Ringraziamo Evan Dysart e Marc Léonard per l&#39;assistenza tecnico esperto in produzione e l&#39;editing video, Matt Cooke per l&#39;assistenza nella raccolta dei dati, e Sarah Gelbard per l&#39;assistenza editoriale esperti. L&#39;opera è stata finanziata da sovvenzioni di funzionamento dal Canadian Institute of Health Research (CIHR, MOP 62626) a SALB, un&#39;iniziativa di formazione strategica nel programma di sovvenzioni Health Research di SALB e SF (Programma di Formazione in CIHR Lipidomica neurodegenerative, TGF 9121), e le infrastrutture il sostegno della Fondazione canadese dell&#39;Ontario Innovazione Innovazione e fiducia a SF. SI ha ricevuto una borsa di studio Ontario Laurea in Scienze e Tecnologie con il contributo del Consorzio di ricerca di Parkinson. NV riceve un Istituto di invecchiamento e Programma di formazione CIHR in Lipidomica neurodegenerative borsa di studio post-professionale. Noi riconosciamo con gratitudine il supporto software educativo e tecnico fornito da AutoDesk ricerca.

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall&#39;Università di Cura Comitato Ottawa degli animali e del Consiglio canadese di prodotti per animali.

Questo protocollo descrive una procedura per la cultura e serialmente cryosection NPC dell&#39;ippocampo post-natale, localizzare l&#39;espressione di proteine ​​da immunolocalizzazione, ed infine ricostruire e analizzare la posizione topografica delle cellule immunopositive all&#39;interno del neurosfere intero 3D. Grazie alla combinazione di cultura biologia cellulare e tecniche di lavorazione, immagini di microscopia (OpenLab, Improvvisazione e altri software di analisi delle immagini), le capacità del software di editing grafico (Adobe Photoshop), e l&#39;animazione 3D e capacità software per il compositing (Autodesk Maya), vi presentiamo una metodologia di ricostruire la tutta la composizione cellulare di culture 3D da immagini 2D di serie consentendo la ricostruzione fedele della posizione cellulare e l&#39;espressione della proteina in tutto una cultura neurosfere. Questo protocollo può essere combinato con efficacia pari alla registrazione e la ricostruzione di sezioni sottili epifluorescente serial o confocale Z-stack attraverso spesse sezioni seriali. Perché l&#39;espansione clonale di NPC singola cultura neurosfere ricapitola molte delle fasi osservate nel corso della neurogenesi e gliogenesis in post-natale del cervello, l&#39;impatto della sua struttura 3D rappresenta un importante determinante destino NPC in progenie esposta al stesso ambiente sperimentale 1. La divergenza tra lignaggio e l&#39;espressione della proteina al centro e la periferia di sezioni neurosfere di serie suggerisce che molteplici fattori fisici compresa la posizione delle cellule, sollecitazioni meccaniche, e la forza di taglio giocano un ruolo importante nella regolazione della NPC biologia 2. Inoltre, l&#39;espressione della proteina connessina, qui analizzata, ha dimostrato di cambiare a seconda di quando gli NPC sono coltivate come neurosfere 3D in sospensione o placcato su un substrato di laminina con funzionali connessina comunicazione mediata alterata se le cellule sono coltivate su plastica e substrato o in 3D gratis fluttuante culture 3. L&#39;impatto della posizione cellulare sul destino NPC rimane poco chiaro. E &#39;tecnicamente impegnativo per analizzare l&#39;impatto di posizione spaziale all&#39;interno della cultura 3D su biologia NPC dato che la valutazione antigenica di lignaggio e proteine ​​di segnalazione richiede interruzioni di architettura 3D per permettere permeabilizzazione cellulare e di anticorpi accesso a tutte le celle. Qui mostriamo che una metodologia di visualizzazione ibrida fornisce un mezzo per stabilire se alcune proteine ​​mostra unica localizzazioni di posizione nella cultura 3D, può essere usata per capire e testare la funzione delle proteine ​​e la regolazione rispetto alla localizzazione regionale nel neurosfere, e, cosa forse più importante , fornisce i dati di posizione necessario per studiare l&#39;impatto della topografia 3D e posizionamento cellulare sul destino NPC nella cultura 3D.

