Bu çalışma, bir NSF KARİYER Ödülü (MMH), Barry M. Goldwater bursu (FNB) ve ASBMB Lisans Araştırma Ödülü (CWD) tarafından desteklenmiştir. PBP, ifade için klon lütfen Dr. Martin Webb (MRC, UK) tarafından sağlanmıştır.

Msh2 Msh6 DNA Cilt Kinetiği A. Ölçüm 1. Msh2-Msh6 DNA bağlayıcı kinetik deney için numune hazırlama Durdurulmuş bir akış bir floresans tabanlı kinetik DNA bağlayıcı deney için reaktiflerin hazırlanması, bir flüorometre bir denge deney için benzer. Aslında denge bağlayıcı analizi, kinetik analizi için reaksiyon koşulları optimize etmek için etkileşim için ayrışma sabiti (K D) tahmin etmek için ilk olarak yapılmalıdır. Durduruldu akış deneyleri denge ya da kararlı durum deneyler ile karşılaştırıldığında, biyolojik malzemelerin büyük miktarlarda gerektirir; düşük miligram miktarda protein 11,12 mevcuttur ve benzer miktarda ligandlar hazırlanmış veya satın alınabilir, bu nedenle, bu yaklaşım en uygun. <ol><li> Biz fazla ifade S. cerevisiae E. Msh2-Msh6 coli ve iyon değişim kromatografisi (Şekil 1) 11 protein saflaştırmak miligram miktarlarda. </li><li> Veya 2-Aminopurine fluorofor DNA reaktiflerin kimyasal olarak sentezlenmiş olabilir. Biz 2 Aminopurine ile değiştirilen 37 nükleotid uzunluğunda tek zincirli DNA&#39;lar satın alan ve G bitişik 2-Aminopurine dubleks DNA hazırlamak için iki tamamlayıcı ipliklerini tavlama: T uyumsuzluğu (Şekil 2). DNA denatüre poliakrilamid jel elektroforezi, üretici tarafından veya laboratuarda saflaştırılmış, ikincisi genellikle daha yüksek verim verir. </li><li> : DNA bağlanma kinetiği için, ayrı G hazırlamak T (2-Ap) DNA ve DNA bağlayıcı tampon Msh2-Msh6 protein örneklerinin (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl). Msh2-Msh6 ve DNA konsantrasyonları 01:01 karışım oranı ile tek bir karıştırma deneyde, 0.4 mcM ve 0.06 mcM son konsantrasyonları verimleri, sırasıyla 0.8 mcM ve 0.12 mcM. T (2-Ap) DNA ve 8 mcM etiketsiz G ile başka bir örnek: DNA disosiasyon kinetik için 0.8 mcM Msh2-Msh6 ve 0.12 mcM G içeren bir örnek hazırlamak T DNA ücretsiz Msh2-Msh6 için bir tuzak olarak. Hazırlayın ve buz örnekleri saklamak. Bu reaksiyonlar, protein konsantrasyonu (ampirik belirlenen) sağlam bir floresan sinyali için yeterli Msh2-Msh6-DNA etkileşimi ve DNA konsantrasyonu 10 nM K D üzerindedir. Numune başına 400 ul hacmi yaklaşık 10 kinetik izleri (Tablo 1) elde etmek için yeterli. </li><li> Floresan protein, DNA ve tampon hazırlıkları kirliliklerin ücretsiz yüksek kaliteli kimyasal maddeler kullanmayın. Partiküller ile durdu-akış tıkanmayı önlemek için 0.2 mikron zarından Tüm tamponları Filtresi. </li><li> Fluorofor görünür ışık, hazırlık ve deneme emer düşük ışık koşulları altında yapılmalıdır. </li></ol> 2. Aracı hazırlık Msh2-Msh6 DNA-bağlayıcı kinetiği Durdu akış enstrüman prensibi oldukça basit. Bu karışım bir cihazın içine hızla iki sürücü şırınga çözümler itmek için bir tahrik motoru kullanır, karışık çözüm için bir gözlem, veri toplama (Şekil 3) hücre içine akar. Biz KinTek düşük örnek hacmi gerektirir durdu akışı, çeşitli optik sinyalleri, tek veya reaktanlarının karıştırma sıralı olarak algılanmasını sağlar ve kullanımı çok kolay kullanabilirsiniz. Durduruldu akış araçların yanı sıra diğer birçok üretici vardır. <ol><li> Deneyler