우리는 비디오 제작 및 편집, 데이터 수집에 도움 매트 쿡의 전문 기술 지원 에반 다이사트 및 마크 레너드를 감사하고, 전문 편집 지원 사라 Gelbard. 작품은 SALB, SALB 및 SF에 건강 연구 프로그램 부여에서 전략적 교육 이니셔티브 (TGF Neurodegenerative Lipidomics에서 CIHR 교육 프로그램, 9121), 그리고 인프라 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR, 청소 62,626)에서 운영 기금에 의해 투자되었다 캐나다 온타리오 재단 혁신과 혁신 트러스트에서 SF로 지원합니다. SI는 파킨슨 연구 컨소시엄의 공헌과 과학 기술의 온타리오 대학원 장학금을 받았다. NV는 노화와 이후 전문적인 교제 Neurodegenerative Lipidomics에서 CIHR 교육 프로그램의 연구소를받습니다. 우리는 기꺼이 오토 데스크 리서치에서 제공하는 교육 소프트웨어 및 기술 지원을 인정합니다.

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

동물의 모든 실험은 오타와 애니멀 케어위원회의 대학과 동물 케어의 캐나다 협의회가 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

이 프로토콜은 문화와 순차적으로 cryosection 이후 나탈 hippocampal NPCs에게 절차를 설명하는 것은 면역에 의해 단백질 표현을 집중하고, 마지막으로 전체 3D neurosphere 이내 immunopositive 세포의 지형 위치를 재구성하고 분석합니다. 세포 생물학 문화와 가공 기술, 현미경 이미징을 (OpenLab, 순발력 및 기타 이미지 분석 소프트웨어) 결합하여, 그래픽 편집 소프트웨어 용량 (어도비 포토샵) 및 3D 애니메이션 및 합성 소프트웨어 용량 (오토 데스크 마야)는, 우리는 재구 성할 수있는 방법론을 제시 neurosphere 문화 전반에 걸쳐 휴대폰 위치와 단백질 표현의 충실 재건에 대한 수 있도록 일련 2D 이미지에서 3D 문화의 모든 세포 구성. 이 프로토콜은 등록과 두꺼운 시리얼 섹션을 통해 epifluorescent 얇은 시리얼 섹션 또는 공촛점 Z - 스택의 재건과 동일 효과와 함께하실 수 있습니다. 포스트 나탈 머리에 neurogenesis 및 gliogenesis 과정을 통해 관찰 단계의 많은 neurosphere 문화 recapitulates 단일 NPCs의 clonal 확장 때문에, 그 3 차원 구조의 영향은 동일한 실험 환경 1 노출 자손에 중요한 NPC 운명의 결정자를 나타냅니다. 시리얼 neurosphere 섹션의 핵심과 주변에서 혈통과 단백질 표현의 발산은 세포 위치, 기계적 응력과 전단 강제를 포함하여 여러 물리적인 요소가 NPC 생물학 2 조절에서 중요한 역할을 제안합니다. 또한, connexin 단백질 표현, 여기에 분석은 NPCs가 3D 정지 neurospheres 또는 세포 플라스틱 기판이나 3D 무료 양식 여부 변경 기능 connexin - 중재 통신 laminin 기판에 도금으로 양식하는 경우에 따라 변경 표시되었습니다 - 부동 문화 3. NPC의 운명에 대한 세포 위치의 영향은 불분명 남아 있습니다. 그것은 기술적으로 혈통 및 신호 단백질의 antigenic 평가는 3D 건축의 중단은 세포 permeabilization 모든 세포에 항체 액세스를 활성화하는 데 필요한 특정 NPC 생물학에 3D 문화 이내 공간적 위치의 영향을 분석하는 도전이다. 여기, 우리가 하이브리드 시각화 방법론 특정 단백질이 3D 문화의 독특한 위치 localizations 전시 여부를 결정하는 수단을 제공한다는 것을 보여주기, 가장 중요한 아마도 neurosphere 이내 지역 현지화 관련하여 단백질 기능과 규제를 추론하고 테스트하는 데 사용하고, 수 , 3D 문화의 NPC 운명에 3D 지형 및 셀룰러 위치의 영향을 연구하는 데 필요한 위치 데이터를 제공합니다.

