Damos las gracias a Evan Dysart y Léonard Marc de asistencia técnica especializada en la producción y edición de vídeo, Matt Cooke para la asistencia en la recolección de datos, y Sarah Gelbard por su colaboración editorial de expertos. El trabajo fue financiado por subvenciones de funcionamiento del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR, RP 62626) para SALB, una Iniciativa para la Formación Estratégica en Salud programa de becas de investigación para SALB y SF (Programa de Formación en CIHR lipidómica neurodegenerativas, TGF 9.121), y la infraestructura el apoyo de la Fundación para la Innovación de Canadá y Ontario Innovación confianza a San Francisco. SI recibió una Beca de Ontario de Posgrado en Ciencia y Tecnología con la colaboración del Consorcio de Investigación del Parkinson. NV recibe un Instituto de Envejecimiento y el Programa de Formación en CIHR lipidómica neurodegenerativas post-profesional de la comunión. Agradecemos el apoyo de software educativo y técnico de AutoDesk investigación.

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Ottawa Cuidado de Animales Comité y el Consejo Canadiense de los Animales.

Este protocolo describe un procedimiento para la cultura y la serie cryosection post-natal NPCs del hipocampo, localizar la expresión de proteínas por inmunodetección, y, finalmente, reconstruir y analizar la posición topográfica de las células dentro de la inmunopositivas neuroesfera 3D completo. Mediante la combinación de la cultura de la biología celular y técnicas de procesamiento, las imágenes de microscopía (Openlab, improvisación y otros softwares de análisis de imágenes), las capacidades de software de edición gráfica (Adobe Photoshop), y la animación 3D y capacidades de composición de software (Autodesk Maya), se presenta una metodología para reconstruir el toda la composición celular de las culturas 3D de imágenes 2D de serie que permite la reconstrucción fiel de la posición de celular y expresión de la proteína a través de una cultura neuroesfera. Este protocolo se puede combinar con la misma eficacia para el registro y la reconstrucción de epifluorescencia secciones delgadas serial o confocal pilas Z-a través de las secciones más gruesas de serie. Debido a la expansión clonal de los PNJ en un solo recapitula la cultura neuroesfera muchas de las etapas observados a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis en post-natal del cerebro, el impacto de la estructura 3D representa un factor determinante de la APN destino importante en la descendencia expuesta al mismo medio experimental 1. La divergencia en el linaje y la expresión de proteínas en el núcleo y la periferia de las secciones neuroesfera serie sugiere que varios factores físicos como la posición de la celda, la tensión mecánica, y la fuerza de cizallamiento juegan un papel importante en la regulación de la biología NPC 2. Por otra parte, la expresión de la conexina proteínas, aquí analizados, se ha demostrado que el cambio, dependiendo de cuándo NPCs se cultivan como neuroesferas 3D en la suspensión o plateado sobre un sustrato de laminina funcional con la conexina la comunicación mediada alterado si las células son cultivadas en plástico y el sustrato o en 3D gratis flotante culturas 3. El impacto de la posición del móvil en el destino de la APN no está claro. Es un desafío técnico para analizar el impacto de la ubicación espacial dentro de la cultura en 3D sobre la biología de la APN, dado que la evaluación de antígenos de linaje y de proteínas de señalización requiere la interrupción de la arquitectura en 3D para permitir la permeabilización de las células y anticuerpos acceso a todas las células. Aquí mostramos que un método de visualización híbrida proporciona un medio para determinar si ciertas proteínas muestra única posición en la cultura localizaciones en 3D, se puede utilizar para inferir y prueba de función de la proteína y la regulación con respecto a la localización regional dentro de la neuroesfera, y, quizás lo más importante , proporciona los datos de posición necesarios para estudiar el impacto de la topografía en 3D y posicionamiento celular sobre el destino de la APN en la cultura en 3D.

* Todos los demás reactivos químicos estándar que figuran en el protocolo son de Sigma-Aldrich. Todos los demás reactivos de cultivo de tejidos son de Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

La importancia de tres dimensiones (3D) para influir en la topografía madre neuronales y células progenitoras (NPC) fenotipo es ampliamente reconocido todavía difíciles de estudiar. Cuando se disocian del cerebro embrionario o después del parto, los personajes solo se proliferan en la suspensión para formar neuroesferas. Células hijas dentro de estas culturas adoptan espontáneamente distintos linajes de desarrollo (neuronas, oligodendrocitos y astrocitos) en el transcurso de la expansión a pesar de estar expuesto al medio extracelular mismo. Este recapitula la progresión de muchos de los estadios observados a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis en post-natal del cerebro y se utiliza a menudo para estudiar la biología básica NPC en un entorno controlado. Evaluar el impacto completo de la topografía en 3D y posicionamiento celular dentro de estas culturas sobre el destino de la APN, sin embargo, difícil. Para localizar las proteínas diana y determinar los linajes NPC por inmunocitoquímica, de libre flotación neuroesferas se colocan sobre un sustrato o seccionado en serie. Este proceso es necesario para garantizar la permeabilización de células equivalentes y el acceso de anticuerpos a lo largo de la esfera. Como resultado, las imágenes 2D de epifluorescencia cryosections o reconstrucciones en 3D confocal de Z-pilas sólo puede proporcionar información acerca de la posición espacial de células en 3D discreta rebanadas físico o digital y no se visualiza la posición en el ámbito celular intacta. En este caso, reiterar la topografía de la cultura neuroesfera y permitir el análisis espacial de la expresión de la proteína a lo largo de toda la cultura, se presenta un protocolo para el aislamiento, la expansión, y la sección de serie de post-natal neuroesferas hipocampo adecuado para inmunodetección epifluorescencia o confocal de las proteínas diana. Connexin29 (Cx29) se analiza como un ejemplo. A continuación, utilizando un híbrido de edición gráfica y software de modelado 3D aplicado rigurosamente para mantener el detalle biológica, se describe cómo volver a montar el posicionamiento estructural en 3D de estas imágenes y mapa digital de las células marcadas en el neuroesfera completa. Esta metodología permite la visualización y análisis de la situación celular de las proteínas diana y las células a través de la topografía en 3D toda la cultura y facilitará un análisis más detallado de las relaciones espaciales entre las células a lo largo de la neurogénesis y gliogénesis in vitro. Ambos Imbeault y Valenzuela han contribuido por igual y deben ser considerados comparten la primera autoría.

Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Aquí se describe cómo producir, expandir y immunolabel postnatal las células del hipocampo progenitoras neuronales (CPN) en tres dimensiones (3D) la cultura. A continuación, utilizando las tecnologías híbridas de visualización, se demuestra cómo las imágenes digitales de cryosections immunolabelled se puede utilizar para reconstruir y mapa de la posición espacial de las células en todo el inmunopositivas neuroesfera 3D completo.

La localización de la proteína en 3D Cultura de células madre neurales: una metodología de visualización híbrida

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K vistas.  University of Ottawa. Aquí se describe cómo producir, expandir y immunolabel postnatal las células del hipocampo progenitoras neuronales (CPN) en tres dimensiones (3D) la cultura. A continuación, utilizando las tecnologías híbridas de visualización, se demuestra cómo las imágenes digitales de cryosections immunolabelled se puede utilizar para reconstruir y mapa de la posición espacial de las células en todo el inmunopositivas neuroesfera 3D completo.