için durdu akış alet hazırlamak için, bilgisayar ve denetleyici kapalı olduğundan emin olun. Soğutmak için ortam sıcaklığı ayarlanmış dolaşan su banyosu (C 25 derece) açın. Lambayı ateşleyin. Monokromatör istenen dalgaboyu (2 Aminopurine durumunda 315 nm) ayarlayın. Istenilen yarık genişliği (ampirik olarak düşük photobleaching dengesi yüksek fluorofor uyarma) yarık tekerleği çevirin. Denetleyici ve bilgisayarı açın. Deney sırasında istenilen sıcaklıkta (30 ° C S. cerevisiae Msh2-Msh6 durumunda) reaktanları korur su ceketi doldurmak için dolaşan su banyosu açın. </li><li> Sonra, durdu akış programı çalıştırmak. Fluorofor (350 nm 2-Aminopurine durumunda filtre cut-off) için uygun bir girişim filtresi ile photomultiplier tüp (PMT) Bu durumda seçim, dedektör açın. PMT gerilimi uygulayın. Herhangi bir arka plan elektriksel gürültü düzeltmek için karanlık akımı ölçün. </li><li> Durdu akış sürücü şırınga ve gözlem hücre örnekleri yüklemeden önce yıkanmalıdır. Örnek Yükleme Vana YÜK konumuna ayarlayın. Bir 1ml şırınga deiyonize, filtrelenmiş su ile doldurun, sürücü şırınga altında bulunan yükleme noktası ekleyin ve iki şırınga birkaç kez el arasında su itin. Deneyde kullanılacak her sürücü şırınga için iki kez bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, gözlem hücre yıkamak için su ile sürücü şırınga doldurun. YANGIN konumuna Örnek Vana Anahtarı yükleniyor. Ayarlama Şırınga Sürücü kullanıntahrik motoru ve gözlem hücresinden geçer ve çıkış hattına su itmek için düşük sürücü plaka kontrol komutu. Sonuna kadar sürücü şırınga pistonu itmek için özen gösterin. Sürücü plakasını kaldırın. Vana YÜK pozisyonuna geçin. El reaksiyon tamponu ile şırınga yıkayın ve boş bırakın. Cihaz artık kullanıma hazır. </li></ol> 3. Msh2-Msh6 DNA bağlayıcı deney ve veri analizi <ol><li> Her tüpten 1 ml şırınga taze bir örnek aktarın. Her bir örnek şırınga yükleme noktası takın ve sürücü şırıngaya çözüm itin. Aralıklı olarak birkaç kez duraklar iki şırınga elle arasındaki çözüm basarak tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için özen gösterin. Alt sürücü plakası temas sürücü şırınga kadar. Reaktanları birkaç dakika için ortam sıcaklığına muvazene edelim. </li><li> Veri toplama, Set Time / Channels penceresini açın, veri analizi, veri toplama kanalı (PMT), mod (Floresan) seçin ve izleri sayısı (Shots) tahsil edilecek. 1000 veri noktaları tahsil edilecektir sırasında veri toplama süresi girin. Yavaş fazları tespit etmek için birkaç saniye içinde bilinmeyen bir reaksiyon olarak izlenmelidir. Ampirik denge ya da istikrarlı bir devlet ve ≥ 6 yarısı hayatını kümesi veri toplama süresi ulaşmak için gerekli zaman tahmin ediyoruz. Msh2-Msh6 durumda en uygun zaman çerçevesi 2 saniye G: G: T disosiasyon kinetik T uyumsuzluğu bağlayıcı kinetik ve 60 saniye. Şimdi YANGIN konumuna vana ayarı ve Veri Toplama düğmesini tıklatın. Bu eylem, reaksiyon Msh2-Msh6 ve DNA, giriş gözlem hücre, 2-Aminopurine fluorofor uyarma ve zamanla floresan sinyal toplama karıştırma başlatır. Yüksek kalitede veri elde etmek ve dosyayı kaydetmek için en az 5 kinetik izleri toplayın. </li><li> Deney tamamlandığında, lambayı açmak. Daha önce de açıklandığı gibi, su ile şırıngalar ve gözlem hücre yıkayın. Sonra, ekipman, dolaşımdaki