이 연구는 ERA-CVD-2019 및 ANR-JCJC-2020에서 SS로 지원되었습니다. 귀중한 의견을 제공해 주신 U 1251/Marseille Medical Genetics 연구실의 Genomics and Bioinformatics facility(GBiM)와 익명의 검토자에게 감사드립니다.

본 연구에서 채택된 동물 시술은 엑스마르세유 대학교(C2EA-14)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 국가 동물 실험 윤리 위원회(Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; 승인 Apafis N°33927-2021111715507212).
1. 해부 전 시간 정합 설정
<ol><li>마우스 배아를 생성하려면 심장 영역 분리 9.5일 전에 성인 마우스 사이에 시간 제한 교미를 수행합니다. 이 절차에서는 생후 2-6개월의 야생형 C57BL/6J 마우스를 사용하고 하룻밤 동안 시간 교미를 수행했습니다.</li>
	<li>다음날 아침, 암컷 쥐에게 질 플러그가 있는지 확인하십시오. 플러그가 배아일(E) 0.5로 식별되는 날을 고려하십시오.</li>
</ol>2. 조직 준비 및 세포 분리
<ol><li>수태 후 2-6개월된 임산부 C57BL/6J를 CO2를 통해 9.5일째에 안락사시키고 농도가 증가한 후 경추 탈구가 뒤따릅니다. 복부의 아래 부분을 70 % 에탄올로 청소하십시오. 참고: 자궁경부 탈구 전에 마취제를 사용하면 배아가 후속 전사체 및 후성유전체 연구에 영향을 미칠 수 있는 환경 변화에 노출될 수 있으므로 권장하지 않습니다.</li>
	<li>가위로 복부와 복막을 엽니 다. 자궁 뿔을 시각화하고 집게를 사용하여 양쪽 뿔을 절제합니다.</li>
	<li>1% FBS가 함유된 차가운 완전 배지가 들어 있는 페트리 접시에 뿔을 놓습니다. 특정 부피가 필요하지는 않지만 배아가 배지에 완전히 잠기도록 주의해야 합니다. 10cm 페트리 접시 당 대략 10mL의 부피가 적절합니다.</li>
	<li>5배 배율로 설정된 실체현미경 하에서 겸자를 사용하여 각 배아에서 자궁내막 조직, 태반 및 난황낭을 제거합니다.</li>
	<li>배아를 1% FBS가 함유된 차가운 완전 배지가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 그림 1에 설명된 대로 배아 심장 영역을 차가운 완전 배지에서 해부합니다.</li>
	<li>5개의 마우스 배아에서 해부된 심장 영역을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 함께 모았습니다. 스윙 버킷 원심분리기를 4°C로 예냉 냉각합니다.</li>
	<li>스윙 버킷 원심분리기의 RT에서 300x g 에서 1분 동안 원심분리기. 상층액을 제거하고, 조직 배양 등급 PBS 1 mL를 첨가하여 조직을 세척하였다.</li>
	<li>RT에서 300 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세척 단계를 반복하여 총 2회 세척합니다. PBS를 0.05% 트립신/EDTA(1x)로 교체하여 세척을 두 번 반복합니다.</li>
	<li>조직 분해를 위해 37°C에서 10분 동안 0.25% 트립신/EDTA 50μL를 추가합니다. 넓은 오리피스 필터 팁을 사용하여 위아래 제스처로 5분 후에 부드러운 기계적 해리를 적용합니다.</li>
	<li>해리된 세포에 350 μL의 완전 배지를 추가하여 트립신 소화 활성을 비활성화합니다. 재현탁된 세포를 40μm 세포 여과기를 통해 통과시킵니다.</li>
</ol>3. 세포 계수 및 생존력 평가
참고: 세포 수와 생존력은 단일 세포 실험의 성공을 위한 중요한 매개변수입니다. snATAC-seq 접근법은 세포 수의 사소한 변화에 민감합니다. 세포가 너무 적으면 염색질이 과도하게 소화되어 판독 횟수가 증가하고 접근할 수 없는 염색질 영역(노이즈)이 매핑됩니다. 마찬가지로, 세포가 너무 많으면 염기서열을 분석하기 어려운 고분자량 단편이 생성됩니다. 세포 및 핵 농도의 정확한 측정을 위해, 세포 수 및 생존율을 두 가지 상이한 방법에 의해 평가하였다.
<ol><li>아래에 설명된 대로 세포 계수를 위해 트립판 블루 분석을 수행합니다.<ol><li>0.4% 트리판 블루 염색 용액을 볼텍스(vortex)하고, 2,000 x g의 실온에서 10초 동안 회전시키고, 10 μL를 마이크로튜브에 옮긴다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 세포 현탁액을 혼합하고 이미 분취된 10μL의 트리판 블루 용액에 10μL의 현탁액을 추가합니다. 피펫으로 조심스럽게 10 번 섞는다.</li>
