Biz floresan ligand sentezi, Biyoteknoloji Araştırma Interdisciplinaray Merkezi, ligand-litik peptid sentezi için UF ve floresan mikroskoplar erişim sağlamak için Socolovsky Mikroskop tesisi için LSU peptid tesisin eski müdürü Dr. Allison Richard teşekkür ederim. Finansman Savunma Bakanlığı SERDP Keşif Kalkınma Programı (TOHUM), Enerji ve Çevre Koruma Ajansı Bölümü, Biyoteknoloji AgCenter Disiplinlerarası Takım Programı ve Louisiana devlet tarafından sağlanmıştır.

Deney 1: termit gut çıkarımı anaerobik koşullar altında protozoa <ol><li> Nem ve oksijen seviyelerini sürekli olarak kontrol ve ısı eşitsizliği ortadan kaldırmak için bir kurutucu ve D tipi katalizör Stak Paks ile hava dolaşımı için bir torpido gözü bir fan kutusu (Coy Laboratories) kullanın. 20 ila 30 dakika azot sürekli bir akış ile torpido gözü doldurun. 1 saat için bir oksijen sensörü (C-squared, Inc.) Oksijen düzeyleri Monitör Azot gerektiğinde anaerobik şartlara ulaşmak ve korumak için kullanın. </li><li> Träger U ortam hazırlayın (Träger 1934) ve pH 7.0 &#39;ye ayarlamak. % 2.5,% 5 hidrojen, karbon dioksit ve oksijen kalıntılardan temizlemek için 1 saat süreyle% 92.5 azot karışımı ile torpido gözü filtre steril medya Sparge. </li><li> Adsorpsiyon önlemek için Sigmacote kullanarak deneylerde kullanılan mikroskop lamı, mikrosantrifüj tüpler, pipetler, cam vb dahil olmak üzere tüm malzemeler Silanize protozoa ya da yüzeylere peptidler (Sigmacote, Sigma, # SL-2, http://www.sigmaaldrich.com/ etc / medialib / docs / Sigma/Product_Information_Sheet/1/sl2pis.Par.0001.File.tmp/sl2pis.pdf). </li><li> Protozoa termit gut kesinlikle anaerobik organizmalar oldukları için, oksijene maruz bırakılmamalıdır. Bu nedenle aşağıdaki adımları bir torpido gözü (1.1) anaerobik koşullar altında yapılmaktadır. Forseps batığın bir termit işçinin% 70 etanol ve yaklaşık 10 sn boyunca hafifçe girdap yüzey kirleri çıkarmak için bütün vücudu. </li><li> Etanol işçi çıkarın ve yaklaşık 20 saniye süreyle temiz Kimwipe kurumasını bekleyin Işçi karın tutun ve yavaşça yukarıya veya aşağıya doğru 45 derecelik bir açı gut çekmek için başka bir çift forseps ile karın ucu kapmak için ince uçlu steril bir forseps kullanın. Bağırsak düz bir açıyla ve çok fazla bir güçle çekilir parçalayın muhtemeldir. (10) bir mikroskop lamı üzerine 100 ul Träger U medya bir damla cesaret yerleştirin. </li><li> Pierce, serbest bırakmak için steril ince diseksiyon probları bir çift ile bağırsaklar protozoa ve 200 ul pipet yardımıyla 1 ml mikrosantrifüj 900 ul Träger U medya içeren bir tüp içine yavaşça bağırsak içeriğini aktarmak. Bağırsak duvar parçaları (5 sn), yeni bir tüp süpernatant transferi 900 ul sedimantasyon için izin. </li><li> 10 ul protozoa kültürü sigmacoted bir mikroskop lamı aktarın ve 200 X büyütmede bir mikroskop altında protozoa durumunu kontrol edin. </li><li> Aerobik protozoa Tetrahymena pyriformis, Amoeba sp, Euglena sp, ve Paramecium sp kontrol kültürleri hazırlayın. (Carolina Biyolojik Tedarik Şirketi, Burlington, Kuzey Carolina) yanı sıra, tedarikçi tarafından önerilen kültür ortamı Escherichia coli bir gecede kültür olarak . </li></ol> Deney 2: floresan boya ile birleştiğinde Ekle ligand protozoa ve bakteri kültürleri yüzey membranları ve hücre duvarlarının bağlanarak test etmek için Biz daha önce faj ekran kütüphaneleri (New England Biolabs A.