프로토콜 목록에 * 다른 모든 표준 화학 시약은 시그마 - 알드리치에서 있습니다. 다른 모든 표준 조직 문화 시약는 Invitrogen에서 있습니다.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

신경 줄기 및 전구 세포에 영향을 미치는 3 차원 (3D) 지형의 중요성 (NPC) 표현형 널리 아직 공부 도전 인정받고 있습니다. 배아 또는 사후 나탈 머리에서하면 dissociated, 단일 NPCs는 neurospheres을 형성 중지 분아 따위에 의해 번식합니다. 이러한 문화 이내 딸 세포가 저절로 같은 세포외 환경에 노출 임에도 불구하고 확장의 과정을 통해 서로 다른 발달 lineages을 (뉴런, oligodendrocytes 및 astrocytes) 채택. 이 진행의 recapitulates이 단계의 대부분은 이후 나탈 두뇌에서 neurogenesis 및 gliogenesis 과정을 통해 관찰하고 종종 통제 환경에서 기본적인 NPC의 생물학을 연구하는 데 사용됩니다. NPC의 운명에서 이러한 문화 이내 3D 지형 및 셀룰러 위치의 전체 영향을 평가하는 것은, 그러나, 어렵습니다. 대상 단백질을 집중하고 immunocytochemistry하여 NPC의 lineages를 확인하려면 자유 떠있 neurospheres은 기판에 도금 또는 순차적으로 sectioned해야합니다. 이 처리는 동일한 세포 permeabilization과 영역에 걸쳐 항체 접근을 보장하기 위해 필요합니다. 그 결과, cryosections 또는 3D Z - 스택의 공촛점 reconstructions의 2D epifluorescent 이미지는 별도의 물리적 또는 디지털 3D 조각 내의 세포의 위치에 대한 공간 정보를 제공할 수 있고 손상 영역에 휴대폰 위치를 시각화하지 않습니다. 여기 neurosphere 문화의 지형을 강조하고 전체 문화 전반에 걸쳐 단백질 표현의 공간적 분석을 허용하는, 우리는 고립을위한 프로토콜, 확장하고, 대상 단백질의 epifluorescent 또는 공촛점 면역에 적합한 사후 나탈 hippocampal neurospheres 일련 sectioning을 제시. Connexin29 (Cx29)을 예로 분석이다. 다음 그래픽 편집 및 3D 모델링의 하이브리드를 사용하는 것은 엄격하게 생물 학적 세부 사항을 유지하기 위해 적용되는 소프트웨어, 우리는 이러한 이미지의 3D 구조 위치를 다시 조립하고 디지털 전체 neurosphere 내에 표시된 세포를지도하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법론은 대상 단백질 및 전체 3D 문화 지형을 통해 세포의 세포 위치 시각화 및 분석을 가능하게하고 체외에서 neurogenesis 및 gliogenesis 과정을 통해 세포 사이의 공간 관계의 상세한 분석을 용이하게합니다. 임보와 발렌 주 엘라 모두 동등하게 기여 공동 첫번째 작가로 간주되어야합니다.

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Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

여기, 우리는 세 차원 (3D) 문화, 생산 확장하고 immunolabel 출생 후의 hippocampal 신경 전구 세포 (NPCs)하는 방법에 대해 설명합니다. 다음, 하이브리드 시각화 기술을 사용, 우리는 immunolabelled cryosections의 디지털 이미지가 전체 차원 neurosphere에 걸쳐 immunopositive 세포의 공간적 위치를 재구성하고지도하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

3D 신경 줄기 세포 문화 번역하는 단백질 : 하이브리드 시각화 방법론

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K 조회수.  University of Ottawa. 여기, 우리는 세 차원 (3D) 문화, 생산 확장하고 immunolabel 출생 후의 hippocampal 신경 전구 세포 (NPCs)하는 방법에 대해 설명합니다. 다음, 하이브리드 시각화 기술을 사용, 우리는 immunolabelled cryosections의 디지털 이미지가 전체 차원 neurosphere에 걸쳐 immunopositive 세포의 공간적 위치를 재구성하고지도하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.