su banyosu hariç geri kalanını kapatmak. Soğutmak için ek bir 15 dakika boyunca su dolaştırılır. </li><li> Matematik işlemleri ve veri uydurma, deney sırasında reaksiyon kinetiği bir anlamda almak için, KinTek yazılımın kendisi ile yapılabilir. Daha fazla analizi de birden fazla kinetik izleri ortalama tasarrufu ve diğer veri analizi / grafik yazılım için ortalama dosya ihracat yapılabilir. </li></ol> 4. Msh2-Msh6 DNA bağlayıcı kinetiği Temsilcisi sonuçlar G Msh2 Msh6 etkileşimler için kinetik veriler: T uyumsuzluğu DNA, tek bir üstel fonksiyon için uygun ve yakın ON 3 hızlı bağlanma oranı sabiti k verim x 10 7 M-1 saniye-1 (Şekil 4A) ve yavaş hızla T uyumsuzluğu ve 60 saniye 13 yakın bir yarılanma ömrü ile çok kararlı bir kompleks oluşturur: Msh2 Msh6 G bağlar ortaya koymaktadır 0.012 ikinci -1 (Şekil 4B), asitlik sabiti k KAPALI . B. Ölçüm Msh2-Msh6 ATPaz Kinetik 1. Msh2 Msh6 ATPaz kinetik deney için numune hazırlama <ol><li> Msh2 Msh6 hazırlayın ve DNA reaktifler etiketsiz DNA kullanılarak, daha önce açıklanan. Buna ek olarak, E. Fosfat Bağlayıcı Protein (PBP) arındırmak coli ve MDCC fluorofor (Şekil 5) 14,15 ile etiket. MDCC-PBP MDCC floresan (Şekil 6) dramatik bir artış sonucu, (1 x 10 8 M -1 ikinci -1 eşittir ON k) ve (K D = 100 nM) yüksek afinite ile hızlı bir şekilde ücretsiz fosfat bağlar. MDCC-PBP, bu nedenle ön kararlı durum ATP hidrolizi ve fosfat sürümü kinetik 14,15 sağlam bir muhabir. Bu testte için arka plan fosfat seviyesini en aza indirmek için gerekli olduğunu unutmayın; bu nedenle, cam kullanımı TÜM reaktif hazırlık aşamasında kesinlikle kaçınılmalıdır. </li><li> Msh2-Msh6 T DNA, 01:01 karışım oranı ile tek bir karıştırma deneyde, 2 mcM ve 3 mcM son konsantrasyonları verir: 6 mcM G ile ya da protein 4 mcM ile bir örnek hazırlayın. Öncesi kararlı durum deneyleri ilgi sinyal tek bir ciro veya ilk birkaç katalitik ciroları yüksek enzim konsantrasyonları gerektirdiğini unutmayın. Taze ATP ve 20 mcM MDCC PBP muhabiri çözünmüş 1 mM içeren başka bir örnek hazırlayın. Pürin nükleozid fosforilaz / ml ve 200 mcM 7-herhangi bir kirlenmesine neden olan fosfat paspas hizmet vermektedir örnekleri, methylguanosine 0.10 Birimleri ekleyin. En az 20 dakika (Tablo 2) buz üzerinde örnekler inkübe edin. </li></ol> 2. Msh2 Msh6 ATPaz kinetik Aracı hazırlığı <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi deneyler için durdu akış enstrüman hazırlayın. Buna ek olarak, sürücü şırınga 0.5 Birimler / ml pürin nu fosfat kirletici paspascleoside fosforilaz ve 200 mcM 20 dakika 7-methylguanosine. 425 nm dalgaboyu ayarlayın ve MDCC-PBP floresan tespiti için PMT ile 450 nm cut-off filtresi kullanın. </li></ol> 3. Msh2-Msh6 ATPaz deney ve veri analizi <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi örnekleri ile sürücü şırınga yükleyin. Veri Toplama Msh2-Msh6 ve zamanla MDCC-PBP floresan birleştiğinde artış ATP ve MDCC-PBP ve monitör fosfat sürümü ile Msh2 Msh6 karıştırmak için tıklayın. Yüksek kaliteli bir veri seti elde etmek ve dosyayı kaydetmek için en az 5 kinetik izleri toplayın. Ortalama birden fazla kinetik izleri ve analiz için veri dosyası ihracat. </li><li> Fosfat konsantrasyonu ve MDCC PBP floresan arasında doğrusal bir ilişki belirlemek için bir kalibrasyon