Ş., Ipswich, MA) (mevcut http://www.neb.com/nebecomm/ManualFiles/manualE8110.pdf protokolleri) protozoa bağlamak 19 heptapeptide dizileri tanımlamak için kullanılır. Trypanosoma brucei membran bilinen varsayılan glikoproteinler benzerlikler gösteren bir peptid dizisi (ALNLTLH) ligandı sentezlenmiş ve C-terminal floresan prob (EDANS, 5 akuple - ((2 aminoetil) amino) naftalin-1-sülfonik EDANS NovaTag reçine (EMD Biosciences) kullanarak katı hal peptid sentezi (SSPS) ile asit, λmax = 341 nm, λem = 471 nm). Burada termit protozoa, ancak serbest yaşayan bakteriler için değil bağırsak ve izole olduğunu protozoa ligand bağlar olduğunu göstermektedir. <ol><li> Kültür Exp açıklandığı gibi protozoa. 1. 12 saat boyunca% 10 formaldehit, 4 ° C ile protozoa Fix </li><li> Protozoa çözüm Santrifüj (30 xg, 10 dk), süpernatantı atmak ve sabit iki kez 1ml Träger U medya protozoa içeren pelet yıkayın. Pelet 1 ml Träger U medyada yeniden askıya. Ayrıca, protozoa diğer düzeltmek, ve E. kontrolleri için coli bakterisinin. </li><li> 50 mcM son bir konsantrasyonda floresan boya EDANS (suda hazırlanmış) sentezlenen ligand çözümü ile 1-2 saat süreyle sabit mikroorganizmaların inkübe edin. Ligand Träger U medya suda daha iyi çözünür. </li><li> Absorbans 341 nm&#39;de maksimum ve 471 nm dalga boyunda mavi bölgede bir emisyon 400 X büyütmede bir floresan mikroskop altında mikroorganizmaların uyun. </li></ol> Deney 3: Test in vitro parçalayıcı bir peptid (protozoa kültürü) ligand protozoacidal faaliyet LSU Protein Tesisleri&#39;nde bir konjuge ligand ve parçalayıcı peptid Hekate (Mutwiri ve ark 2000), daha önce sentezlenmiştir. <ol><li> Silanize malzemeleri ve anaerobik bir torpido gözü termit gut protozoa kültürü hazırlamakExp nitelendirdi. 1. </li><li> Aerobe kontrolü mikroorganizmalar (örneğin, E. coli ve serbest yaşayan protozoa türlerinin T. pyriformis) kültürleri hazırlayın. </li><li> Torpido gözü, 0.5 ml Eppendorf tüpleri içine protozoa kültürü 198 ul pipet 6 alikotları anaerobik ortamda. Termit gut protozoa kültürü alikotları yarısı (son konsantrasyonu 1 mcM) ligand litik peptid 100 mcM çözüm 2 ul ekleyin. Alikotları diğer yarısı (kontrol) 2 ul su ekleyin. </li><li> Benchtop, E. benzer alikotları hazırlamak coli ve T. 1 mcM litik peptid, ligand-litik peptid ya da su ile pyriformis. </li><li> 1 saat sonra, slaytlar 10 ul protozoa her kültür transferi. 200 X büyütmede bir mikroskop altında kontrol protozoa tedavi edilen hayatta kalma karşılaştırın. </li><li> 1 saat sonra, yaklaşık 100 ul plaka. E. 10 -4 dilüsyon ° C gecede 37 BHI ve inkübe coli kültürleri. Plakalar üzerinde koloni oluşturan birimlerin numaralarını karşılaştırın. </li></ol> Deney 4: termit hindgut içine bir floresan boya birleştiğinde ligand Enjeksiyon <ol><li> 20-30 mikron bir ucu boyutu elde etmek için bir çift kademeli ısı seviyesi (65 ve 48) ile bir Narishige PC-10 cam mikropipet çektirmenin kullanarak iğneler (Model GD-1, 1 X 900 mm) çekin. Mikrometre kullanılarak mikroskop altında ölçüm ucu boyutu onaylayın. </li><li> Ca bir iğne doldurun. Floresan işaretli ligand 50 mcM 30 ul bağlı bir şırınga yardımıyla su askıya aldı. Kontrolü için başka bir iğne su ile doldurun. Tutucu bir micromanipulator mikropipet (0.5 ul kapasitesi ve 32 mm uzunluğunda, Drummond Bilimsel Şirketi) takın. , Ikinci bir mikromanipülatör enjeksiyon sistemi tutucu bir iğne takın. Yaklaşık 1 s darbe uzunluğunda ve 10-12 psi enjeksiyon için ilk enjeksiyon parametrelerini ayarlayın. Mikropipet yavaş yavaş iğne Advance, sabit bir ses tekrarlanabilir enjekte olmasını sağlar kontrollü bir nitrojen gazı akışı, bir darbe uzunluğu kontrolü ile çözüm odaklı bir pedal yüksek hızlı elektronik enjeksiyon sistemi ile enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra, mikropipet çıkarın ve Vernier&#39;dan kaliper kullanılarak enjekte çözüm uzunluğu kaydedin. Mikropipet bilinen parametreleri enjekte edilen hacim hesaplayın. Azot gazı basıncı ve nabız uzunluğu, tek bir enjeksiyon 0.3 ul çözüm sınırdışı ayarlayın. </li><li> Rektum herhangi bir dışkı hediye kaldırmak için, yumuşak forseps bir termit işçi karın sonuna sıkın. 5 dakika boyunca buz üzerinde tüyler ürpertici işçi termit hareketsiz. </li><li> Bir neşter bıçak kullanarak 100 ul pipet uçları keserek termit işçi tutmak için alıcıları olun. Cut ucu uzunluğu 10 - 12 mm ve termit büyüklüğüne göre kullanmak. </li><li> Mikromanipülatör alıcı takın. Petri kabı, sırt tarafında bir işçi yerleştirin ve bir azot emme pompası kullanarak Receiver&#39;e ilk işçi baş aspire böylece alıcı işçi çıkıntı terminus. </li><li> Holding alıcı termit, işçi anüs içine eklemek için mikromanipülatör kullanarak dolu iğne dikkatli bir şekilde ilerlemek. Ul çözüm 0.3 (kontroller için floresan işaretli ligand veya su) enjekte edilir. </li><li> Nemli filtre kağıdı ile ayrı petri kaplarına ligand veya su enjekte işçilerin 26 koyun ve onları tutmak ± 2 ° C ile% 78 RH </li><li> Enjekte termitler cesaret toplamak ve kökünü kaziyacak Exp yukarıda gösterildiği gibi, 24 saat sonra protozoa. 1. Düzeltme ve gözlemlemek gibi Exp gösterilen protozoa. 2. </li></ol> Deney 5: Test in vivo parçalayıcı bir peptid (termit hindgut içine enjeksiyon) ligand protozoacidal faaliyet <ol><li> Uzm açıklandığı gibi malzemeler Silanize. 1. </li><li> Su ligand litik peptid 500 mcM çözüm hazırlayın. </li><li> Cam iğneler, alıcıları ve termit işçileri hazırlamak için adımları 3.1) 3.4) üzerinden izleyin. </li><li> 3.5 &#39;te açıklanan yöntemleri) ligand-litik peptid çözümü (tedavi) veya su (kontrol) 0.3 ul 20 termit işçilerin hindgut içine enjekte ardından. </li><li> 24 saat için birkaç işçi termitler, kökünü kaziyacak cesaret tutun ve 3.6 &#39;da açıklandığı gibi) mikroskop altında bağırsak içeriği gözlemlemek. ve 3.7). </li><li> Termit gut protozoa bir ölüm onaylandıktan kısa sürede, nemli filtre kağıdı ile Petri kutularına kalan tedavi termitler ve kontroller tutmak ve günlük mortalite gözlemlemek. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Deney 1: Genellikle, foregut, midgut ve hindgut prosedürü doğru bir şekilde takip etmektedir (Şekil 1a) tek parça olarak elde edilir. Hindgut anaerobik porsiyonlar halinde yüksek yoğunluklu yaşayan tek hücreli canlılar ve forseps (Şekil 1b 1 ve 2) hindgut piercing açığa çıkabilir. En büyük protoFormosan yeraltı termit bağırsak Zoa türler iğ şeklinde P. grassii, 200-300 mikron uzunluğunda ve 150 mm genişliğinde ve çıplak gözle görülebilir. Ikinci büyük türler armut biçimli H. hartmanni (50-140 mikron uzunluğunda ve 30-80 mikron geniş). Küçük türlerin koni şeklinde S. leidyi (15-50 mikron uzunluğunda ve 8-30 mikron genişliğinde, Lai ve ark, 1983) . Protozoa türleri Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Optimal kültür koşullar altında Formosan yeraltı termitler bağırsak izole protozoa üç tür anaerobik Träger U medya (Şekil 3a) en az 72 saat süreyle canlı ve sağlıklı kalacaktır. Ancak, kültür koşullarının uygun değilse protozoa hızlı ölecektir. Medya oksijen kalıntı varsa, protozoa hareketi hemen sona erecektir. Ozmotik basıncı çok yüksek protozoa olacak çıkıntı ve hücrelerin rüptürü (Şekil 3b) yüzey membran bütünlüğünü tehlikeye veya membran. Osmotik basıncı çok düşük veya tehlikeye membranlar ise, protozoa (Şekil 3c) büzüşmeli ve küçülecektir. Deney 2: Biz ligand saptanabilir yoğunluklarda Formosan yeraltı