Ötanazi yapılmış iki ila altı aylık hamile dişi fareden diseke edilen embriyoları,% 1 fetal sığır serumu ile soğuk ve eksiksiz bir ortama yerleştirerek başlayın. Endometriyal doku, plasenta ve yumurta sarısı çuvalını embriyodan 5X büyütme altında çıkardıktan sonra, forseps kullanarak embriyonik kalp bölgesinden kardiyak progenitörleri diseke edin. Beş fare embriyosundan disseke edilen tüm kalp bölgelerini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde çekin ve dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş sallanan bir kovada santrifüj edin.
Süpernatanı çıkarın ve dokuyu bir mililitre doku kültürü sınıfı PBS ile yıkayın. Tüpleri 300G'de dört santigrat derecede bir dakika boyunca santrifüj edin. Ardından, süpernatanı çıkarın ve bir mililitre PBS ile iki yıkamayı tekrarlayın.
İşiniz bittiğinde, PBS'yi% 0.05 Tripsin-EDTA ile değiştirin. Santrifüj yapın ve iki yıkamayı %0.05 Tripsin-EDTA ile tekrarlayın. Dokuyu sindirmek için, 50 mikrolitre% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika ısıtın.
Daha sonra, beş dakika sonra, geniş delikli bir filtre ucu kullanarak süspansiyonu yukarı ve aşağı doğru aspire ederek nazik bir mekanik ayrışma uygulayın. Ayrışmış hücrelere 350 mikrolitre tam ortam ekleyerek Tripsin sindirim aktivitesini inaktive edin. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.
Yeni ayrışmış hücre süspansiyonunu santrifüj ederek hücreleri donmaya hazırlayın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve peleti bir mililitre soğutulmuş dondurma ortamında tekrar askıya alın. Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş bir kriyo şişesine aktarın ve kriyo şişesini önceden soğutulmuş bir dondurma kabına yerleştirin.
Sıralama deneyleri için sıvı azota aktarmadan önce dondurma kabını dört ila sekiz saat boyunca eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin.