eğrisi hazırlayın. Bunu yapmak için, farklı durdu-akış aynı deneysel koşullar altında fosfat konsantrasyonları ve her fosfat konsantrasyonu ölçüm maksimum MDCC-PBP floresan MDCC-PBP karıştırın. </li><li> Kalibrasyon eğrisi (Şekil 7) için her fosfat konsantrasyonu karşı maksimum MDCC PBP floresan Arsa ve Msh2 Msh6 reaksiyonlar fosfat konsantrasyonu elde etmek için eğimi kullanın. Arsa fosfat Zamana karşı konsantrasyon ve üstel ve doğrusal bir fonksiyonu veri uygun . Bu fonksiyon, doğrusal kararlı durum faz reaksiyon öncesi kararlı durum ATP hidrolizi ve fosfat serbest bir patlama açıklamaktadır. </li></ol> 4. Msh2-Msh6 ATPaz kinetik Temsilcisi sonuçlar Msh2-Msh6 hidroliz ATP ve hızla ilk katalitik cirosu 1.4 ikinci -1 bültenleri fosfat kinetik verileri göstermektedir. Bu aşama, 0.2 saniye -1 (Şekil 8A) 7 kat daha yavaş kararlı durum k kedi sonraki cirolar sınırlar reaksiyon yavaş bir adım takip ediyor . Ancak, Msh2-Msh6 eşleşmeyen DNA, ATP hidrolizi ve fosfat serbest patlaması bağlı olduğunda, bastırılmış ve Msh2-Msh6 daha uzun bir süre için bir ATP bağlı durumda kalır. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. S. Arıtma E. gelen cerevisiae Msh2-Msh6 coli. Msh2 ve Msh6 genler pET11a vektör klonlanmış ve E. üzerinden ifade edildi coli BL21 (de3) hücreleri. SP-sepharose, heparin ve Q-sepharose reçineler üzerinden kolon kromatografisi ile saflaştırılmış protein kompleksi oldu. Burada gösterilen SDS-PAGE analizi, bir Q-sepharose kolon protein fraksiyonları içerir. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> T uyumsuzluğu bitişik bir Adenozin (ATPaz deneyleri için) veya 2-Aminopurine Adenozin floresan temel analog (DNA bağlayıcı deneyleri için): Şekil 2 Tamamlayıcı tek sarmallı DNA&#39;ları G içeren bir dubleks formu tavlanır. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 KinTek reaktanlarının akışı tek bir karıştırma deney sırasında akış durdu. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig4a.jpg" alt="Şekil 4a" /> Şekil 4a, bir G Msh2-Msh6 etkileşim Kinetiği: T uyumsuzluğu . G içeren dubleks DNA (0.12 mcM) Karıştırma: Msh2-Msh6 (0.8 mcM) ile 2-Aminopurine bitişik T zamanla floresan artışa yol açar ve bir iki moleküllü ON = 2.4 oran sabiti k 10 7 -1 s verimleri -1 etkileşim için. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig4b.jpg" alt="Şekil 4b" /> Şekil 4b, bir G Msh2-Msh6 etkileşim Kinetiği: T uyumsuzluğu . Karışım önceden oluşmuş Msh2 Msh6 G: T (2-Ap) aşırı etiketsiz G: T DNA (8 mcM) ile karmaşık tuzakları herhangi bir ücretsiz Msh2-Msh6 yol açar, zaman içinde floresan azalma ve yavaş disosiasyon hızı sabit verim, ~ 60 saniye uzun bir yarılanma ömrü ile stabil kompleks belirten KAPALI k = 0.012 s -1. Final konsantrasyonları: 0.4 mcM Msh2-Msh6 işaretli DNA 0.06 mcM, 4 mcM etiketsiz G: T DNA tuzak. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 MDCC PBP hazırlık. E. SDS-PAGE analizi coli fosfat bağlayıcı protein (PBP), saflaştırılmış ve MDCC fluorofor ile etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 fosfat MDCC-PBP yanıt. MDCC-fosfat (Pi) sonuçları ile artan MDCC floresan PBP Titrasyon. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig7a.jpg" alt="Şekil 7a" /> Şekil 7a hazırlanması fosfat (Pi) standart eğri. Bir MDCC-PBP (20 mcM), Pi değişen miktarlarda (8 mcM 0) ile karıştırılır.denge ulaşılana kadar d floresan zamanla ölçülür. Final konsantrasyonları: 10 mcM MDCC-PBP, 0 - 4 mcM Pi. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig7b.jpg" alt="Şekil 7b" /> Şekil 7b hazırlanması fosfat (Pi) standart eğri. Maksimum MDCC-PBP floresan çizilen karşı [Pi] bir standart eğri verim. Hattı (bu durumda 0.383 mcM -1) eğim Pi konsantrasyonu MDCC PBP floresan dönüştürmek için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig8a.jpg" alt="Şekil 8a" /> Şekil 8a. Msh2 Msh6 ATPaz kinetiği. Msh2 yokluğunda G-Msh6 (4 mcM): ATP (1 mM) ve MDCC-PBP (20 mcM) ile hızla karıştırılır T DNA, ATP hidrolizi ve Pi serbest bir patlama sergiler. Veri analizi oranı (k hidroliz = 1.4 s -1) ve genlik (2 mcM Msh2-Msh6 başına 1 siteye) veren patlama faz, 0.4 mcM s hızında doğrusal, kararlı durum faz takip 1 (k kedi = 0.2 s -1). <img src="/files/ftp_upload/1874/1874fig8b.jpg" alt="Şekil 8b" /> Şekil 8b. Msh2 Msh6 ATPaz kinetiği. G Ek: T reaksiyonu DNA (6 mcM) karmaşık bir ATP bağlı devlet stabilize, ATP hidroliz patlama bastırır. Final konsantrasyonları: 2 mcM Msh2 Msh6, 500 mcM ATP 3 mcM DNA, 10 mcM MDCC-PBP. Burst kinetiği aşağıdaki denklemle uygun: [Pi] = 0 E-k t + Vt, [Pi] fosfat konsantrasyonu, A 0, k gözlenen çekim hızı sabit patlama genliği ve V hızı doğrusal faz (k cat = V / [Msh2-Msh6]). <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td style="text-align:center;" colspan="3"> Protein </td><td style="text-align:center;" colspan="3"> DNA </td></tr><tr><td> Reaktif </td><td> Hisse senedi </td><td> Çalışma </td><td> McL Vol. </td><td> Hisse senedi </td><td> Çalışma </td><td> McL Vol. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Msh2-Msh6 </td><td> 5 mcM </td><td> 0.8 mcM </td><td> 64 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 2ApG: T </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mcM </td><td> 0.12 mcM </td><td> 4,8 </td></tr><tr><td> tampon </td><td> 10x </td><td> 1x </td><td> 40 </td><td> 10x </td><td> 1x </td><td> 40 </td></tr><tr><td> GKD 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> 296 </td><td> - </td><td> - </td><td> 355 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td></td><td> 400 </td><td></td><td></td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: DNA bağlama reaksiyon <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> Protein </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> Protein-DNA </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> ATP </td></tr><tr><td> Reaktif </td><td> Hisse senedi </td><td> Çalışma </td><td> McL Vol. </td><td> Hisse senedi </td><td> Çalışma </td><td> McL Vol. </td><td> Hisse senedi </td><td> Çalışma </td><td> McL Vol. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Msh2-Msh6 </td><td> 20 mcM </td><td> 4 mcM </td><td> 80 </td><td> 20 mcM </td><td> 4 mcM </td><td> 80 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> G: T </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 </td><td> 6 </td><td> 24 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ATP </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 50 mM </td><td> 1 mM </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 7-MEG </td><td> 