termitler hindgut gelen protozoa üç tür bağlı bir floresan prob akuple doğruladı. Ligand bağlanması, tüm hücre yüzeyinde (Şekil 4) oluşur. Cilt siteleri axostyle (mikrotübül bir levha) ve P. içinde çekirdeği üzerinde protozoa ön bölgede yoğunlaşmıştır. grassii. Biz protozoa yutulur ahşap parçacıkların bazı yamalı otofloresans gözlemledi. Ancak yüzey axostyle ve çekirdeği (Şekil 4) hiçbir otofloresans olmadığından, otoflöresans, genellikle belirli bağlayıcı ligand ayırt etmek kolaydır. Ayrıca ligand protozoa için genel yapıları bağlar önerir test edilen tüm serbest yaşayan aerobik protozoa türleri (Şekil 5), floresan algıladı. Ancak, ligand bağlanması E. gözlendi coli. Deney 3: Bir mcM ligand litik peptid Formosan yeraltı termit işçilerin bağırsak ve serbest yaşayan T. protozoa üç tür öldürdü 10 dakika daha az in vitro pyriformis kontrolleri hayatta kalırken . Şekil 6 ligand-litik peptid ile tedavi protozoa termit gut membran bütünlüğünün ilerici kaybı gösterir. Membranlar çıkıntı ve rüptürü, protozoa büzüşmeli ve ölürler. E. sayı fark yok gözlendi ligand-litik peptid ve su tedaviler arasında coli kolonileri. Ancak, hiçbir ligand Parçalayıcı peptid E. sayısını azalttı oldukça coli kolonileri (Şekil 7). Bu, bir dereceye kadar ligand bu eki lizis olmayan hedef mikroorganizmaların korur göstermektedir. Deney 4: floresan işaretli ligand 0.3 ul 50 mcM termit işçilerin hindgut enjekte edildi P. bağlanarak grassii, S. leidyi ve H. hartmanni Uzm benzer floresan mikroskopi ile teyit edilmiştir. 2 (Şekil 4). Termit bağırsak dokusu floresan göstermemiştir. Deney 5: 0.3 ul 500 mcM ligand-litik peptid enjeksiyon Formosan yeraltı termitler bağırsak protozoa 24 saat içinde üç tür öldürdü. Termitler, simbiyotik protozoa kaybı sonra 10 gün içinde öldü. Daha önce, Husseneder ve Collier (2009), litik peptid aynı konsantrasyonu termit cesaret içine enjekte edilir. Bağırsak (72 saat) tek hücreli canlılar ve termitler (altı hafta) ölmüş kadar ekli ligand olmadan, daha fazla zaman aldı. Bu ligand litik peptidler, protozoa parçalayıcı peptidler bağlanarak büyük olasılıkla protozoacidal verimliliği artırdığını göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. : bağırsak ana bölümden (ön, orta, hindgut) gösteren bir slayt Formosan yeraltı termit gut, b 1 ve 2: Hindgut protozoa içeren bağırsak içeriği çıkarmak için forseps ile deldi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Formosan yeraltı termit hindgut bulundu protozoa flagellate üç türleri: a) Pseudotrichonympha grassii, b) Holomastigotoides hartmanni, ve c) Spirotrichonympha leidyi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. A) Sağlıklı kültür protozoa, b), şişkin membranlara Protozoa, c) protozoa protozoa azalıyordu. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Ligand bağlama Onay gut termitlerin bir floresan bir prob ile birleştiğindefloresan işaretli ligand ve tedavi edilmezse denetimleri (otofloresans gösteren) ile tedavi: (P. grassii, H. hartmanni, S. Leydi yukarıdan aşağıya doğru) protozoa. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Ligand bağlayıcı ve serbest yaşayan aerobik, a) Tetrahymena, b) amip, c) Euglena protozoa ve d) Paramecium . <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. A) su (kontrol) ve b) 1 mcM ligand-litik peptid protozoa tedavisi. <img src="/files/ftp_upload/2190/2190fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7 E. plakalar üzerinde coli kolonileri (10 -4 dilüsyon):)) su (kontrol), b Tedavi 1 mcM ligand litik peptid, c ile Tedavi) 1 mcM parçalayıcı peptid ile Tedavi.

