Bu araştırma tarafından desteklenen Hibeler Genç Bilim Keşif Araştırma (A) (16.680.015), Grant-in-Aid (16.653.065), Bilimsel Araştırma Öncelikli Alanlar için Grant-in-Aid (18.023.022,-Aid # Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Japonya, Hibe Yardım Biyomedikal Yenilik Ulusal Enstitüsü (NIBIO), Sağlık Bilimleri Temel Araştırmalar Teşvik Grant-18.016.012 # 18.053.015) Nöroinformatik Japonya Merkezi (NIJC), RIKEN yardım

<ol><li> Açık / koyu geçiş testi için kullanılan aparat, bir kapısı olan bir bölüm (Ohara &amp; Co, Tokyo) tarafından eşit büyüklükte iki bölüme ayrılır bir kafes (21x42x25 cm) oluşuyordu. </li><li> Fareler, yiyecek ve su ad libitum erişim ile 12 saat ışık / karanlık döngüsü (7:00 PM ışıklar) ile bir odaya kafes ortalama 3-4 ev sahipliği yapmaktadır. İdeal olarak, iki kontrol ve iki mutant fareler sütten zaman genotip olarak en kısa sürede yeniden organize ederek, birlikte ev sahipliği yapmaktadır. Davranışsal test 9:00 arasında yapılan ve ilk deneme başlamadan önce, farelerin içeren tüm kafesleri davranış test odası 30 dakika transfer PM 06:00. </li><li> Bir odasının diğer odasının karanlık (2 lux) ise parlak, beyaz diyotlar (390 lüks) tarafından aydınlatılır. Fareler karanlık tarafına yerleştirilir ve fare kızılötesi kamera tarafından tespit edildiğinde otomatik olarak 3 saniye sonra kapı açıldı. Kapı farelerin ışık odasına girmek için gecikme kaygı gibi davranış bir göstergesi olarak hizmet edebilir, deneyci kaçmak için motivasyon yayımlanmasından sonra hemen ışık odasına girmeyin bu kadar kullanılır. </li><li> Fare 10 dakika süreyle açık kapı ile iki odadan arasında serbestçe hareket etmesine izin verilir. (Görüntü LD4) davranışsal veri edinme ve analiz için kullanılan uygulama, kamu malı Görüntü J programı (Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü byWayne Rasband gelişmiş ve http://rsb.info.nih.gov/ij mevcut dayanmaktadır /), Tsuyoshi Miyakawa (O&#39;Hara &amp; Co, Tokyo, Japonya üzerinden kullanılabilir) tarafından güncellenmiştir. </li><li> Mesafe, her kamarada yolculuk geçişleri toplam sayısı, her odasında geçirdi ve Görüntü LD4 programı tarafından kaydedilen hafif chamberare girmek için gecikme. </li><li> Her bir yargılama sonucunda, tüm odaları koku alma ipuçları dayalı bir önyargı önlemek için süper hipokloröz su ile temizlenir. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Tüm işlemler, Kyoto Üniversitesi Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi tarafından kabul edildi. Tsuyoshi Miyakawa KUŞ, Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı, Saitama, Japonya ile ilişkilidir.

