Biz, bize çeşitli ekipman kullanımı için izin verdiği için faydalı öneri ve A. Wilde E. Gomes teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (FRN 102.725) Enstitüsü AFP bir hibe ile desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans.">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li><li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast.">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li><li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans.">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li><li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells.">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li><li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts.">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li><li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA.">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li><li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells.">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li><li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling.">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+alignment+of+the+microscope.">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li><li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure.">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li><li>G&#246;rlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents.">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li><li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Cotranscriptionality":+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions.">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li><li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle.">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines.">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li><li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray.">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li></ol>

Mikroenjeksiyon farklı hücresel süreçlerin bir dizi çalışma için kullanılan güçlü bir araçtır. Geleneksel hücre transfeksiyon aksine, mikroenjeksiyon, araştırmacı, çok dar bir zaman dilimi içinde etkili bir şekilde hücresel çekirdek içine nükleik asitlerin tanıtmak sağlar. Sonuç olarak, bir mRNA ihracat mRNA yerelleştirme ve protein sentezi oranlarının belirlenmesinde gibi kinetik analizler gerçekleştirebilirsiniz. Ayrıca, deney zaman dilimi nispeten kısa olduğundan, bir pleiotropik etkileri ödemeden kısa zaman dilimlerine içinde hücreleri toksik bileşikleri açığa çıkarabilir. Dahası, dominant negatif proteinler gibi inhibitör veya uyarıcı bileşikler, nükleik asitler ile eş-enjekte edilebilir. Son olarak, microinjections genellikle hücreleri için toksik ve farklı hücresel fonksiyonları karıştırmayı transfeksiyon reaktifler, gereksinimini ortadan kaldırmak. plazmid DNA enjeksiyonları vs mRNA Nükleik asit enjekte etmek için bir takım hususlar bağlıdır hangi seçim. Plazmid DNA enjeksiyonundan sonra, RNA Polimeraz II mRNA sentezler, aynı zamanda doğmakta olan transkript 12,13 protein faktörleri acemi değil sadece. Bu faktörlerin mRNA işlenmesi, nükleer ihracat ve sitoplazmik lokalizasyon gibi olayları yöneten, plazmid DNA enjeksiyonu transkripsiyon downstream prosesler birleştiğinde nasıl değerlendirmek için kullanılabilir. Transkripsiyon nükleer ihracat 14 birleştiğinde olabilmesine rağmen, biz enjekte mRNA transkripsiyonu mRNA in vivo 6 daha biraz daha hızlı ihraç olduğunu bulduk. Bunun nedenleri şu anda net değil, ancak bu sonucu olarak yeni sentezlenen mRNA RNA Polimeraz II çıkar önerebilir, bu geciktirir nükleer ihracat kompleksleri kadar bağlı olabilir. MRNA enjeksiyonları ile bazı avantajları vardır. İlk olarak, araştırmacı hücrelerin RNA genel metabolizmasını düzenleyen nasıl etkileyebilir, RNA Polimeraz inhibitörleri kullanmak zorunda değildir. İkincisi, RNA enjeksiyondan önce, in vitro olarak değiştirilmiş olabilir. Örneğin, mRNA&#39;ların, bu özellikleri nükleer ihracat 6 nasıl etkilediğini değerlendirmek için çeşitli 5 &#39;şapka analogları veya poli (A) kuyruk uzunlukları ile sentezlenmiş olabilir . Üçüncüsü, enjekte edilir RNA tam miktarı kabaca tahmin edilebilir. Yukarıda belirtilen protokol sonrasında, tipik bir memeli hücre (400,000 850,000 molekülü) 15 transkript toplam sayısı ile kıyaslandığında, nispeten küçük her çekirdek, yaklaşık 20.000 ila 50.000 moleküller enjekte olduğunu tahmin ediyoruz . MRNA enjeksiyonu ile en büyük dezavantajı, mikroenjeksiyon sırasında, sitoplazma içine enjeksiyon sıvısının bazı kaçak kaçınılmaz olduğunu. Sitoplazma içine doğrudan enjekte mRNA (A. Palazzo, basılmamış gözlem) üzerinde uzun süre sabit olduğundan, ekstra bakım hücreleri sayısal seçmek için alınmalıdır. Genellikle enjeksiyon sıvısı&gt;% 90 olarak RG-dekstran dağılımı ile değerlendirildi çekirdeği, alınan hücrelerin analiz eder.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Injection buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D7173</td>
<td>Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips for loading injection needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>022351656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>Eclipse Ti-S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige Group</td>
<td>NT-88-V3MSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe for injection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>512311</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td>
</tr>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15686</td>
<td>Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>28314</td>
<td>Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>F84-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fischer Scientific</td>
<td>BP1585-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E. coli tRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vanadyl riboside complex (VRC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>R3380</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>28298-020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration control table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kinetic Systems</td>
<td>5702E-3036-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluoromount G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Southern Biotech</td>
<td>0100-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-amanitin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>A2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-374-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>695400008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>M0251S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly(A) Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of mrna nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection

Ökaryotlarda mesajcı RNA (mRNA) çekirdeğinde transkripsiyonu ve sitoplazma çeviri makine erişmek için ihraç edilmelidir. MRNA nükleer ihracat Xenopus oositleri 1 ve maya 2 ve Drosophila elde edilen S2 hücre hattı 3 gibi uysal organizmaların genetik yoğun çalışılan olsa da, memeli hücrelerinde az sayıda çalışma yapılmıştır. Ayrıca memeli somatik hücre mRNA ihracat kinetiği sadece dolaylı olarak 4,5 anlaşılmaktadır. Memeli doku kültürü hücrelerinde mRNA nükleer ihracat kinetiği ölçmek için, floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir test geliştirdiler. Bu deneyleri, memeli hücrelerinde ekleme bağımlı bir şekilde 6,7 mRNA&#39;ların çoğunluğu ihraç ya da sinyal dizisi kodlama bölgesi (SSCR) 6 gibi spesifik RNA dizileri gerektirir şekilde olduğunu göstermek için kullanılmıştır . Bu testte, hücreler, sentezlenen mRNA veya ilgi genini içeren plazmid DNA ya in vitro microinjected . Microinjected hücreler, daha sonra sabit ve RNA alt hücresel yerleşimi BALIK kullanılarak değerlendirildi çeşitli noktalarında inkübe edilir. Transkripsiyon nükleik asitlerin yanı sıra birkaç saat sonra ortaya çıkar transfeksiyon, aksine, DNA veya mRNA mikroenjeksiyon hızlı ifade sağlar ve hassas kinetik verilerin üretimi için izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection at JoVE.com

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Burada floresan ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir tahlil<em&gt; In situ</em&gt; Memeli somatik hücre mRNA nükleer ihracat kinetiği doğru ölçmek için hibridizasyon.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

analysis-mrna-nuclear-export-kinetics-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Görüntüleme.  University of Toronto. Burada floresan ile birleştiğinde mikroenjeksiyon güç kullanan bir tahlil In situ Memeli somatik hücre mRNA nükleer ihracat kinetiği doğru ölçmek için hibridizasyon.