		<li>염색된 세포 10μL를 계수 슬라이드에 옮깁니다. 슬라이드를 카운터에 놓으면 세포 농도와 생존력이 자동으로 계산됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래에 설명된 대로 형광 기반 사망률 평가를 수행합니다. 참고: 이 분석은 세포 생존율을 평가하기 위해 형광 염료(에티듐 호모다이머-1, EthD-1 및 칼세인 AM)의 사용을 기반으로 합니다. 시중에서 판매되는 키트를 사용했으며 적절한 준비 및 사용을 위해 공급자의 지침을 따랐습니다.<ol><li>제공된 2mM EthD-1 원액 5μL를 멸균 조직 배양 등급 D-PBS 1mL에 첨가하여 10μM EthD-1 용액을 준비하고 완전한 혼합을 보장하기 위해 5초 동안 볼텍스합니다.</li>
		<li>공급된 4mM 칼세인 AM 원액 2.5μL를 이미 제조된 EthD-1 용액으로 옮깁니다. 완전한 혼합을 보장하기 위해 5초 동안 소용돌이.</li>
		<li>생성된 10μL EthD-1 및 10μM 칼세인 AM 작업 용액 10μL를 10μL의 세포 현탁액에 추가합니다. 알림: Calcein은 수용액에서 가수분해에 매우 취약하므로 1일 이내에 이 작업 용액을 사용하십시오.</li>
		<li>염색된 세포 10μL를 계수 슬라이드에 옮깁니다. 슬라이드를 자동 형광 세포 계수기에 삽입합니다. GFP 필터를 사용하여 살아있는 세포를 세고 RFP 필터로 죽은 세포를 계산합니다. 참고: 두 가지 계수 방법은 유사한 세포 수와 생존력을 제공했으며 새로 해리된 세포의 총 수는 배아 심장 영역(0.06mm3)당 평균 약 20,000개의 세포로 추정되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 세포 동결
<ol><li>세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리한다. 튜브 바닥을 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 1mL의 냉장 냉동 매체에 재현탁합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 예냉된 극저온으로 옮기고 극저온 냉동을 예냉된 냉동 용기에 넣습니다.</li>
	<li>용기를 -80 ◦C에 4시간에서 8시간 동안 놓습니다. 다운스트림 단일 핵 RNA 및 ATAC 시퀀싱 실험을 위해 극저온 이온을 액체 질소로 옮깁니다. 알림: 극저온 액체는 사용 전에 드라이아이스로 운반해야 합니다. 우리의 경험에 따르면, 세포는 세포 생존력의 손실없이 적어도 6 개월 동안 액체 질소에 저장 될 수 있습니다. 보관 온도는 얼음 결정의 형성을 방지하기 위해 항상 -150 °C 이하로 유지되어야 합니다.</li>
</ol>5. 세포 해동 및 죽은 세포 제거
<ol><li>극저온 액체를 37°C 수조에 1-2분 동안 두십시오. 극저온에 작은 결정이 남아 있으면 제거하십시오.</li>
	<li>예열된(37°C) 완전 배지 1mL를 추가합니다. 피펫과 세 번 섞는다. 현탁액을 10mL의 따뜻한 완전 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>전체 세포 현탁액을 30μm 스트레이너 위로 통과시킵니다. 1-2mL의 따뜻한 완전 배지로 여과기를 헹구고 동일한 원뿔형 튜브에 흐름을 수집합니다.</li>
	<li>300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. PBS로 1회 세척하고, 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로튜브로 옮긴다.</li>
	<li>300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상청액을 제거한다.</li>
	<li>제공된 자성 마이크로비드 100μL를 펠렛 세포에 추가하고 광경 피펫 팁을 사용하여 5회 균질화합니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>그 동안 자기 분리 컬럼(용량: 1 x 107 내지 2 x 108 셀)을 500 μL의 1x 결합 완충액으로 헹굽니다.</li>
	<li>인큐베이션이 완료되면 마이크로비드가 포함된 세포 현탁액을 500μL의 1x 결합 완충액으로 희석합니다.</li>
	<li>세포 현탁액(0.6 μL)을 제조된 자기 분리 컬럼에 적용한다. flow-through는 음성으로 선택된 살아있는 세포 분획이고, 자기적으로 유지된 분획은 긍정적으로 선택된 죽은 세포이다.</li>
	<li>15mL 원심분리기 튜브에 살아있는 세포 유출물을 수집합니다. 세포 현탁액과 컬럼이 들어 있는 1.5mL 마이크로튜브를 2mL의 1x 결합 완충액으로 헹구고 동일한 15mL 튜브에 폐수를 수집합니다.</li>
	<li>300 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>PBS-BSA 용액 1mL를 넣고 와이드 오리피스 피펫 팁을 사용하여 5회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>300 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>PBS-BSA 1mL를 첨가하여 펠릿을 재현탁하고 세척 단계를 반복하여 총 2회 세척합니다.</li>
	<li>PBS-BSA 용액 100μL에 세포를 재현탁합니다. 피펫팅으로 10회 부드럽게 섞는다.</li>