<ol>
	<li>Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+lytic+peptides+and+LHRH+or+&#946;CG+target+and+cause+necrosis+of+prostate+cancers+and+metastases.">Conjugates of lytic peptides and LHRH or &#946;CG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).</li><li>Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paratransgenesis+for+termite+control.">Paratransgenesis for termite control.</a> Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+genetically+engineered+bacteria+(Escherichia+coli)+to+monitor+ingestion,+loss+and+transfer+of+bacteria+in+termites.">Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites.</a> Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).</li><li>Husseneder, C., Grace, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+termite+gut+bacteria+deliver+and+spread+foreign+genes+in+termite+colonies.">Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).</li><li>Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+antimicrobial+peptides+with+low+mammalian+cell+toxicity.">De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity.</a> J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).</li><li>Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+and+distribution+of+the+three+species+of+symbiotic+protozoa+in+the+hindgut+of+Coptotermes+formosanus+(Isoptera).">Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera).</a> Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).</li><li>Leuschner, C., Hansel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+disrupting+lytic+peptides+for+cancer+treatments.">Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments.</a> Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).</li><li>Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+Antimicrobial+Peptide,+d-Hecate,+on+Trichomonads.">Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads.</a> J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).</li><li>Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+a+cellulose-digesting+flagellate,+Trichomonas+termopsidis,+and+of+certain+other+termite+protozoa.">The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa.</a> Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).</li></ol>

