Bu çalışma Biyomedikal Bilim Disiplin gelen Avustralya Araştırma Konseyi (ARC DP0988227) ve Biyomedikal Bilim Araştırma Girişimi Grant, Sydney Üniversitesi tarafından desteklenmektedir. Ekipman Patch Kelepçe Amplifikatör EPC 8 Biyomedikal Bilim, Sydney Üniversitesi Disiplin gelen Başlangıç ​​Fonu tarafından finanse edildi. Ekipman InstruTECH LIH 8 +8 Veri Toplama Sistemi Rebecca L. Cooper Vakfı ve Biyomedikal Bilim, Sydney Üniversitesi Disiplin gelen Başlangıç ​​Fonu&#39;ndan para ile satın alındı. Biz onların anlayışlı öneriler ve yorumlar için anonim teşekkür etmek istiyorum.

1. Genel Kurma ve Doku Hazırlama <ol><li> 30 dakika (kendi stres düzeyini azaltmak amacı) için karanlıkta fare tutun. Beklerken, hücre dışı çözelti 1 L hazırlar. Üretim Milli-Q su içinde yarım litre sodyum bikarbonat ve 1.9 g çözülür. PH değeri% 95 O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklar ile 7.4 &#39;de muhafaza edilmektedir. Beş dakika sonra, Milli-Q su ile 1 L&#39;ye kadar iyi, sodyum bikarbonat çözeltisine ilave edildi, Milli-Q su içinde, 100 ml Ames Orta 8.8 g çözülür ve iyice karıştırın. Deney geri kalanı için carboxygenated bu çözüm tutun. </li><li> Carboxygenated Ames Orta 250 ml alın ve elektrofizyolojik olarak sıvı reperfüzyon sistem set-up kurmak. Çözüm carboxygenated tutun. </li><li> Düzgün smear perfüzyon odasının alt üzerine vakum gres ince bir tabaka. Bir kapak kayma ile Seal ve hava geçirmez olduğundan emin olun. Yağ (çapı yaklaşık 2 mm), küçük bir miktar alın ve üstüne yerleştirmek vealt odasının biter. Bu toplar yerine ızgara (platin çerçeve diş ipi ile sinirli) tutun ve retina çok sert basarak önleyecektir. Platformun üzerine odası düzeltmek ve her iki açıklıklar hizalayın. </li><li> Hayvan servikal dislokasyon ile sakrifiye sonra 2 dakika ve için İsofluranın ilk anestezi olduğunu. Hızlı bir şekilde küçük makas (eğik kanatlı) bir çift gözleri kaldırmak, carboxygenated hücre dışı sıvı ile dolu bir Petri kabındaki yerleştirin daha sonra küçük bir beher carboxygenated hücre dışı sıvı ile iyice yıkayın, ve. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, 19 gauge iğne kullanılarak kornea bir ekleme delik (kenarından ~ 2 mm) yapmak. Diğer göz için tekrarlayın. Bu önemli bir adım hem retinae bir oksijen sağlamak için hızlı olmalıdır. Kenarından paralel keserek iris makası küçük bir çift ile bir kornea çıkarın. Daha sonra, ince forseps bir çift ile iris ve lens çıkarın. Diğer göz için tekrarlayın. Içeren bir beher içine bir göz fincan transferhücre-dışı çözelti carboxygenated. </li><li> Bir neşter bıçak ile, tüm montaj düzleştirmek ve retina başına iki tam bağlar elde edebilmek için, yarım içine bir göz fincan kesti. Bir künt diseksiyon prob kullanılarak pigment epitel veya hafifçe çekerek retina dikkatle ayırın. Bir kez müstakil, retina oldukça şeffaftır. Dışbükey yüzey fotoreseptör tarafı unutmayın. Içbükey yüzeyi ile ganglion hücrelerinde tarafı ve yapışkan vitreus mizah varlığı nedeniyle kendisini yapışabilir. </li><li> Ince forseps bir çift, ora serrata için müstakil retina dokusunun yakın kenarında tutun ve ince forseps başka bir çift ile ora serrata kapmak, retinanın merkezine doğru çekin. Bu hassas bir süreçtir ve birkaç girişimleri alabilir. Eğer başarılı olursa, ora serrata, siliyer cisim ve vitreus mizah bu işlem tarafından kaldırılır ve retinanın eğrilik (yani düz) azalır. </li><li> Kesme kenarları, ve daha sonra başına aktarmakyukarı bakacak şekilde ganglion hücrelerinin ile füzyon odası. Yağ topları üzerine ızgara yerleştirerek yerinde doku tutun. Daha sonra kullanmak için diğer göz fincan kalan doku yerleştirin. Retina diseksiyon için benzer prosedürler Middleton ve Protti 16 ve Pottek ark tarif edilmiştir. 