Tüm fare genomu dizilerinin belirlenecek olmasına rağmen, bu genlerin çoğunun fonksiyonları bilinmemektedir. Gen hedefleme teknikleri, ancak, belirli bir genin, farelerde (; Austin ve ark, 2004. Aiba ve ark, 2007) silebilir veya işlemek için kullanılan olabilir. Verilen bir genin belirli bir davranışı üzerinde etkisi daha sonra mutant fareler davranışsal analizler yaparak (Takao ve ark, 2007 Takao ve Miyakawa, 2006) tespit edilebilir. Mutant farelerde davranış fenotipleme için bir test olarak, açık / koyu geçiş testi farelerde davranış (Crawley, 2000) gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Test aydınlatılmıştır alanlarda farelerin doğal kaçınma ve roman ortamlarda kendiliğinden keşif davranışı (Crawley, 1985) dayanır. Test anksiyolitik ilaç tedavisi (Crawley, 1985) duyarlıdır. Cihaz karanlık bir oda ve aydınlık odasına oluşur. Kısıtlı açılması, 3 cm yüksekliğinde ve 5 cm genişliğinde, iki odadan bağlanır. Fareler iki odaları arasında serbestçe hareket etmesine izin verilir. Parlak odasına giriş sayısı ve süresini parlak alan farelerde anksiyete göstergeleri olarak kullanılmaktadır geçirdi. Açık / koyu geçiş testi başlangıçta Crawley ve arkadaşları (Crawley ve Goodwin, 1980) tarafından geliştirilmiştir. Orijinal versiyonu ve test arasında iki fark vardır. Birincisi, iki odaların büyüklüğü test sürümü aynı ise hafif odası, orijinal versiyonu karanlık oda daha büyüktür. İkinci olarak, orijinal versiyonu, ışık odasının tavanı yoktu ve biz ışık odasının tavan ve duvar için opak beyaz plastik kullanımı sırasında ışık odasının duvarları, saydam olan (Crawley ve Goodwin, 1980). Yani Bu farklılıklar, ışık odanın büyüklüğü ve açıklık, aynı anda parlak uzay anksiyete tespiti yanı sıra, testin orijinal versiyonunda, açık alan anksiyete için izin verir. Laboratuvarımızda, ancak, açık alan farelerde davranış gibi anksiyete, yükseltilmiş artı labirentte test edilir. Opak duvarlar ve tavan, ışık odanın büyüklüğü ve bizim özel ışık / karanlık geçiş test protokolü, orijinal sürümüne göre parlak boşluk anksiyete tespit daha uzmanlaşmıştır. Açık / koyu geçiş testi ve yükseltilmiş artı labirent anksiyete gibi davranış değerlendirmek için kullanılır olmasına rağmen, sonuçlar her zaman tutarlı değildir. Örneğin, ışık açık / koyu geçiş test odasında önbeyin özel kalsinörin knockout farelerde azalma miktarı bir zaman harcamak, ancak yükseltilmiş artı labirent kolları açık bir artış miktarı (Miyakawa ve ark, 2003) . Biz, bizim açık / koyu geçiş testi ve yükseltilmiş artı labirent testleri gibi parlak boşluk anksiyete ve açık alan, kaygı gibi davranış olarak kaygı gibi davranış farklı yönlerini değerlendirmek varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, biz büyük bir veri her iki testte de aynı fareler kullanılarak toplanan ayarlayın. Laboratuvarımızda, gen davranış önemi için ekran için birçok etki alanı kapsayan davranış testi pilleri yürütürler. Birkaç hafta test bataryası tamamlamak için gereklidir. Test dönemi boyunca, fare kafesleri tesisimiz bir raf üzerinde tutulur. Farelerin diğer kurumlarda laboratuvar varsa, bunlar bizim tesisin çevreye en az 1 hafta alışmış. Alışma döneminden sonra, farelerin genel bir sağlık kontrolü ve tarama nörolojik (Miyakawa ve ark, 2003) tabi tutulur, ve bu basit incelemelerin ardından, fareleri açık / koyu geçiş testine tabi tutulur. Filmde gösterildiği gibi, test, deney odasına alışma 30 dakika sonra bir ses geçirmez deney odasında yapılır. Biz 60&#39;tan fazla filmin gösterildiği protokolünü kullanarak genetiği mutant farelerin suşları değerlendirilmeli ve 3000&#39;den fazla fareler (yabani tip ve mutant fareler de dahil olmak üzere) için ham veriler büyük bir set var. Biz büyük ham veri seti yararlanmak için faktör analizleri gerçekleştirilmiştir. Aslında indeksleri (yayınlanmamış veri) arasında bazı anlamlı korelasyon olmasına rağmen, biz, her bir test (yayınlanmamış veri) farklı faktörleri tespit .. Bu veriler şu anda inşa ediyoruz halka açık bir veritabanı bir parçası olarak ilan edilecektir. Test bataryası, yabani tip littermates genellikle kontrol olarak kullanılır. Bir arka plan gerginlik olarak, C57BL/6J farelerin yaygın olarak kullanılmaktadır. Biz C57BL/6J farelerde test bataryası mutant farelerin kontrol olarak kullanılan veri topladı. Aşağıdaki gibi açık / koyu geçiş testi C57BL/6J fareler elde endeksleri (n = 795, ortalama SEM); katedilen mesafe: 846,5 8.88 cm ışık odasında, karanlık odasında 1478,5 9.53 cm; zaman süresi geçirdim : ışık 215,8 1.85 s, karanlıkta 395,8 1.86; bölmeleri arasındaki geçişlerin sayısı: 30.52 0.43; ışık odasına girmek için gecikme: 64.94 2.40 s Odalarına girişlerinde çevresinde farelerin Hareketi kamera tarafından tespit edilir ve c hem harcanan zaman olarak sayılırhambers. Bu nedenle, zaman süresi ortalama toplam harcanan ışık ve karanlık bölümlerinde testi (600 s) tüm süresi daha fazlaydı. Protokolde, bir fare ilk karanlık odasında yerleştirilir. Üç saniye karanlık odasında fare yerleştirdikten sonra, odaları arasında kapı otomatik olarak açılır ve iki odadan fare arasında serbestçe hareket edebilir. 215,8 1.85 s, karanlıkta harcanan zaman süresi: 316,3 2.11 s [zaman karanlıkta harcanan C57BL/6J fareler (p &lt;0.0001, süresi ışık harcanan ışık odasında karanlık odasında daha az zaman harcamak ilk kez], n = 795, eşleştirilmiş t testi) ilk kez ışık odasına girmeden önce karanlık harcanan dahil değildir. Bu C57BL/6J farelerin ışık odasına önlemek eğilimi gösterir ve ışık için harcanan zaman, kaygı gibi davranış iyi bir dizin olduğunu. Tüm verileri aynı protokolü kullanılarak elde edilir, çünkü mutant farelerde çeşitli suşları elde edilen sonuçları kolayca karşılaştırılır. Mutant farelerin kolayca çoğaltılabilir ve diğer mutantların verileri ile mukayese edilebilir bir suşu fenotipleme sonuçları elde etmek için, davranışsal test yöntemleri laboratuarlar arasında mümkün olduğunca aynı olmalıdır. Crabbe ve arkadaşları arasındaki etkileşim fare davranış ve tam olarak aynı kendilenmiş suşları ve bir boş mutant suşu kullanarak laboratuvar ortamında test edilmiştir. Yaptıkları çalışmada, cihaz, test protokolleri ve birçok çevresel değişkenler titizlikle standardize edilmiştir. Aynı zamanda tüm davranışları (Crabbe ve ark, 1999) deformasyon farklılıkları tespit rağmen standardizasyon rağmen, laboratuvarlar boyunca davranış sistematik farklılıklar bulundu. Onlar mutantlar karakterize kontrol edilemeyen değişkenler ve deneyler belirli bir laboratuar kendine özgü sonuçlar doğurabilir bildirdi. Laboratuarlar arasında mevcut usul farklılıkları zor laboratuvarlar arasında sonuçları karşılaştırmak ya da çoğaltmak olun. Burada, protokolün ayrıntıları ortaya böylece bir film olarak açık / koyu geçiş testi için bizim protokol mevcut. Protokol görsel belgeler oluşturulması, laboratuvarlar boyunca ve mutant farelerde çeşitli suşları davranış fenotipleri karşılaştırmalar için kullanılan protokollerin standartlaştırılması için izin deneysel prosedürlerin ayrıntıları daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak, bu test ile değerlendirildi. Filmler, biz bizim davranışsal test bataryası kullandığımız yükseltilmiş artı labirent, açık alan testi, porsolt zorla yüzmeye testi, korku klima, gibi diğer protokolleri, henüz gelecek video dergi makaleleri gibi yayın yapılıyor.

