Evan Dysart ve Marc Léonard video prodüksiyon ve düzenleme, veri toplama konusunda yardım için Matt Cooke uzman teknik yardım için teşekkür eder, ve uzman yayın yardım için Sarah Gelbard. Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR, MOP 62.626) SALB, Sağlık Araştırma programı hibe SALB ve SF Stratejik Eğitim Girişimi (TGF Nörodejeneratif Lipidomics CIHR Eğitim Programı, 9121) ve altyapı işletme hibeleri tarafından finanse edildi Kanada Vakfı Yenilik ve Ontario Yenilik Güven SF destek. SI Parkinson Araştırma Konsorsiyumu katkıları ile bir Ontario Bilim ve Teknoloji Yüksek Lisans Bursu aldı. NV Yaşlanma Enstitüsü ve sonrası profesyonel dostluk Nörodejeneratif Lipidomics CIHR Eğitim Programı alır. Biz minnetle AutoDesk Research tarafından sağlanan eğitim, yazılım ve teknik destek kabul etmiş sayılırsınız.

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Tüm hayvanlar üzerinde yapılan deneyler, Ottawa Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi ve Kanada Hayvan Bakım Konseyi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.

Bu protokol, kültür ve seri cryosection post-natal hipokampal NPC&#39;ler, bir yordam açıklanır İmmuno protein ekspresyonu yerelleştirmeniz ve nihayet tüm 3D neurosphere içinde immünopozitif hücreleri topografik konumu yeniden ve analiz. Hücre biyolojisi kültürü ve işleme teknikleri, mikroskopi görüntüleme (openlabın, Doğaçlama ve diğer görüntü analiz yazılımları) birleştirerek, grafik düzenleme yazılımı kapasiteleri (Adobe Photoshop), 3D animasyon ve kompozisyon yazılım kapasiteleri (Autodesk Maya), biz yeniden bir metodoloji mevcut sadık bir neurosphere kültür boyunca hücresel konum ve protein ifade yeniden inşası için izin seri 2D görüntüleri 3D kültürlerin tüm hücresel bileşimi. Bu protokol, kayıt ve kalın seri bölümleri ile epifluorescent ince seri bölümleri veya konfokal Z-yığınlarının rekonstrüksiyonu eşit etkinliği ile kombine edilebilir. Çünkü doğum sonrası beyindeki nöron ve gliogenesis boyunca gözlenen birçok aşamadan neurosphere kültür özetlediği tek NPC&#39;ler klonal genişleme, 3D yapısının etkisi aynı deneysel ortam 1 ​​maruz döl önemli bir NPC kaderini belirleyici temsil eder. Seri neurosphere bölümleri, merkez ve çevre soy ve protein ekspresyonu Farklılıklar NPC biyoloji 2 düzenleyen hücre konumu, mekanik stres ve kesme kuvveti de dahil olmak üzere birden çok fiziksel faktörler önemli rol oynamaktadır. Ayrıca, Konneksin protein ekspresyonu, burada analiz NPC&#39;ler 3D süspansiyon neurospheres veya hücreleri, plastik ve yüzey veya 3D ücretsiz kültür olup olmadığını değişmiş fonksiyonel Konneksin aracılı iletişim laminin substrat kaplama olarak kültüre bağlı olarak değişiklik gösterilmiştir kayan kültürler 3. NPC kaderi hücresel pozisyon etkisi belirsizliğini korumaktadır. Bu teknik, soy ve sinyalizasyon proteinler antijenik değerlendirme 3D mimarisi bozulması hücre permeabilization ve tüm hücrelerin antikor erişimi sağlamak için ihtiyaç duyduğu verilen NPC biyoloji 3D kültür içinde mekansal konumu etkisini analiz etmek zordur. Burada, biz melez bir görselleştirme metodoloji bazı proteinler, benzersiz 3D kültür pozisyonel lokalizasyonu sergi olup olmadığını belirleyen bir vasıta olduğunu, belki de en önemlisi, bölgesel lokalizasyon açısından neurosphere içinde protein fonksiyonu ve düzenleme anlaması ve test etmek için kullanılır, ve olabilir 3D topografya ve hücresel konumlandırma 3D kültür NPC kaderi üzerindeki etkilerini incelemek için gerekli olan konumsal veri sağlar.