17. </li><li> Dik bir mikroskop altında kayıt odasına monte edin. 5 ml / dak - hemen 3 oranında carboxygenated ekstrasellüler çözüm (35.5 ° C) ile retina sürekli perfüzyon kurmak. Topraklama elektrot yerinde olduğundan emin olun. </li><li> Mikroskop bağlı doku görselleştirme sağlayan bir dijital fotoğraf makinesi. Tüm kurulum bir hava tablosu (darbe emme) üzerinde ve bir Faraday kafesi (blok dış statik ve statik olmayan elektrik alanları) içinde oturur. </li><li> Işık kaynağı (kızılötesi,&gt; 850 nm) ve bir 40X objektif ile açın, ganglion hücrelerinin hücre gövdeleri üzerine odağını getirmek. Recor için tüm montaj orta bölgesinde bulding. </li><li> Defrost K Dondurulmuş bir şişe + tabanlı hücre içi çözelti (300 ul, pH değeri = 7.4) ihtiva eden (mM olarak), K-glukonat: 140, HEPES asit: 10, MgCl2: 4,6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0.4 ve EGTA: 10. Tüm reaktifler, Sigma-Aldrich&#39;ten satın alınmıştır. </li></ol> 2. Retina Ganglion Hücre yama Hücre Organları <ol><li> İlk ateş borosilikat kılcal cam boru ucunda lehçe, daha sonra iki ısıtma adım (: - MQ 8 5 direnci) ile bir cam Mikroelektrod Çektirme ile çekin. </li><li> Hücre içi çözelti Lucifer sarının 3 ul (nihai konsantrasyon% 0.2) ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjlenir. Sonra, bir 30 G yeniden hipodermik iğne, sonra, 1 ml&#39;lik bir şırınga içine çözelti üstüne% 85 aktarmak için 0.22 um f ilter ünitesine bağlanır. Buzdolabında. </li><li> Tutucuya, kayıtlar için kullanılan benzer uç boyutu, cam pipet düzeltmek ve bir micromanipula kullanarak mikroskop altında harekettor. Bu iç sınırlayıcı membranı yüzeyinde küçük bir çukur edinceye kadar 40X objektif altında, yavaş yavaş pipet düşürmektedir. Bu doku küçük bir miktar yakalar kadar dikkatlice ileri pipet ilerlemek ve sonra ganglion hücrelerinin hücre gövdeleri ortaya çıkarmak için küçük bir delik gözyaşı yukarı ve / veya yana doğru hareket ettirin. Daha küçük delik, yüksek retina ağın bütünlüğü derecesi muhafaza edilmektedir. Eğer arzu edilirse, sülforhodamin 101 (SR101, 0,5-1 uM), 15 floresan mikroskobu kullanılarak hasar görmüş nöronların etiketlemek için hücre dışı ortama ilave edilebilir. </li><li> Hücre içi çözüm 10 ul - 8 ile temiz bir pipet doldurun. Amplifikatör kafası aşamasına bağlı tutucu içine yerleştirin ve klorlu gümüş klorür elektrot altında olduğundan emin olun. Eğer kir ve / veya hava kabarcıkları olan / mevcut atın. </li><li> Tüm ekipmanları açın. Biz gerilim kelepçe con tam hücreli kayıtları elde etmek için PatchMaster tarafından kontrol edilen bir EPC 8 yama kelepçe amplifikatör kullanılırfigürasyon. Hızlı modunda mevcut kelepçe kayıtları sağlayan diğer amplifikatör de kullanılabilir unutmayın. Pipet çözüm pozitif basınç uygulayın ve korumak. Oldukça bir yerinden amacrine hücre veya glial hücre daha ganglion hücre bu yüzden büyük olasılıkla büyük bir hücre gövdesi ile bir hücre seçin. Yavaşça, membran yüzeyinde küçük bir çukur yapma böylece, pipet alt durdurma ve basınç serbest bırakın. 