light/dark transition test for mice

Tüm fare genomu dizilerinin tespit edilmiştir rağmen, henüz bu genlerin çoğunun fonksiyonları bilmiyorum. Gen hedefleme teknikleri, ancak, belirli bir genin, farelerde silmek veya işlemek için kullanılan olabilir. Mutant farelerde davranış analizleri yapılarak belirli bir davranışın belirli bir genin etkisi tespit edilebilir. Mutant farelerde davranış fenotipleme için bir test olarak, açık / koyu geçiş testi farelerde davranış gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Test aydınlatılmıştır alanlarda farelerin doğal kaçınma ve roman ortamlarda kendiliğinden keşif davranışı üzerinde dayanır. Test anksiyolitik ilaç tedavisine duyarlıdır. Cihaz karanlık bir oda ve aydınlık odasına oluşur. Fareler iki odaları arasında serbestçe hareket etmesine izin verilir. Parlak odasına giriş sayısı ve süresini parlak alan farelerde anksiyete endeksleri vardır geçirdi. Mutant farelerin kolayca çoğaltılabilir ve diğer mutantların ile mukayese edilebilir bir suşu fenotipleme sonuçları elde etmek için, davranışsal test yöntemleri laboratuarlar arasında mümkün olduğunca aynı olmalıdır. Laboratuarlar arasında mevcut usul farklılıkları Ancak, zor laboratuvarlar arasında sonuçları karşılaştırmak ya da çoğaltmak olun. Burada, protokolün ayrıntıları ortaya böylece bir film olarak açık / koyu geçiş testi için bizim protokol mevcut. Laboratuvarımızda, 60&#39;dan fazla filmin gösterildiği protokolünü kullanarak mutant farelerin suşları değerlendirilmiştir. Bu veriler şu anda inşa kamu veritabanı bir parçası olarak ilan edilecektir. Protokolün Görselleştirme, laboratuarlar ve mutant farelerde çeşitli suşları davranış fenotipleri karşılaştırmalar genelinde kullanılan protokoller standardizasyonu sağlayarak, tüm deneysel işlemin ayrıntılarını anlaşılmasını kolaylaştırmak, bu test ile değerlendirildi.

Watch this Scientific Journal Video about Light/dark Transition Test for Mice at JoVE.com

Light/dark Transition Test for Mice

Açık / koyu geçiş testi farelerde davranış gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Burada, test yapmak konusunda ayrıntılı yordamlar gösteren bir film sunuyoruz.

Fareler için açık / koyu Geçiş Testi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

51.7K Görüntüleme.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. Açık / koyu geçiş testi farelerde davranış gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Burada, test yapmak konusunda ayrıntılı yordamlar gösteren bir film sunuyoruz.

Video: Light/dark Transition Test for Mice

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Fareler için Yükseltilmiş Artı Labirent

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Biyoloji

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Parkinson Hastalığı için murin Model: 6-OH Dopamin Lezyon Davranış Testi

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.