250x </td><td> 1x </td><td> 1,6 </td><td> 250x </td><td> 1x </td><td> 1,6 </td><td> 250x </td><td> 1x </td><td> 1,6 </td></tr><tr><td> PNPase </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 4 </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 4 </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PBP-MDCC </td><td> 150 mcM </td><td> 20 mcM </td><td> 53,3 </td><td> 150 mcM </td><td> 20 mcM </td><td> 53,3 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Tampon </td><td> 10x </td><td> 1x </td><td> 40 </td><td> 10x </td><td> 1x </td><td> 40 </td><td> 10x </td><td> 1x </td><td> 40 </td></tr><tr><td> GKD 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> 221 </td><td> - </td><td> - </td><td> 197 </td><td> - </td><td> - </td><td> 346 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td></td><td> 400 </td><td></td><td></td><td> 400 </td><td></td><td></td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tablo 2 ATPaz tepki

<ol>
	<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transient-state+kinetics.">Advances in transient-state kinetics.</a> Curr Opin Biotechnol. 9 (1), 87-89 (1998).</li><li>Johnson, K. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Kinetic analysis of macromolecules. , (2003).</li><li>Obmolova, G., Ban, C., Hsieh, P., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+mismatch+repair+protein+MutS+and+its+complex+with+a+substrate+DNA.">Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA.</a> Nature. 407 (6805), 703-710 (2000).</li><li>Lamers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+DNA+mismatch+repair+protein+MutS+binding+to+a+G+x+T+mismatch.">The crystal structure of DNA mismatch repair protein MutS binding to a G x T mismatch.</a> Nature. 407 (6805), 711-717 (2000).</li><li>Warren, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+MutSalpha+DNA+lesion+recognition+complex.">Structure of the human MutSalpha DNA lesion recognition complex.</a> Mol Cell. 26 (4), 579-592 (2007).</li><li>Kunkel, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Mismatch Repair. Annu Rev Biochem. 74, 681-710 (2005).</li><li>Jiricny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+mismatch-repair+system.">The multifaceted mismatch-repair system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (5), 335-346 (2006).</li><li>Hsieh, P., Yamane, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+mismatch+repair:+Molecular+mechanism,+cancer,+and+ageing.">DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 129 (7-8), 391-407 (2008).</li><li>Jacobs-Palmer, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+nucleotides+on+MutS-DNA+binding+kinetics+clarify+the+role+of+MutS+ATPase+activity+in+mismatch+repair.">The effects of nucleotides on MutS-DNA binding kinetics clarify the role of MutS ATPase activity in mismatch repair.</a> J Mol Biol. 366 (4), 1087-1098 (2007).</li><li>Antony, E., Khubchandani, S., Chen, S., Hingorani, M. M., M, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Msh2+and+Msh6+subunits+to+the+asymmetric+ATPase+and+DNA+mismatch+binding+activities+of+Saccharomyces+cerevisiae+Msh2-Msh6+mismatch+repair+protein.">Contribution of Msh2 and Msh6 subunits to the asymmetric ATPase and DNA mismatch binding activities of Saccharomyces cerevisiae Msh2-Msh6 mismatch repair protein.