60 mV - derhal tutma potansiyeli düşük. Bir gigaseal (GΩ) aralarında elde sonra, hafifçe bir tam hücreli yama kelepçe yapılandırma elde etmek için membran kırmak için emmek. Bu işlem çok fazla negatif basınç uygulanırsa, o zaman bağlantı sızan olur, hassas bir adımdır, çok az ise, membran bozulmadan kalır. </li><li> Zamanla, Lucifer Sarı hücrenin morfolojisi görselleştirme sağlayan, hücre dolduracaktır. Kararlı, bu kurulum 30 dakika veya daha fazla sürmelidir. </li></ol> 3. Dynami kullanarak Ganglion Hücreleri kayıtlarıc Kelepçe <ol><li> İlk olarak, bir akım-gerilim testi (gelen - 75 + 35 mV her 10 mV) PatchMaster kullanılarak yürütülür. Büyük bir Na + akımı (&gt; 1 nA) mevcut olması halinde daha sonra testlere devam edin. Bir yerinden amacrine hücre yamalı nadir olarak, bu durumda, sonraki mevcut enjeksiyon için harekete potansiyelleri trenler ile cevap unutmayın. </li><li> Açık LabVIEW ve özel yazılmış Neuroakuma programı çalıştırmak, daha sonra çeşitli iletkenlik dalga yükleyin. 8 (- 8 istatistik amacıyla 6) için tekrar sayısını ayarlayın. Sırasıyla 75 mV - 0 ve de eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri iptali potansiyelleri ayarlayın. Test için eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri birini eşleşen çifti seçin. Eksitatör iletkenlik iz (yeşil) ve inhibitör iletkenlik iz (kırmızı) alt panelinde görünür. </li><li> Geri PatchMaster git, mevcut kelepçe modunu seçin, ve hemen &#39;CC + İletişim HIZLI&#39; mevcut kelepçe moduna amplifikatör geçin. Bu mod acc sağlarurately membran potansiyeli hızlı değişiklikleri takip edin. Membran ve pipet arasında iyi bir sızdırmazlık bakımı yapılırsa, az / hiçbir tazminat gereklidir, aksi halde, kayıt uzun sürmez. Neuroakuma olarak, &quot;kayıt&quot; düğmesine basın. Hücresel yanıt (genellikle aksiyon potansiyelleri bir fazik patlama, Şekil 1A ile) üst panelinde görünür. Az / cevap görülmektedir eğer sert tepki üretir kadar, küçük artışlarla artırmak, ilk iletkenlikleri düşük ölçeklendirme ile hücre içine akım enjekte edilir. Aşırı akım enjeksiyon hücre öldürebilir. Bir kez testleri tamamlandığında, iletkenlik dalga yeni bir çift seçin fizyolojik ve yapay iletkenlikleri tüm çiftleri için yukarıdaki tekrarlayın. Gerçek zamanlı olarak enjekte fizyolojik akımları (I) dayanmaktadır: I (t) = Hariç G (t) X (V m (t) - V hata) + G inh (t) X (V m (t) - V inh) </li></ol> Iletkenlik (nS G) sy olabilirnaptic ya da yapay. Eksitatör ve inhibitör sinaptik iletkenlik dalga (TTX, 1 mcM) kontrol koşulları farklı görsel uyaranlara yanıt olarak ve tetrodotoxin varlığında Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen ve Solomon (yayınlanmamış) tarafından gerçekleştirilen önceki deneyler toplanmıştır . Yapay iletkenlik dalga bir alfa işlevi kullanılarak modellenmiştir. V m (mV), kaydedilen membran potansiyeldir. V hariç ve V inh sırasıyla eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri en ters potansiyelleri temsil ederken G hariç ve G inh sırasıyla eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri temsil eder. Zaman ms t. Örnekleme oranı 40 kHz. Ben s = I 0 (t / α) E-Ht olarak Yukarıdaki denklem bir alfa fonksiyonu (, akımın zirvesine 1 / α = zaman (sn -1) I 0 = maksimum akım) &#39;dir. Yükselme zamanı ve sinaptik çürüme süresiMevcut α 4 tarafından belirlenir. Inhibitör iletkenlik ve gecikme uyarma başlangıcı (Şekil 2B) göre kendi gecikme azaltarak, güncellenmiştir iken eksitatör iletkenlik değişmedi. <ol start="4"><li> Hücre gövdesi sağlam kalması için Kayıttan sonra, dikkatli bir pipet geri çekin. Hemen fosfat tamponu, 0.1 M, üç adet 10 dakika yıkama ve ardından 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde doku çözmek. Buzdolabında