(Hansel ve Leuschner 2004, Hansel ve ark 2007) kanser hücrelerinin etkin bir şekilde hedef ve yok etmek için ligand-litik peptidler başarıyla kullanılmaktadır. Bu kavram üzerine kuruludur, biz yüzeyine bağlanan heptapeptide ligand geliştirdi Formosan yeraltı termitler bağırsak protozoa ve bu, termit ulaşmak için, termitler, bağırsak bu zorunlu selüloz sindiren symbionts yok etmek amacı ile bir litik peptide birleştiğinde kontrol (Husseneder ve Collier 2009). Bi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>SL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDANS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novabiochem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anaerobic glove box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coy Laboratories, Inc.</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intellus environmental controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Percival</td>
<td>I36NL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PC-10 Glass micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>PC-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Scientific Instrument Lab</td>
<td>GD-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leitz micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vermont Optechs, Inc.</td>
<td>ACS01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research, Inc.</td>
<td>MINJ-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcaps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>1-000-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA fluorescence imaging system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMRxA2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LEICA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMLB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus dissecting scope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ61</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

testing protozoacidal activity of ligand-lytic peptides against termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into termite hindgut)

Biz kimyasal pestisit kullanımı konusunda daha az güven yol açacak yeraltı termit kontrol etmek için yeni bir yaklaşım geliştirmektedir. Yeraltı termitler, ahşap sindirmek için verimli işçi hindguts protozoa bağlıdır. Parçalayıcı peptidler, protozoa parazitleri (Mutwiri ve ark 2000) çeşitli öldürmek için gösterilen ve aynı zamanda Formosan yeraltı termit, Coptotermes formosanus (Husseneder ve Collier 2009) bağırsak protozoa olmuştur . Parçalayıcı peptidler ökaryotlar nonspesifik bağışıklık sisteminin bir parçasıdır ve mikroorganizmalar (Leuschner ve Hansel 2004) membranlar yok. En litik peptidler, onlar daha yüksek ökaryotlar (Javadpour ve ark 1996), elektriksel olarak nötr kolesterol içeren hücre zarlarının etkilemez çünkü daha yüksek ökaryotlar zarar vermek olası değildir. Parçalayıcı peptid eylem ek bir ligand tarafından belirli bir hücre tipleri için hedef olabilir. Örneğin, Hansel ve ark (2007), tek başına veya non-spesifik peptitler ile konjuge litik peptidler etkili olurken, kanser hücre zarı reseptörü ligandlar ile konjuge litik peptidler, meme kanseri hücrelerini yok etmek için kullanılan olabilir olduğunu bildirdi. Parçalayıcı peptidler de, prostat ve testis kanseri hücreleri (Leuschner ve Hansel 2004) hedeflenen yıkımı için tümör hücrelerinin reseptörlerine bağlanır hormonları konjuge edilmiştir. Bu yazıda, bağırsak Formosan yeraltı termit protozoa yüzey membran bağlanır heptapeptide ligand birleştiğinde bir litik peptid (Hekate) protozoacidal faaliyet göstermek için kullanılan teknikler mevcut. Bu teknikler ekstirpasyonu termit işçilerden gut, gut anaerobik kültür (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, protozoa Spirotrichonympha leidyi), mikroskobik onay ligand floresan boya ile işaretlenmiş, tek hücreli canlılar ve değil, bakteri ya da bağırsak dokusu protozoa serbest yaşayan diğer termit gut bağlanır. Ayrıca parçalayıcı bir peptide aynı ligand verimli,, in vitro (protozoa kültürü) ve in vivo (işçi hindgut içine mikroenjeksiyon) protozoa termit gut öldürür, ama yalnız litik peptid daha az bacteriacidal olduğunu göstermektedir . , En az iki hafta içinde termitler ölümü protozoa yol açar kaybı. Gelecekte, termit gut protozoa öldürmek ve daha sonra koloninin termitler öldürecekti ligand litik peptidler ifade etmek için &quot;Truva Atları&quot; gibi bir termit kolonisi ile termit hindgut ve yayılması hayatta mikroorganizmaların genetik mühendisi olacak . Ligand-litik peptidler protozoa parazitlere karşı ilaç geliştirme için de yararlı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Ligandlar protozoa Formosan litik peptitler ile birleştiğinde floresan mikroskopi ve bu ligandlar kullanılarak yeraltı termitler bağırsak protozoa öldürmek selüloz sindiren bu yüzey membran bağlamak gösteren prosedürleri mevcut<em&gt; In vitro</em&gt; (Anaerobik protozoa kültürü) ve<em&gt; In vivo</em&gt; (Termit hindgut içine enjeksiyon).

