Agradecemos a Evan Dysart e Marc Léonard de assistência técnica especializada na produção e edição de vídeo, Matt Cooke para auxiliar na coleta de dados, e Sarah Gelbard para especialista em assistência editorial. O trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR, 62.626 MOP) para SALB, uma iniciativa de formação Estratégica em Saúde Pesquisa programa de subvenção para SALB e SF (CIHR Programa de Treinamento em Lipidomics Neurodegenerativas, TGF 9121), e infra-estrutura apoio da Fundação Canadense de Inovação e Inovação Ontário Trust para SF. SI recebeu uma Bolsa de Pós-Graduação em Ontario Ciência e Tecnologia com as contribuições do Consórcio de Pesquisa de Parkinson. NV recebe um Instituto de Envelhecimento e Programa de Formação em CIHR Lipidomics Neurodegenerativas pós-profissional comunhão. Agradecemos o suporte de software e técnicos educacionais fornecidos pela Autodesk Research.

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Ottawa Animal Care Comissão eo Canadian Council on Animal Care.

Este protocolo descreve um procedimento para a cultura e em série cryosection pós-natal do hipocampo NPCs, localizar a expressão da proteína por imunodetecção e, finalmente, reconstruir e analisar a posição topográfica de células imuno dentro do neurosphere inteira 3D. Através da combinação de cultura de células de biologia e técnicas de processamento, a imagem de microscopia (OpenLab, Improvisação e softwares de análise de imagem), capacidades de edição gráfica software (Adobe Photoshop), e animação 3D e capacidades software de composição (Autodesk Maya), apresentamos uma metodologia para reconstruir a composição celular de culturas inteiras 3D a partir de série de imagens 2D permitindo a reconstrução fiel da posição celular e expressão da proteína em toda uma cultura neurosphere. Este protocolo pode ser combinado com a mesma eficácia para o registro e reconstrução de epifluorescência finos cortes seriados ou confocal Z-stacks através de cortes seriados mais grosso. Porque a expansão clonal dos NPCs único recapitula cultura neurosphere muitos dos estágios observados ao longo de neurogênese e gliogenesis no pós-natal do cérebro, o impacto de sua estrutura 3D representa um determinante importante destino NPC na progênie expostos ao mesmo meio experimental 1. Divergência na linhagem e expressão da proteína no centro e na periferia das seções neurosphere série sugere que múltiplos fatores físicos, incluindo a posição da célula, stress mecânico, ea força de cisalhamento desempenham um papel importante na regulação do NPC biologia 2. Além disso, a expressão da proteína conexina, aqui analisados, foi mostrado para mudar dependendo de quando NPCs são cultivadas como neurospheres 3D em suspensão ou revestida sobre um substrato de laminina com a comunicação mediada por conexina funcionais alteradas se as células são cultivadas em substrato de plástico e ou em 3D grátis flutuante culturas 3. O impacto da posição celular no NPC destino permanece incerto. É um desafio técnico para analisar o impacto de localização espacial dentro da cultura em 3D sobre a biologia NPC dado que a avaliação antigênica de linhagem e proteínas de sinalização exige a interrupção da arquitetura 3D para habilitar permeabilização celular e acesso a todas as células de anticorpos. Aqui, nós mostramos que uma metodologia de visualização híbrida fornece um meio de determinar se certas proteínas exibem única localizações na cultura posicional 3D, pode ser usado para inferir e testar a função da proteína e regulamentação no que diz respeito à localização regional no âmbito da neurosphere, e, talvez o mais importante , fornece os dados de posicionamento necessárias para estudar o impacto da topografia 3D e posicionamento celular sobre o destino NPC na cultura 3D.

* Todos os outros reagentes químicos padrão listados no protocolo são da Sigma-Aldrich. Todos os outros reagentes cultura padrão de tecido são da Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

A importância de 3-dimensional de topografia (3D) em influenciar-tronco neurais e de células progenitoras (NPC) fenótipo é amplamente reconhecido, mas desafiadoras para estudar. Quando dissociado do cérebro embrionário ou pós-natal, NPCs único proliferam em suspensão para formar neurospheres. Células-filhas dentro dessas culturas espontaneamente adotar distintas linhagens de desenvolvimento (neurônios, oligodendrócitos e astrócitos) ao longo de expansão, apesar de ser exposto ao mesmo meio extracelular. Esta progressão recapitula muitos dos estágios observados ao longo de neurogênese e gliogenesis no pós-natal do cérebro e é freqüentemente usado para estudar biologia básica NPC dentro de um ambiente controlado. Avaliação do impacto total da topografia 3D e posicionamento celular dentro dessas culturas sobre o destino NPC é, no entanto, difícil. Para localizar e identificar proteínas-alvo linhagens NPC por imunocitoquímica, de livre flutuação neurospheres devem ser semeadas em um substrato ou seccionados. Este tratamento é necessário para garantir permeabilização de células equivalentes e acesso de anticorpos ao longo da esfera. Como resultado, 2D imagens de epifluorescência de criosecções ou reconstruções 3D confocal de Z-stacks só pode fornecer informações espaciais sobre a posição da célula dentro discreto física ou digital 3D fatias e não visualizar a posição de celular na esfera intacta. Aqui, para reiterar a topografia da cultura neurosphere e permitir a análise espacial de expressão da proteína em toda a cultura inteira, apresentamos um protocolo para o isolamento, expansão e corte de série do pós-natal do hipocampo neurospheres adequado para imunodetecção de epifluorescência ou confocal de proteínas-alvo. Connexin29 (Cx29) é analisado como um exemplo. Em seguida, usando um híbrido de edição gráfica e modelagem 3D softwares aplicados rigorosamente para manter detalhes biológicos, que descrevem como re-montar o posicionamento 3D estruturais dessas imagens e digitalmente mapa células marcadas dentro do neurosphere completa. Esta metodologia permite a visualização e análise da posição celular de proteínas-alvo e células em toda a topografia cultura inteira 3D e irá facilitar uma análise mais detalhada das relações espaciais entre as células ao longo da neurogênese e gliogenesis in vitro. Ambos Imbeault e Valenzuela contribuíram igualmente e devem ser considerados conjunta primeiros autores.

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Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Aqui, descrevemos a forma de produzir, expandir e pós-natal do hipocampo immunolabel células progenitoras neurais (NPCs), em três dimensões da cultura (3D). Em seguida, usando tecnologias de visualização híbrida, que demonstram como as imagens digitais de criosecções immunolabelled pode ser usado para reconstruir e mapear a posição espacial de células imuno todo o neurosphere 3D inteiro.

Proteína localização em Cultura de Células-tronco neurais 3D: uma Metodologia de visualização híbrida

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K visualizações.  University of Ottawa. Aqui, descrevemos a forma de produzir, expandir e pós-natal do hipocampo immunolabel células progenitoras neurais (NPCs), em três dimensões da cultura (3D). Em seguida, usando tecnologias de visualização híbrida, que demonstram como as imagens digitais de criosecções immunolabelled pode ser usado para reconstruir e mapear a posição espacial de células imuno todo o neurosphere 3D inteiro.