Başlamak için, murin kemik iliği hücrelerini Hoechst 33342 ile boyayın. Akış sitometrisi için gerekli yazılımı başlatın, ardından QC standardizasyonunu seçin. QC prosedürüne başlamak için başlat'ı seçmeden önce kalite kontrol veya QC FluoroSphere numune tüpünü tüp tutucuya yerleştirin.
Yeni bir deneme oluşturmak için Dosya menüsünde Yeni Deneme'ye tıklayın ve dosya yolunu belirtin ve denemeyi kaydedin. Ardından Ayarlar menüsünde Kanal Ayarla'yı seçin. Kanal sinyali onay kutusunu seçin ve reaktif adını etiket sütununa ekleyin.
Ardından, çizimler oluşturmak için çizim alanındaki sahte renkli çizimler simgesini tıklayın. Yeni numune tüpleri oluşturmak ve adlarını değiştirmek için test tüpü ekranında tüp ekle'ye tıklayın. Ardından örneği yüklemek, grafikleri görüntülemek ve geçitleri oluşturmak için Çalıştır'ı seçin.
Kazanç ve eşik ayarlarını yapın ve verileri kaydetmek için Kaydet'i seçin. Kapı ayar mantığını tasarlamak için, FSEW'i seçmek için x eksenine tıklayın ve FSEA'yı seçmek için y eksenine tıklayın. Tek tek hücreyi daire içine almak ve bitişik hücreleri dışlamak için A kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin.
İkinci çizim için, FSEA'yı seçmek için x eksenine tıklayın ve SSEA'yı seçmek için y eksenine tıklayın. Parçalı olmayan hücreleri ayırmak ve hücresel kalıntıları dışlamak için B kapısını çizmek için Çokgen Kapısı'nı seçin. Üçüncü çizim için, PIA'yı seçmek için x eksenine tıklayın ve SSEA'yı seçmek için y eksenine tıklayın.
B kapısını çizdikten sonra, negatif propidyum iyodür sergileyen canlı hücreleri seçin ve canlı hücreler elde etmek için C kapısını çizin. Dördüncü iki boyutlu çizim için, Hoechst Kırmızısı'nı seçmek için x eksenini tıklatın ve Hoechst Mavisi'ni seçmek için y eksenini tıklatın. Grafiği sağ tıklayın ve açılır menüden Özellik'i seçin.
Hem x ekseni hem de y ekseni için doğrusal formatı seçin ve yan popülasyon hücreleri için geçidi çizin. Hem kontrol hücrelerini hem de deney hücrelerini tespit etmek için 355 nanometre ve 405 nanometre lazerleri aynı anda kullanın. İki lazere karşılık gelen 690 x 50 ve 450 x 50 nanometre kanallarında floresan sinyalleri alın.
Şeffaf yan popülasyon hücrelerini görselleştirmek için Hoechst 33342 boyasının 355 ve 405 nanometre lazerlerle etkili bir şekilde uyarılmasını gözlemleyin. Aynı numuneler için, hücre tespiti için 375 nanometre ve 405 nanometre lazerleri kullanın. 355 nanometre lazer, Hoechst 33342 boyasını etkili bir şekilde uyardı ve kemik iliğinin SP hücrelerinin net bir şekilde gözlemlenmesini sağladı.
355 nanometre lazer ve 405 nanometre lazer tarafından tespit edilen aynı örneklerin SP hücrelerinin temelde aynı olduğu bulundu. Hem 375 nanometre hem de 405 nanometre lazerler, SP hücreleri elde etmek için Hoechst 33342'yi etkili bir şekilde uyardı.