	<li>앞서 기술된 방법(단계 3.1 및 단계 3.2)을 사용하여 세포의 농도 및 생존율을 결정한다. 다음 단계로 진행하려면 셀 수가 ≥100,000개인지 확인합니다. 대표적인 결과는 그림 2 를 참조하십시오. 참고: 냉동 보존은 살아있는 세포의 초기 출발 물질의 약 40%를 손실합니다. 시작 세포 수에 따라 마그네틱 컬럼에서 비드 분리하면 세포 생존율이 높지만 총 세포 수를 2배에서 5배로 나눕니다. 죽은 세포를 제거하기 위한 컬럼 기반 자기 키트의 사용은 충분한 출발 물질을 사용할 수 있는 경우에만 권장됩니다.</li>
</ol>6. 핵 분리
참고: snATAC 및 snRNA-seq 결합은 깨끗하고 손상되지 않은 핵의 현탁액으로 수행됩니다. 사용된 세포 유형에 대한 용해 조건(용해 시간 및 NP40 농도)의 최적화가 권장됩니다. 최적의 용해 시점과 세제 농도는 핵 형태를 방해하지 않고 용해되는 최대 세포 수를 초래하는 것입니다. 세포/핵의 손실은 고정각 원심분리기 대신 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 줄일 수 있습니다. 플라스틱의 핵 보유를 최소화하려면 저보유 피펫 팁과 원심분리기 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 핵 회수를 증가시킬 수 있습니다. 피펫 팁과 원심분리기 튜브를 5% BSA로 코팅하는 것은 비용이 적게 들지만 시간이 많이 소요되는 대안입니다.
<ol><li>70% 에탄올과 RNase 제거 용액으로 작업장과 재료를 청소합니다.</li>
	<li>스윙 버킷 원심분리기를 4°C로 예냉 냉각합니다. 용해 완충액, 용해 희석 완충액, 0.1x 용해 완충액 및 세척 완충액을 새로 준비합니다( 표 1 참조). 얼음 위에 버퍼를 유지하십시오.</li>
	<li>세포 현탁액을 스윙 버킷 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 세포 펠릿이 빠지지 않도록 튜브 바닥을 건드리지 않고 모든 상층액을 부드럽게 제거합니다.</li>
	<li>100 μL의 냉각된 0.1x 용해 완충액을 추가합니다. 피펫팅으로 10회 부드럽게 혼합합니다. 얼음에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>식힌 세척 버퍼 1mL를 넣고 5회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 4 °C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거합니다.</li>
	<li>식힌 세척 버퍼로 세척을 반복하여 총 3회 세척합니다. 희석된 핵 완충액을 준비합니다. 재현탁 후 핵 원액을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>7. 분리된 핵의 품질 및 수량 평가
참고: 초기 세포 수를 기반으로 세포 용해 중 약 50%의 핵 손실을 추정하고 저온 희석 핵 완충액에 적절한 수의 세포를 재현탁합니다. 냉각된 희석된 핵 완충액을 사용한 재현탁 부피의 계산은 표적 핵 회수율과 제조업체의 사용자 가이드에서 권장하는 해당 핵 스톡 농도를 기반으로 합니다. 보충 프로토콜 1에서 이 계산의 예를 참조하십시오.
<ol><li>초기 세포 수를 기반으로 세포 용해 중 약 50%의 핵 손실을 추정하고 적절한 수의 세포를 저온 희석 핵 완충액에 재현탁합니다.</li>
	<li>실제 핵 농도를 결정합니다. 2 μL의 핵 저장 용액과 8 μL의 희석된 핵 완충액을 혼합하고 미리 분취된 10 μL의 트리판 블루 또는 EthD-1/calceinAM 작업 용액에 혼합물을 추가합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 핵을 계산합니다. 세포의 5% 미만이 생존해야 합니다. 대표적인 결과는 그림 3 을 참조하십시오.</li>
	<li>핵 스톡의 부피와 희석된 핵 완충액의 부피를 계산하여 전치 반응에 권장되는 농도에서 총 부피 5μL를 얻습니다(제조업체의 사용 설명서 참조). 사용자 가이드17에 따라 즉시 전위 반응을 진행하십시오. 참고: 전치 반응에서 ATAC 및 GEX 라이브러리의 구성까지의 모든 단계는 snRNA-seq 및 snATAC-seq 조합에 사용된 키트의 사용자 가이드에 따라 수행되었습니다17.</li>
</ol>8. snRNA-seq 및 snATAC-seq 라이브러리의 품질 분석
<ol><li>차세대 염기서열 분석을 진행하기 전에 최종 snATAC-seq 및 유전자 발현 GEX 라이브러리의 품질 및 크기 분포를 검증합니다. 단편 분석 시스템을 사용하여 라이브러리에서 식별된 염기서열의 품질과 양을 평가합니다. 대표적인 품질 평가 결과는 그림 4 를 참조하십시오. 참고: snATAC-seq 라이브러리의 최종 추적은 뉴클레오솜 감기의 주기성을 나타내야 하며 크기는 200bp에서 수 Kbp 범위여야 하는 반면 유전자 발현 라이브러리의 크기는 300bp에서 600bp 범위여야 합니다.</li>
</ol>

Single-Cell Resolution에서 Mouse Cardiac Progenitor Cells의 핵 분리(Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells at Single-Cell Resolution)

<ol>
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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data+with+structural+similarity.">Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity.</a> Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).</li><li>What is CellRanger. 10x Genomics Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a> (2023)</li><li>Hill, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+multi-omic+characterization+of+congenital+heart+disease.">Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease.</a> Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).</li><li>Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing:+In-depth+decoding+of+heart+biology+and+cardiovascular+diseases.">Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases.</a> Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).</li><li>Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+relief:+Emerging+methods+to+mitigate+dissociation-induced+artefacts.">Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts.</a> Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).</li><li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+effects+in+single-cell+RNA-sequencing+data+are+corrected+by+matching+mutual+nearest+neighbors.">Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMNN:+Batch+effect+correction+for+single-cell+RNA-seq+data+via+supervised+mutual+nearest+neighbor+detection.">SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection.</a> Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).</li><li>Stefanovic, S., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-dependent+transcriptional+and+epigenetic+control+of+cardiac+lineage+specification+and+differentiation.">GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).</li><li>Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+proliferation,+and+growth+of+the+mammalian+heart.">Development, proliferation, and growth of the mammalian heart.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).</li><li>Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outflow+tract+formation-embryonic+origins+of+conotruncal+congenital+heart+disease.">Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).</li><li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data.">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li><li>Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+CUT&amp;RUN+method+for+regulation+network+reconstruction+of+low+abundance+transcription+factor.">An improved CUT&amp;RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor.</a> Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

snRNA-seq 및 snATAC-seq 연구를 결합하여 발달 중인 심장의 세포 조성을 분석하면 선천성 심장 질환의 기원에 대한 더 깊은 이해를 얻을 수 있다26. 여러 연구실에서 snRNA-seq27에 대한 심장 조직 동결 보존의 효과를 연구했습니다. 인간 질병의 마우스 모델에서 신선한 미세 해부 조직을 사용하여 snRNA-seq 및 snATAC-seq를 수행하는 것은 서로 다른 실험 조건을 비교할 때 논?...