ve ertesi gün ya da bir hafta içinde boyama antikor gerçekleştirin. </li></ol> 4. Lucifer Sarı Dolgulu Retina Ganglion Hücreleri Karşı Antikor Boyama <ol><li> İkincil keçi anti-tavşan IgG (seyreltme = 1:500 ile altıncı gününde, gece boyama; oda sıcaklığında Lucifer Sarı dolu ganglion hücrelerinin (beş gün boyunca birincil anti-Lucifer Sarı tavşan IgG (seyreltme = 1:10,000) karşı antikor boyama )). Floresan korunması Medya retina monte ıslatın. Tırnak p kayma ve mühür Kapakolish. </li><li> Leica Spec-II konfokal mikroskop (Şekil 1B) kullanarak hücre morfolojisinin konfokal fotoğraf çekmek. Bir akson varlığı ganglion hücrelerinin onay verir. </li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp:+artificial+conductances+in+biological+neurons.">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li><li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li><li>Johnson, D., Wu, S. M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).</li><li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina.">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li><li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research.">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li><li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+clamp+comes+of+age.">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li><li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons.">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li><li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices.">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li><li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons:+a+dynamic+clamp+study.">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li><li>Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+factors+for+improving+dynamic+clamp+performance.+In:+Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series.">Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series.</a> Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).</li><li>Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation.">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li><li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+technique:+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering.">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li><li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique.">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li><li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells.">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li><li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina.">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).</li></ol>

Tüm işlemler ilk Sydney Üniversitesi Hayvan Bakım Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve Bilimsel Amaçlı Hayvan Bakımı ve Kullanımı için Uygulama Avustralya Kanunu&#39;nun kuralları (Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi uygun olarak yapıldı .)

Burada oranı ve uyarma ve retina ganglion hücre çıkış inhibe göreli zamanlama etkisini değerlendirmek için dinamik kelepçe kullanımını göstermektedir. Dinamik kelepçe yaşayan nöronların içine fizyolojik kaydedilmiş veya yapay sinaptik iletkenlikleri tanıtmak için bilgisayar simülasyonları kullanır. Bu metodoloji iletkenlikleri değiştirilmiş ve nöronal yanıtları üzerindeki etkilerini hesaplamak için nöronlar enjekte edilebilir hangi interaktif bir araçtır. İletkenlik dalga görsel uya...