* Tutti gli altri reagenti chimici standard elencati nel protocollo sono di Sigma-Aldrich. Tutti gli altri reagenti standard di coltura tissutale sono da Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

L&#39;importanza delle 3 dimensioni (3D) topografia nell&#39;influenzare staminali neurali e cellule progenitrici (NPC) fenotipo è ampiamente riconosciuto ancora difficile da studiare. Quando dissociato dal cervello embrionale o post-natale, NPC singolo proliferare in sospensione per formare neurosfere. Cellule figlie all&#39;interno di queste culture spontaneamente adottare distinte linee di sviluppo (neuroni, oligodendrociti ed astrociti) nel corso di espansione, pur essendo esposti alla stesso ambiente extracellulare. Questa progressione ricapitola molte delle fasi osservate nel corso della neurogenesi e gliogenesis in post-natale del cervello ed è spesso usato per studiare la biologia di base NPC in un ambiente controllato. Valutare l&#39;impatto della topografia 3D e posizionamento cellulari all&#39;interno di queste culture, sul destino NPC, tuttavia, è difficile. Di localizzare ed identificare proteine ​​bersaglio lignaggi NPC mediante immunocitochimica, libero di fluttuare neurosfere deve essere placcato su un substrato o sezionato in serie. Questa elaborazione è necessaria per garantire permeabilizzazione equivalente cellulare e accedere anticorpi per tutta la sfera. Come risultato, le immagini 2D epifluorescente di criosezioni confocale o ricostruzioni 3D di Z-stack può fornire solo informazioni spaziali sulla posizione di celle all&#39;interno di discrete fette fisica o digitale 3D e non visualizzare la posizione cellulare nella sfera intatta. Qui, per ribadire la topografia della cultura neurosfere e permettere analisi spaziale di espressione della proteina durante l&#39;intera cultura, vi presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento, espansione e sezionamento seriale di neurosfere dell&#39;ippocampo post-natale adatto per immunolocalizzazione epifluorescente confocale o delle proteine ​​bersaglio. Connexin29 (Cx29) è analizzato come un esempio. Successivamente, utilizzando un ibrido di editing grafico e di modellazione 3D software applicati rigorosamente per mantenere dettaglio biologico, ci descrivono come rimontare il posizionamento 3D strutturale di queste immagini e la mappa digitale cellule marcate all&#39;interno della neurosfere completo. Questa metodologia permette la visualizzazione e l&#39;analisi della posizione del cellulare di proteine ​​bersaglio e cellule in tutta la topografia intera cultura 3D e faciliterà un&#39;analisi più dettagliata delle relazioni spaziali tra le cellule nel corso della neurogenesi e gliogenesis in vitro. Sia Imbeault e Valenzuela contribuito in maniera uguale e dovrebbe essere considerato comune primi autori.

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Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Qui, descriviamo come produrre, espandere e immunolabel postnatale cellule dell&#39;ippocampo progenitrici neurali (NPC) in tre dimensioni (3D) della cultura. Successivamente, utilizzando le tecnologie di visualizzazione ibrida, che dimostrano come le immagini digitali di criosezioni immunolabelled può essere usata per ricostruire e mappare la posizione spaziale delle cellule immunopositive tutto il neurosfere 3D intero.

Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Views.  University of Ottawa. Qui, descriviamo come produrre, espandere e immunolabel postnatale cellule dell'ippocampo progenitrici neurali (NPC) in tre dimensioni (3D) della cultura. Successivamente, utilizzando le tecnologie di visualizzazione ibrida, che dimostrano come le immagini digitali di criosezioni immunolabelled può essere usata per ricostruire e mappare la posizione spaziale delle cellule immunopositive tutto il neurosfere 3D intero.

Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

Proteine localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida