Kriyo şişeleri içeren dondurulmuş ayrışmış embriyonik kalp hücresi süspansiyonunu bir ila iki dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirerek başlayın. Çözülmüş süspansiyona 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir mililitre tam ortam ekleyin ve bir pipetle üç kez karıştırın. Daha sonra süspansiyonu, 10 milimetre sıcak tam ortam içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Tüm hücre süspansiyonunu 30 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin ve süzgeci bir ila iki mililitre sıcak, tam ortamla durulayın. Akışı aynı konik tüpte toplayın. Ardından, tüpleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti PBS ile yıkayın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve peletlenmiş hücrelere sağlanan manyetik mikroboncukların 100 mikrolitresini ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyondan önce geniş bir domuz pipet ucu kullanarak süspansiyonu beş kez homojenize edin.
Bu arada, manyetik ayırma kolonunu 500 mikrolitre bağlama tamponu ile durulayın. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, mikroboncuk hücresi süspansiyon karışımını 500 mikrolitre bağlama tamponu kullanarak seyreltin. Ardından, manyetik ayırma sütununa 0,6 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Canlı hücre atık suyunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu içeren 1,5 mililitrelik mikro tüpü bir mililitre bağlama tamponu kullanarak durulayın. Durulamadan sonra, bağlama tamponunu 1,5 mililitrelik mikro tüpten kolona aktarın ve atık suyu aynı 15 mililitrelik tüpte toplayın.
Bir mililitre bağlama tamponu kullanarak 1,5 mililitrelik tüpün durulanmasını tekrarlayın. Atık suyu beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj ettikten sonra, hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın. PBS BSA çözeltisinden bir mililitre ekleyin ve geniş delikli pipet ucu kullanarak pipetleyerek yavaşça karıştırın.
Daha sonra hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarın. Yine, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın. Bir mililitre PBS BSA'nın iki yıkamasını tekrarlayın.
Bir mililitre PBS BSA'yı çıkardıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre PBS BSA çözeltisinde yeniden askıya alın. 10 kez pipetleyerek karıştırın. 100.000 hücreden fazla veya ona eşit bir hücre sayısı sağlamak için bir tripan mavisi testi yaparak konsantrasyonu belirleyin ve hücrelerin yaşayabilirliği için floresan bazlı bir değerlendirme yapın.
Çözüldükten sonra ölü hücrelerin sıralanması ve çıkarılmasının ek adımı, önemli ölçüde daha yüksek hücre canlılığına sahip daha temiz bir hücre süspansiyonunun tedarik edilmesine izin verdi ve başlangıç numunesinin kalitesini artırdı. Daha fazla doğruluk için, hücreleri ve çekirdekleri ölçmek için, tripan mavisi ve canlılığın floresan bazlı değerlendirmesi de dahil olmak üzere iki farklı sayma yöntemi kullanılmıştır. Bu protokolde hücre canlılığının çekirdek izolasyonundan önce %80-90'dan çekirdek izolasyonundan sonra %5'in altına indiği gözlenmiştir.