Retina gözün arka astar yakın bir şeffaf sinir dokudur. Birçok çalışma, ilk görsel işleme adımları ve sinaptik sinyal mekanizmaları araştırmak için model olarak retina kullanın. Tüm montaj hazırlanmasında retina ağ diseksiyonu sonra bozulmadan kaldığı için, onun fizyolojik yanıtlar in vivo koşullarda çok benzer olarak sinaptik etkileşimleri çalışmak için ideal bir sistem temsil eder. Böylece, kendi nöronların özelliklerini yama kelepçe teknikleri (tekniği ile ilgili yorumlar için, 6,9,13 bakınız) kullanılarak incelenebilir izole bir retina kullanarak. Farmakolojik ajanlar çeşitli sitelerde hareket gibi özel devreler ve ganglion hücre yanıt nörotransmitterlerin tam katkısının belirlenmesi, ancak, genellikle engellenmektedir. Işık retina nöronların fizyolojik yanıtlar, doğal uyarıcı, hücre içi sıvı dolu cam pipetler ile kaydedilebilir. Yama cl kullanarakamp teknikleri, ışık uyarılması nöronal yanıtları membran potansiyeli dalgalanmaları (Güncel kelepçe) veya akım (voltaj kelepçe) olarak kaydedilebilir. Farklı gerilimlerde membran potansiyeli tutarak ve sonradan iletkenlik analizi uygulayarak, bu inhibitör ve eksitatör sinaptik girdi 5,12 izole etmek mümkündür. Bu tür deneyler normal bir banyo ortamı içinde ve farklı nörotransmitter ve nöronal yanıtları reseptörlerinin katkı yalıtmak için farklı farmakolojik ajanların varlığında gerçekleştirilebilir. Birçok laboratuarlardan çalışmaların bir zenginlik spike çıktı ve uyarıcı boyut gibi özellikleri, kontrast, mekansal ve zamansal frekansları, yön, yönlendirme ve diğer uyarıcı değişkenlere eksitatör ve inhibitör girdi bağımlılığı karakterize. Bu deneysel yaklaşımlar başak çıkışı ve uyarıcı özellikleri bir fonksiyonu olarak sinaptik girişleri arasındaki ilişki hakkında bilgi vermek olsa da,hücre uyarılma özgü hücre tipleri ve sinaptik girdi katkısı yorumlanması kolay değildir. Bu, tipik olarak uyarıcı ve inhibitör girişi uyarıcı özelliklerine bağlı olarak değişir ve bu nedenle, bu girişlerin her biri değişiklikler nöronal spike üzerinde sahip olduğu kesin etkisini değerlendirmek mümkün değildir olmasından kaynaklanmaktadır. Bu sınırlamalar aşmak için alternatif bir yaklaşım çıkış spike bireysel sinaptik girdi katkısı bir eleştirel değerlendirme izin dinamik kelepçe kayıtları üzerinden taşımaktır. Dinamik kelepçe tekniği hücreye akım direkt enjeksiyon sağlayan ve belirli bir zamanda mevcut enjekte miktarı o zaman 1,2,3 (inceleme için, 7,14 bakınız) kaydedilen membran potansiyeline bağlıdır. Bu modifiye edilmiş bir akım kelepçe set-up olduğu kayıt altında hücre ve özel donanıma oluşan donanım, yazılım arasında gerçek zamanlı, hızlı geri besleme etkileşimve bir bilgisayar elde edilir. Hücreye geçerli enjekte miktarı buna göre hesaplanır. Bu nedenle, bu yöntemin avantajı hücre iletkenlik dalga farklı kombinasyonları ile stimüle edilebilir, ve tepki sinaptik girdi aracılık reseptörlerinin aktivasyonu taklit edecek olmasıdır. Örneğin, küçük bir nokta için uyarıcı iletkenlik enjeksiyonu için tepki ile küçük bir nokta için eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri enjeksiyonu yanıt karşılaştırılması sadece hücre yanıt inhibisyonu etkisi hakkında bilgi sağlar. Aynı şekilde, fizyolojik olarak kaydedilen iletkenlikleri diğer kombinasyonları başak çıkış nasıl etkilediğini uyarıcı bağımlı eksitatör ve / veya inhibitör iletkenlikleri değişiklikleri ortaya çıkarmak için birlikte enjekte edilebilir. Bizim çalışmamızda, dinamik klemp tekniği nispi genlik ve retinal ganglion hücreleri ateşleme özelliklerine sinaptik girdi zamanlamasının etkisini göstermek için kullanılır. Çeşitli iletkenlikleriKontrol koşullarında ya da farmakolojik ajanların mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen girdi olarak kullanılmıştır. Buna ek olarak, alfa fonksiyonları dayalı yapay iletkenlikleri de sinaptik girişleri nöronlar tarafından entegre nasıl araştırmak amacıyla kullanılmıştır. Bu nedenle, bu iletkenlik çeşitli farmakolojik olarak veya hesaplama aynı ganglion hücre içine enjekte edilmesi, ya da fizyolojik olarak oluşturulur, bu uçlara tepkilerin nedenle karşılaştırma yapılabilir sağlayan çok yönlü bir tekniktir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anaesthetic</td>