선천적 결함 중 선천성 심장 결함 (CHD)이 가장 흔하며 매년 출생의 약 1 %에서 발생합니다 1,2. 유전적 돌연변이는 소수의 경우에만 확인되며, 이는 유전자 조절의 이상과 같은 다른 원인이 CHD 2,3의 병인에 관여함을 의미합니다. 심장 발달은 다양하고 상호 작용하는 세포 유형의 복잡한 과정으로, 인과적 비암호화 돌연변이와 유전자 조절에 미치는 영향을 식별하기가 어렵습니다. 심장의 기관 형성은 심근, 섬유아세포, 심외막 및 심내막 세포를 포함한 심장 세포의 다양한 아형을 생성하는 세포 전구체에서 시작됩니다 4,5. 단세포 유전체학(single-cell genomics)은 심장 발달을 연구하고 세포 이질성이 건강과 질병에 미치는 영향을 평가하는 핵심 방법으로 부상하고 있다6. 다양한 파라미터를 동시에 측정하기 위한 다중 오믹스 분석법의 개발과 전산 파이프라인의 확장은 정상 및 병든 심장에서 세포 유형 및 아형의 발견을 용이하게 했다6. 이 기사는 다운스트림 snRNA-seq 및 snATAC-seq(snRNA-seq 및 snATAC-seq 결합)7,8,9와 호환되는 마우스 배아에서 얻은 냉동 심장 전구 세포에 대한 신뢰할 수 있는 단일 핵 분리 프로토콜에 대해 설명합니다.
ATAC-seq는 조절 개방 염색질 영역의 식별과 뉴클레오솜10,11의 위치를 허용하는 강력한 방법입니다. 이 정보는 전사 인자의 위치, 정체성 및 활동에 대한 결론을 도출하는 데 사용됩니다. 리모델러를 포함한 염색질 인자의 활성과 RNA 중합효소의 전사 활성은 염색질 구조 1,2의 정량적 변화를 측정하는 데 매우 민감하기 때문에 분석할 수 있습니다. 따라서 ATAC-seq는 특정 세포 유형에서 전사 조절을 제어하는 메커니즘을 밝히기 위한 강력하고 공정한 접근 방식을 제공합니다. ATAC-seq 프로토콜은 또한 단일 세포에서 염색질 접근성을 측정하기 위해 검증되었으며, 세포 집단10,12,13 내에서 염색질 구조의 가변성을 나타냅니다.
최근 몇 년 동안 단일세포 분야에서 괄목할 만한 발전이 있었지만, 가장 큰 어려움은 이러한 실험을 수행하는데 필요한 신선한 시료를 처리하는 것이다14. 이러한 어려움을 피하기 위해, 냉동 심장 조직 또는 세포15,16을 사용하여 snRNA-seq 및 snATAC-seq와 같은 분석을 수행하기 위해 다양한 테스트가 수행되었습니다.
단세포 유전체학 데이터를 분석하기 위해 여러 플랫폼이 사용되었다17. 단세포 유전자 발현 및 ATAC 프로파일링을 위해 널리 사용되는 플랫폼은 다중 미세유체 액적 캡슐화를 위한 플랫폼이다17. 이러한 플랫폼은 미세 유체 챔버를 사용하기 때문에 파편이나 응집체가 시스템을 막아 사용할 수 없는 데이터를 생성할 수 있습니다. 따라서 단일 세포 연구의 성공 여부는 개별 세포/핵의 정확한 분리에 달려 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 선천성 심장 결함 18,19,20,21,22,23을 이해하기 위해 snRNA-seq 및 snATAC-seq를 사용하는 최근 연구와 유사한 접근 방식을 사용합니다. 이 절차는 갓 미세 해부된 심장 조직의 효소 해리에 이어 마우스 심장 전구 세포의 냉동 보존을 활용합니다. 해동 후, 생존 가능한 세포는 핵 분리를 위해 정제되고 처리된다. 이 연구에서, 이 프로토콜은 마우스 심장 전구 세포의 동일한 핵 제제로부터 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터를 얻기 위해 성공적으로 사용되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59222C-500ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X)</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess III FL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin (5%)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650-5x5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Sterile and RNase-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Index Kit TT Set A 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milieu McCoy 5A&#160;</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16600082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 S2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PluriStrainer Mini 40&#181;m</td>
			<td>PluriSelect</td>
			<td>V-PM15-2021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Index Kit N Set A, 96 rxn</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 90mm Petri dish Sterilin</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile double-distilled water</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R0582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride solution (HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2194-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0.4%)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% - EDTA 1X</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide orifice filtered pipette tips 200 &#956;l</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1152-965-008-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS SteREO Discovery.V8</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>No catalog number</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nuclei isolation from mouse cardiac progenitor cells for epigenome and gene expression profiling at single-cell resolution

