Nous remercions Evan Dysart et Marc Léonard pour l&#39;assistance technique d&#39;experts dans la production et l&#39;édition vidéo, Matt Cooke pour l&#39;assistance dans la collecte de données, et Sarah Gelbard pour son assistance éditoriale expert. Le travail a été financé par des subventions de fonctionnement de l&#39;Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC, MOP 62626) pour SALB, une initiative stratégique de formation en recherche en santé du programme de subvention pour SALB et SF (Programme de formation des IRSC en lipidomique neurodégénératives, le TGF 9121), et des infrastructures le soutien de la Fondation canadienne de l&#39;innovation et de l&#39;Ontario Innovation Trust à SF. SI a reçu une bourse d&#39;études supérieures de l&#39;Ontario en science et technologie avec la contribution du Consortium de recherche de Parkinson. NV reçoit un Institut du vieillissement des IRSC et le Programme de formation en lipidomique neurodégénératives bourse post-professionnelle. Nous tenons à souligner l&#39;appui de logiciels éducatifs et techniques fournies par Autodesk de recherche.

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université d&#39;Ottawa Comité de protection des animaux et le Conseil canadien de protection des animaux.

Ce protocole décrit une procédure pour la culture et de série cryosection post-natale PNJ hippocampe, localiser l&#39;expression des protéines par immunodétection, et enfin reconstruire et analyser la position topographique des cellules immunopositives au sein de l&#39;ensemble Neurosphère 3D. En combinant la biologie cellulaire et la culture des techniques de traitement, l&#39;imagerie microscopique (OpenLab, d&#39;improvisation et d&#39;autres logiciels d&#39;analyse d&#39;image), graphique capacités logiciel de montage (Adobe Photoshop), et l&#39;animation 3D et les capacités du logiciel de compositing (Autodesk Maya), nous présentons une méthodologie pour reconstruire la toute composition cellulaire des cultures 3D à partir d&#39;images 2D de série permettant la reconstitution fidèle de la position de cellulaire et l&#39;expression des protéines à travers une culture Neurosphère. Ce protocole peut être combiné avec une efficacité égale à l&#39;enregistrement et la reconstruction de sections minces épifluorescence serial ou confocale Z-piles dans des sections plus épaisses de série. Parce que l&#39;expansion clonale des PNJ unique récapitule la culture Neurosphère de nombreuses étapes observées au cours de la neurogenèse et la gliogénèse en post-natal du cerveau, l&#39;impact de sa structure 3D représente un déterminant important de PNJ sort dans la progéniture exposée au même milieu expérimental 1. Divergences dans la lignée et l&#39;expression des protéines dans le noyau et la périphérie des sections Neurosphère série suggère que plusieurs facteurs physiques, y compris la position des cellules, le stress mécanique et la force de cisaillement jouent un rôle important dans la régulation de la biologie PNJ 2. Par ailleurs, l&#39;expression des protéines connexine, analysé ici, a été démontré que le changement selon le moment où les PNJ sont cultivées comme neurosphères 3D en suspension ou en plaqué sur un substrat de laminine avec fonctionnelle connexine communication médiatisée altérée si les cellules sont cultivées sur plastique et substrat ou en 3D gratuitement flottant cultures 3. L&#39;impact de la position de cellulaires sur le sort de PNJ reste incertaine. Il est techniquement difficile d&#39;analyser l&#39;impact de la localisation spatiale au sein de la culture en 3D sur la biologie PNJ étant donné que l&#39;évaluation antigénique du lignage et de protéines de signalisation requiert la perturbation de l&#39;architecture 3D pour permettre perméabilisation cellulaire et l&#39;accès à toutes les cellules d&#39;anticorps. Ici, nous montrons que la visualisation d&#39;une méthodologie hybride offre un moyen de déterminer si certaines protéines exposition unique dans la culture localisations positionnel 3D, peut être utilisé pour inférer et de tester la fonction des protéines et la réglementation en matière de localisation régionale au sein de l&#39;Neurosphère, et, peut-être plus important , fournit les données de position nécessaires pour étudier l&#39;impact de la topographie 3D et de positionnement sur le destin cellulaire NPC dans la culture 3D.