* Protokol listelenen tüm diğer standart kimyasal reaktifler Sigma-Aldrich. Diğer tüm standart doku kültürü reaktifler Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

Nöral kök ve progenitör hücre etkileyen 3 boyutlu (3D) topografyanın önemi (NPC) fenotipi yaygın henüz çalışmaya zorlu kabul edilmektedir. Embriyonik veya doğum sonrası beyin ne zaman ayrışmış, tek NPC&#39;ler neurospheres formu askıya çoğalacak. Bu kültürlerin içinde kızı hücreleri aynı ekstrasellüler ortam maruz olmasına rağmen kendiliğinden genişleme içerisinde farklı gelişim soyları (nöronlar, oligodendrosit ve astrositler) benimsemek. Bu ilerlemesini özetlediği aşamaları çoğu doğum sonrası beyindeki nöron ve gliogenesis boyunca gözlenen ve kontrollü bir ortam içinde temel NPC biyoloji okumak için sık sık kullanılır. NPC kaderi bu kültürlerin içinde 3D topografya ve hücresel konumlandırma tam etkisini değerlendiren Ancak, zordur. Hedef proteinler lokalize ve immünhistokimya ile NPC soy belirlemek için, serbest neurospheres bir substrat üzerindeki kaplama veya seri kesitli olmalıdır. Bu işleme eşdeğer hücre permeabilization ve küreden antikor erişim sağlamak için gereklidir. Sonuç olarak, cryosections veya 3D Z-yığınlarının konfokal rekonstrüksiyonlar epifluorescent 2D görüntüleri sadece mekansal ayrık fiziksel veya dijital 3D dilimleri içinde hücre konumu hakkında bilgi verebilir ve bozulmamış bir alanda hücresel konum görselleştirmek yok. Burada neurosphere kültür topografya yinelemek ve tüm kültür boyunca protein ekspresyonu mekansal analizi izin verecek, biz bir protokol izolasyonu için, genişleme ve hedef proteinlerin epifluorescent veya konfokal İmmuno için uygun doğum sonrası hipokampal neurospheres seri kesit sunuyoruz. Connexin29 (Cx29) bir örnek olarak analiz edilir. Sonra, grafik düzenleme ve 3D modelleme bir melez kullanarak biyolojik detay titizlikle korumak için uygulanan yazılımları, bu görüntülerin 3 boyutlu yapısal konumlandırma yeniden birleştirmek ve dijital olarak tam neurosphere içinde etiketli hücreler haritası nasıl açıklar. Bu metodoloji, tüm 3D kültür topoğrafya boyunca hedef proteinleri ve hücreleri hücresel pozisyon görselleştirme ve analiz sağlar ve daha ayrıntılı bir analizi, in vitro nöron ve gliogenesis boyunca hücreleri arasındaki mekansal ilişkileri kolaylaştıracaktır. Imbeault ve Valenzuela Her ikisi de eşit derecede katkıda bulunan ve ilk yazarın ortak düşünülmelidir.

Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Burada, üç boyutlu (3D) kültür üretmek genişletmek ve immunolabel postnatal hipokampal nöral progenitör hücrelerin (NPC) nasıl açıklar. Sonra, hibrid görselleştirme teknolojiler kullanılarak, dijital görüntüler immunolabelled cryosections tüm 3D neurosphere boyunca immünopozitif hücreler mekansal konumunu yeniden ve harita için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

3D Nöral Kök Hücre Kültürü yerelleştirme Protein: Hybrid Görselleştirme Metodolojisi

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Görüntüleme.  University of Ottawa. Burada, üç boyutlu (3D) kültür üretmek genişletmek ve immunolabel postnatal hipokampal nöral progenitör hücrelerin (NPC) nasıl açıklar. Sonra, hibrid görselleştirme teknolojiler kullanılarak, dijital görüntüler immunolabelled cryosections tüm 3D neurosphere boyunca immünopozitif hücreler mekansal konumunu yeniden ve harita için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.