırmak için optimize edilmiştir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

Biz tek tomurcuklanan maya hücreleri onların bütün ömrü boyunca izlenebilir hangi basit mikroakışkan kurulum, kullanımı göstermektedir. Mikroakışkan çip micropads bir dizi kullanarak anne ve kızı hücreleri arasındaki boyut farkı patlatır. MicroPad ve cam kapak arasındaki mesafe, bir maya hücresi (3-4 mikron) çapına benzer olduğu için yükleme sırasında, hücreler, bu micropads altında tutulur. Yerleştirme işleminden sonra, kültür ortamı sürekli olarak küçük boyutu nedeniyle yastıkları altında korunmaz ortaya çıkan kızı hücreleri üzerinden basması zamanda tüm deney boyunca sabit ve tanımlanmış bir ortam oluşturur sadece çip, ile kızarmış, ancak. Kurulum tek bir deneyde 50 kadar tek tek hücrelerin daha uzun, gerekirse, 5 gün boyunca tam otomatik bir şekilde izlenebilir veya böylece verimli anne hücreleri korur. Buna ek olarak, yonga mükemmel optik özellikleri yüksek izinTüm yaşlanma sürecinde hücrelerin çözünürlüklü görüntüleme.

Bu protokol, hücreleri doğrudan orta-üstel kültür mikroakışkan çip yüklenir. Mikroakışkan çip sıkışıp hücrelerinin yaş dağılımı yükleme öncesi kültürünün benzer olup olmadığını tespit etmek için, hücreleri tomurcuk izleri görselleştirmek için FITC konjuge buğday agglutinin (WGA-FITC) ile boyandı. Şekil 3&#39;te görülebileceği gibi, mikroakışkan çip micropads altında hücrelerin tuzak belirli bir yaştaki hücrelere yanlı değildir. <p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast at JoVE.com

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K Görüntüleme.  University of Groningen. Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Video: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biyomühendislik

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Uygun konumlandırma ve sıçan Hind riske odaklı yüksek kararlılık düşsel ve kemik mikro mimarisi kullanarak Vivo içinde mikro Bilgisayarlı Tomografi için kısıtlama

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

İnsan pankreas nöro-ada ağının yüksek çözünürlükte 3D görüntüleme

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

Yüksek çözünürlüklü Electrohydrodynamic Jet iki modu kullandıktan biçimlenme: damla talep ve yakın alan Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Yüksek çözünürlüklü desenli biyofilm ifade kullanarak pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...