* Tous les autres réactifs chimiques standard énumérées dans le protocole sont de Sigma-Aldrich. Tous les autres réactifs standard de culture de tissus sont d&#39;Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

L&#39;importance des trois dimensions (3D) de la topographie en influençant souches neurales et de cellules progénitrices (NPC) phénotype est largement reconnue mais difficile à étudier. Lorsque dissociée de cerveau embryonnaire ou post-natale, des PNJ unique prolifèrent en suspension pour former neurosphères. Les cellules filles au sein de ces cultures adoptent spontanément distinctes lignées de développement (neurones, oligodendrocytes, astrocytes et) au cours de l&#39;expansion en dépit d&#39;être exposés au même milieu extracellulaire. Cette progression de récapitule plusieurs des stades observés au cours de la neurogenèse et la gliogénèse en post-natal du cerveau et est souvent utilisé pour étudier la biologie NPC de base dans un environnement contrôlé. Évaluation de l&#39;impact complet de la topographie 3D et de positionnement au sein de ces cultures cellulaires sur le sort de NPC est cependant difficile. Pour localiser et d&#39;identifier les protéines cibles lignées NPC par immunocytochimie, flottant neurosphères doit être plaquée sur un substrat ou coupes sériées. Ce traitement est nécessaire pour assurer perméabilisation cellulaire équivalent et l&#39;accès des anticorps à travers la sphère. En conséquence, les images 2D épifluorescence du cryocoupes ou reconstructions 3D confocale de Z-piles ne peuvent fournir de l&#39;information spatiale sur la position de la cellule au sein discrète physique ou numérique 3D et les tranches ne visualisez pas la position cellulaire dans la sphère intacte. Ici, pour réitérer la topographie de la culture et permettre Neurosphère analyse spatiale de l&#39;expression protéique à travers toute la culture, nous présentons un protocole pour l&#39;isolement, l&#39;expansion et la coupe de série de post-natals neurosphères hippocampique adapté à immunodétection épifluorescence ou confocale de protéines cibles. Connexin29 (Cx29) est analysée comme un exemple. Ensuite, en utilisant un hybride de l&#39;édition graphique et la modélisation 3D des logiciels appliqués rigoureusement à maintenir détails biologiques, nous décrivons comment ré-assembler le positionnement 3D structurelle de ces images et cartographier numériquement cellules marquées au sein de l&#39;Neurosphère complète. Cette méthodologie permet la visualisation et l&#39;analyse de la position cellulaire des protéines cibles et les cellules à travers la topographie de la culture 3D entier et facilitera une analyse plus détaillée des relations spatiales entre les cellules au cours de la neurogenèse et la gliogénèse in vitro. Les deux Imbeault et Valenzuela contribué de façon égale et doivent être considérés conjointe premiers auteurs.

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Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Ici, nous décrivons la façon de produire, développer et immunolabel postnatale hippocampique cellules progénitrices neurales (PNJ) en trois dimensions (3D) de la culture. Ensuite, en utilisant des technologies de visualisation hybride, nous montrons comment des images numériques de cryocoupes immunomarquées peut être utilisé pour reconstruire et cartographier la position spatiale des cellules à travers le immunopositives Neurosphère 3D complet.

Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

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Neuroscience

12.6K vues.  University of Ottawa. Ici, nous décrivons la façon de produire, développer et immunolabel postnatale hippocampique cellules progénitrices neurales (PNJ) en trois dimensions (3D) de la culture. Ensuite, en utilisant des technologies de visualisation hybride, nous montrons comment des images numériques de cryocoupes immunomarquées peut être utilisé pour reconstruire et cartographier la position spatiale des cellules à travers le immunopositives Neurosphère 3D complet.