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 153-162 (2006).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+recognition-coupled+stabilization+of+Msh2-Msh6+in+an+ATP-bound+state+at+the+initiation+of+DNA+repair.">Mismatch recognition-coupled stabilization of Msh2-Msh6 in an ATP-bound state at the initiation of DNA repair.</a> Biochemistry. 42 (25), 7682-7693 (2003).</li><li>Finkelstein, J., Antony, E., Hingorani, M. M., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+and+analysis+of+eukaryotic+multiprotein+complexes+in+Escherichia+coli+using+a+dual-vector+strategy.">Overproduction and analysis of eukaryotic multiprotein complexes in Escherichia coli using a dual-vector strategy.</a> Anal Biochem. 319 (1), 78-87 (2003).</li><li>Zhai, J., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+cerevisiae+Msh2-Msh6+DNA+binding+kinetics+reveal+a+mechanism+of+targeting+sites+for+DNA+mismatch+repair.">S. cerevisiae Msh2-Msh6 DNA binding kinetics reveal a mechanism of targeting sites for DNA mismatch repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 680-685 (2010).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct,+real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">Direct, real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li><li>Brune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inorganic+phosphate+interaction+with+phosphate+binding+protein+from+Escherichia+coli.">Mechanism of inorganic phosphate interaction with phosphate binding protein from Escherichia coli.</a> Biochemistry. 37 (29), 10370-10380 (1998).</li><li>Antony, E., Hingorani, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+ATP+binding+and+hydrolysis+activity+of+the+Thermus+aquaticus+MutS+dimer+is+key+to+modulation+of+its+interactions+with+mismatched+DNA.">Asymmetric ATP binding and hydrolysis activity of the Thermus aquaticus MutS dimer is key to modulation of its interactions with mismatched DNA.</a> Biochemistry. 43 (41), 13115-13128 (2004).</li><li>Gradia, S., Acharya, S., Fishel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+mismatch+recognition+complex+hMSH2-hMSH6+functions+as+a+novel+molecular+switch.">The human mismatch recognition complex hMSH2-hMSH6 functions as a novel molecular switch.</a> Cell. 91 (7), 995-1005 (1997).</li><li>Mazur, D. J., Mendillo, M. L., Kolodner, R. D., D, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Msh6+ATPase+activity+by+mispaired+DNA+induces+a+Msh2(ATP)-Msh6(ATP)+state+capable+of+hydrolysis-independent+movement+along+DNA.">Inhibition of Msh6 ATPase activity by mispaired DNA induces a Msh2(ATP)-Msh6(ATP) state capable of hydrolysis-independent movement along DNA.</a> Mol Cell. 22 (1), 39-49 (2006).</li></ol>

Burada açıklanan DNA uyumsuzluğu bağlayıcı protein örneği, biyolojik moleküllerin mekanizmaları çalışmak için geçici kinetik yöntemler ve yardımcı güç göstermektedir. Tek ciro zaman ölçekte Durduruldu akış ölçümleri, uyumsuz bir baz çifti ve reaksiyon 9 uzun ömürlü bir protein X DNA kompleksi oluşumu Msh2-Msh6 protein hızlı ve belirli bağlayıcı için net bir kanıt sağladı. Ayrıca, ATPaz aktivitesi durdu akışı (ve quench akış) analizi, eşleşmeyen DNA bağla...