발달중인 심장은 복잡한 조절 메커니즘에 의해 제어되는 다양한 전구 세포를 포함하는 복잡한 구조입니다. 개별 세포의 유전자 발현 및 염색질 상태를 검사하면 세포 유형 및 상태를 확인할 수 있습니다. 단일 세포 시퀀싱 접근법은 심장 전구 세포 이질성의 여러 가지 중요한 특성을 밝혀냈습니다. 그러나 이러한 방법은 일반적으로 신선한 조직으로 제한되어 기술적 변동성을 줄이기 위해 신선한 조직을 동일한 실행에서 한 번에 처리해야하기 때문에 다양한 실험 조건의 연구를 제한합니다. 따라서 이 분야에서는 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 및 고처리량 시퀀싱(snATAC-seq)을 통한 트랜스포사제 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석과 같은 방법에서 데이터를 생성하는 쉽고 유연한 절차가 필요합니다. 여기에서 우리는 후속 단일 핵 이중 오믹스(결합된 snRNA-seq 및 snATAC-seq)에 대해 핵을 신속하게 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 심장 전구 세포의 냉동 샘플에서 핵을 분리 할 수 있으며 미세 유체 챔버를 사용하는 플랫폼과 결합 할 수 있습니다.

Among birth defects, congenital heart defects (CHDs) are the most common, occurring in about 1% of live births each year1,2. Genetic mutations are identified in only a minority of cases, implying that other causes, such as abnormalities in gene regulation, are involved in the etiology of CHD2,3. Cardiac development is a complex process of diverse and interacting cell types, making the identification of causal noncoding mutations and their effects on gene regulation challenging. Organogenesis of the heart begins with cellular progenitors that give rise to different subtypes of cardiac cells, including myocardial, fibroblast, epicardial, and endocardial cells4,5.&#160;Single-cell genomics is emerging as a key method for studying heart development and assessing the impact of cellular heterogeneity in health and disease6. The development of multi-omics methods for the simultaneous measurement of different parameters and the expansion of computational pipelines has facilitated the discovery of cell types and subtypes in the normal and diseased heart6. This article describes a reliable single-nucleus isolation protocol for frozen cardiac progenitor cells obtained from mouse embryos that is compatible with downstream snRNA-seq and snATAC-seq (as well as snRNA-seq and snATAC-seq combined)7,8,9.
ATAC-seq is a robust method that allows the identification of regulatory open chromatin regions and the positioning of nucleosomes10,11. This information is used to draw conclusions about the location, identity, and activity of transcription factors. The activity of chromatin factors, including remodelers, as well as the transcriptional activity of RNA polymerase, can, thus, be analyzed since the method is highly sensitive for measuring quantitative changes in chromatin structure1,2. Thus, ATAC-seq provides a robust and impartial approach to uncovering the mechanisms controlling transcriptional regulation in a specific cell type. ATAC-seq protocols have also been validated to measure chromatin accessibility in single cells, revealing variability in the chromatin architecture within cell populations10,12,13.
Although there have been notable advances in the field of single cells in recent years, the main difficulty is the processing of the fresh samples needed to perform these experiments14. To circumvent this difficulty, various tests have been carried out with the aim of conducting analyses such as snRNA-seq and snATAC-seq with frozen cardiac tissue or cells15,16.
Several platforms have been used to analyze single-cell genomics data17. The widely used platforms for single-cell gene expression and ATAC profiling are platforms for multiple microfluidic droplet encapsulation17. As these platforms use microfluidic chambers, debris or aggregates can clog the system, resulting in non-usable data. Thus, the success of single-cell studies depends on the accurate isolation of individual cells/nuclei.
The protocol presented here uses a similar approach to recent studies using snRNA-seq and snATAC-seq to understand congenital heart defects18,19,20,21,22,23. This procedure utilizes the enzymatic dissociation of freshly microdissected cardiac tissue followed by the cryopreservation of mouse cardiac progenitor cells. After thawing, the viable cells are purified and processed for nuclear isolation. In this work, this protocol was successfully used to obtain snRNA-seq and snATAC-seq data from the same nuclear preparation of mouse cardiac progenitor cells.