Protozoa Termit Gut Karşı Ligandla litik Peptitler Protozoacidal Aktivitesi Test In vitro (Protozoa Kültür) ve In vivo (Mikroenjeksiyon içine Termit Hindgut)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

testing-protozoacidal-activity-ligand-lytic-peptides-against-termite

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

14.8K Görüntüleme.  Louisiana State University Agricultural Center. Ligandlar protozoa Formosan litik peptitler ile birleştiğinde floresan mikroskopi ve bu ligandlar kullanılarak yeraltı termitler bağırsak protozoa öldürmek selüloz sindiren bu yüzey membran bağlamak gösteren prosedürleri mevcut In vitro (Anaerobik protozoa kültürü) ve In vivo (Termit hindgut içine enjeksiyon).

Video: Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and species-rich microbial population that assists in the degradation of lignocellulose predominantly into acetate, the key nutrient fueling termite metabolism (Odelson &amp; Breznak, 1983).  Within these microbial populations are bacteria, methanogenic archaea and, in some ("lower") termites, eukaryotic protozoa. Thus, termites are excellent research subjects for studying the interactions among microbial species and the numerous biochemical functions they perform to the benefit of their host.  The species composition of microbial populations in termite guts as well as key genes involved in various biochemical processes has been explored using molecular techniques (Kudo et al., 1998; Schmit-Wagner et al., 2003; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment.  The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Mor  et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi &amp; Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite Zootermopsis Angusticollis and Visualizing Gut Microbes

This video illustrates the technique for extracting DNA from the species of microbes resident in the termite hindgut. The preparation of a wet mount slide, which is useful for visualizing the gut microbial community is also illustrated, and a tour through the species-rich gut environment is given.

Termit Gut Mikroplar (Zootermopsis Angusticollis) DNA ayıklanıyor ve Gut Mikroplar görselleştirme

Termites are among the few animals known to have the capacity to subsist solely by consuming wood.  The termite gut tract contains a dense and ...

Biyoloji

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Röportaj - Termit Hindgut Mikrobiyal Topluluk incelenmesi

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Layers of Symbiosis - Visualizing the Termite Hindgut Microbial Community

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth.  Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different species found nowhere else on Earth. Jared reveals that the symbiosis exhibited by this system is multi-layered and involves not only a relationship between the termite and its gut inhabitants, but also involves a complex web of symbiosis among the gut microbes themselves.

Symbiosis Katmanları - Termit Hindgut Mikrobiyal Topluluk görselleştirme

Jared Leadbetter takes us for a nature walk through the diversity of life resident in the termite hindgut - a microenvironment containing 250 different ...

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Mikroenjeksiyon kullanarak Yaprak bitleri Viral İletim Fizyolojik Engelleri Test

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Diseksiyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Sinir Crest için<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantasyon Kültür veya<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasyon

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...