			<td>Pharmachem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium with L-Glutamate (Powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Preserving Media</td>
			<td>BioFX Laboratories Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0794</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Stage Glass Microelectrode Puller</td>
			<td>Narishinge Japan</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV 0.22 &mu;m Filter Unit</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G</td>
			<td>Smith &amp; Nephew (Australia)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Model SH-27B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereomicroscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-30 V 2.5 A DC Power Supply</td>
			<td>Dick Smith Electronics</td>
			<td>Q1770</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microscopic Camera ProgResMF cool</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MP-225</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp Amplifier EPC 8</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer: DELL</td>
			<td>Dell Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing dynamic clamp with synaptic and artificial conductances in mouse retinal ganglion cells

Ganglion hücrelerinin retinanın çıkış nöronlar ve faaliyetlerini belirli sinir devrelerinden kaynaklanan birden fazla sinaptik girdi entegrasyonu yansıtır. Voltaj-kıskaç ve akım kelepçe yapılandırmalarda yama kıskaç teknikleri, yaygın olarak nöronların fizyolojik özelliklerini incelemek için ve sinaptik girişleri karakterize etmek için kullanılır. Bu tekniklerin uygulanması son derece bilgilendirici olmasına rağmen, onlar çeşitli sınırlamalar oluşturmaktadır. Örneğin, eksitatör ve inhibitör girdi kesin etkileşimleri tepki çıkışı nasıl etkilediğini ölçmek zordur. Bu sorunu gidermek için, biz de iletkenlik kelepçe 1, 2, 3 olarak adlandırılan değiştirilmiş bir akım kelepçe tekniği, dinamik kelepçe, kullanılan ve sinirsel uyarıların üzerinde eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi etkisini inceledi. Bu teknik, hücre içine akım enjeksiyon gerektirir ve o zaman onun membran potansiyelinin gerçek zamanlı geribildirim bağlıdır. Enjekted mevcut önceden belirlenmiş eksitatör ve inhibitör sinaptik iletkenlikleri, onların ters potansiyelleri ve hücrenin anlık membran potansiyeli hesaplanır. Deney prosedürleri ile ilgili ayrıntılar, dinamik sıkıştırma tekniğinin bir bütün hücre konfigürasyonu ve iş elde etmek için hücreleri sıkma yama Bu video makalede de gösterilmiştir. Burada, kumanda koşullarda ya da ilaç mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen çeşitli iletkenlik dalga fare retinal ganglion hücre sırasında olan tepkileri gösterir. Ayrıca, hücre yanıtları incelemektir alfa fonksiyonları kullanarak oluşturulan suni eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri kullanılmasını gösterir.

Ganglion hücre yanıtları inhibitör girdi farklı kaynaklardan katkısı çeşitli iletkenlik dalga uygulaması ile gösterilmiştir. Bu dalga formları, normal koşullarda ve bloklar tesirinin inhibitör retina internöron bir alt potansiyel üretimi sağlar. Şekil 2A, enjeksiyon için temsili bir tepki gösterir TTX bir voltaj kapılı Na + kanal engelleyicisi varlığında, farklı parlaklık uyarıcı ile elde edilmiştir eksitatör ve inhibitör iletkenlik dalga normal şartlarda gri...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

implementing-dynamic-clamp-with-synaptic-artificial-conductances

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Görüntüleme.  University of Sydney. Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Video: Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Retinal Ganglion Hücrelerini İncelemek için Fare Retina İzolasyonu ve Metanol Tedavisi

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Yazar Spotlight: Retinal Ganglion Hücrelerinin İncelenmesi için Metanol Bazlı Tam Montajlı Hazırlık  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...