저자 스포트라이트: Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution  

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

The main objective of this protocol is to study the interaction of genetic and environmental factors in the context of heart development and their contribution to congenital heart defects. Single nuclei approaches such as single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic are emerging as key methods to study cellular heterogeneity in health and disease during heart development. One limiting step of these experiments is that all the sample have to be run simultaneously.While working with all the experimental conditions, collecting fresh enough material is for all the condition simultaneously could be challenging. Although there have been a significant progress in the field in single cell for recent years, the main difficulty is processing free samples. Avoiding the difficulty is extremely benefit to identify the molecular mechanism underlying congenital heart disease defects.This protocol describes the steps to follow for successfully isolating high quality nuclei from frozen cardiac cell suspension obtained from mouse embryos. And our protocol is compatible with downstream single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic. We hope that this procedure will help interested researchers and encourage them to use this powerful method for their research.

단세포 접근법을 위한 단세포 현탁액의 준비와 비교할 때, 단핵 현탁액의 준비는 훨씬 더 까다롭고 더 높은 수준의 분해능과 처리가 필요합니다. snRNA-seq와 snATAC-seq의 성공적인 결합을 위한 핵심 요소는 깨끗하고 손상되지 않은 핵 현탁액입니다. 효율적인 핵 분리를 위한 프로토콜은 각 조직 유형 및 상태(신선 또는 냉동)에 맞게 조정되어야 합니다. 여기서, 냉동 마우스 배아 심장 세포로부터 핵을...

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여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

이 프로토콜의 주요 목적은 심장 발달의 맥락에서 유전적 요인과 환경적 요인의 상호 작용과 선천성 심장 결함에 대한 기여도를 연구하는 것입니다. 단일 핵 RNA-seq 및 단일 핵 운동 실조와 같은 단일 핵 접근법은 심장 발달 중 건강 및 질병의 세포 이질성을 연구하는 핵심 방법으로 부상하고 있습니다. 이러한 실험의 한 가지 제한 단계는 모든 샘플을 동시에 실행해야 한다는 것입니다.모든 실험 조건으로 작업하는 동안 모든 조건에 대해 충분히 신선한 재료를 수집하는 것은 어려울 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 단일 세포 분야에서 상당한 진전이 있었지만 주요 어려움은 무료 샘플을 처리하는 것입니다. 이러한 어려움을 피하는 것은 선천성 심장 질환 결함의 기저에 있는 분자 메커니즘을 식별하는 데 매우 유익합니다.이 프로토콜은 마우스 배아에서 얻은 냉동 심장 세포 현탁액에서 고품질 핵을 성공적으로 분리하기 위해 따라야 할 단계를 설명합니다. 그리고 우리의 프로토콜은 다운스트림 단일 핵 RNA-seq 및 단일 핵 운동 실조와 호환됩니다. 이 절차가 관심 있는 연구자들에게 도움이 되고 연구에 이 강력한 방법을 사용하도록 권장하기를 바랍니다.

nuclei-isolation-from-mouse-cardiac-progenitor-cells-for-epigenome

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

1.3K 조회수.  Aix-Marseille University. 이 프로토콜의 주요 목적은 심장 발달의 맥락에서 유전적 요인과 환경적 요인의 상호 작용과 선천성 심장 결함에 대한 기여도를 연구하는 것입니다. 단일 핵 RNA-seq 및 단일 핵 운동 실조와 같은 단일 핵 접근법은 심장 발달 중 건강 및 질병의 세포 이질성을 연구하는 핵심 방법으로 부상하고 있습니다. 이러한 실험의 한 가지 제한 단계는 모든 샘플을 동시에 실행해야 한다는 ...