application of stopped-flow kinetics methods to investigate the mechanism of action of a dna repair protein

Bu yaklaşımın mekanistik bilgi makromoleküler fonksiyonu yöneten etkin sitenin konsantrasyonları ve içsel hız sabitleri dahil verimleri beri Geçici kinetik analizi, biyolojik makromoleküllerin işleyişini anlamak için vazgeçilmez bir unsurdur. Kararlı durum ölçümleri, sadece genel katalitik verimliliği ve özgünlüğü verimi ise, enzimler durumda, örneğin, geçici ya da önceden istikrarlı bir devlet ölçümleri tanımlamak ve reaksiyon yolu bireysel olayları karakterize. Bireysel, protein-protein ya da protein-ligand etkileşimleri ve hız sınırlayıcı yapı değişiklikleri gibi olaylar sık ​​sık milisaniyelik zaman ölçeğinde meydana gelen ve durdu akışı ve kimyasal quench akış yöntemleri ile doğrudan ölçülebilir. Gibi floresan gibi bir optik sinyal durdu akış ürün sürümü ve katalitik cirosu 1,2 bağlayıcı substrat izleme tepki ilerleme için güçlü ve ulaşılabilir bir araç olarak hizmet vermektedir . Burada, durdu akış kinetiği uygulama Msh2-Msh6 etki mekanizması, baz çifti uyumsuzlukları ve DNA ve sinyalleri uyumsuzluğu onarım (MMR) 3-5 ekleme / silme döngüleri tanıyan bir ökaryotik DNA onarım protein prob rapor. Bunu yaparken, böylece Msh2 Msh6 büyüklükte üç siparişleri (~ 10 -6 to10 -9 üsleri hata sıklığı azalır) DNA replikasyonu doğruluğunu artırır ve genomik bütünlüğünü korumaya yardımcı olur . Beklendiği gibi, insan kusurlu Msh2-Msh6 fonksiyonu kalıtsal non-polipozis kolon kanseri ve diğer sporadik kanserler 6-8 ile ilişkilidir. Bu kritik DNA metabolik protein eylem mekanizmasını anlamak için, eşleşmeyen DNA gibi ATPaz aktivitesi Msh2 Msh6 etkileşim dinamikleri problama yakıtlar MMR olarak eylemler. T uyumsuzluğu ve izleme, gerçek zamanlı olarak 2-aminopurine floresan ortaya çıkan artış: DNA bağlayıcı G bitişik 2-aminopurine (2-Ap) fluorofor içeren DNA ile hızla Msh2-Msh6 karıştırma ile ölçülür. T (2-Ap) etiketsiz tuzak DNA ve izleme süresi 9 üzerinde floresan azalma ile uyumsuzluğu kompleksi: DNA disosiasyon önceden oluşmuş Msh2-Msh6 G karıştırılarak ölçülür. Pre-kararlı durum ATPaz kinetiği 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) karbonil) kumarin) etiketli bağlayıcı fosfat Fosfat Bağlayıcı Protein (MDCC-PBP) (floresan değişimi ile ölçülür Pi) ATP hidrolizi 9,10 Msh2-Msh6 tarafından yayınlandı. T uyumsuzluğu ve oluşumu uzun ömürlü bir Msh2-Msh6 G: Bu veriler G Msh2-Msh6 hızlı bağlanma ortaya T kompleksi bağlı bir ATP şeklinde proteinin ATP hidroliz ve istikrar baskılanması teslim sonuçları . Reaksiyon kinetiği hipotez için açık destek sağlayan ATP bağlı Msh2 Msh6 sinyaller uyumsuz bir baz çifti bağlayıcı çift sarmal DNA onarım. F. Nuh Biro ve Jie Zhai Bu çalışmada eşit katkıda bulunmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein at JoVE.com

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Msh2 Msh6 DNA replikasyon hataları tamir başlatmak için sorumludur. İşte bu kritik protein nasıl çalıştığını anlamak yolunda geçici bir kinetiği yaklaşım sunuyoruz. Rapor durdu akış birleştiğinde DNA bağlayıcı ve eylem Msh2-Msh6 DNA onarım mekanizması altında yatan ATPaz kinetiği ölçmek için deneyler göstermektedir.

DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

application-stopped-flow-kinetics-methods-to-investigate-mechanism

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K Görüntüleme.  Wesleyan University. Msh2 Msh6 DNA replikasyon hataları tamir başlatmak için sorumludur. İşte bu kritik protein nasıl çalıştığını anlamak yolunda geçici bir kinetiği yaklaşım sunuyoruz. Rapor durdu akış birleştiğinde DNA bağlayıcı ve eylem Msh2-Msh6 DNA onarım mekanizması altında yatan ATPaz kinetiği ölçmek için deneyler göstermektedir.

Video: Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biyoloji

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

Bir uygulama<em&gt; In vitro</emDPS Protein Stres Arabuluculuk Özellikleri gözünüzde canlandırın için&gt; DNA Koruma Testi

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...