Yapay membran besleme daha önce yapılmış olsa da, protokolümüzün kurulması daha kolaydır ve bazı değişikliklerle diğer kene türlerine uyarlanabilir. Suni membran beslemenin temel avantajı, hayvan besleme yoluyla mümkün olmayabilecek patojenlere ve tedavilere maruz kalmaya izin vermesidir. Bu yapay membran besleme sistemi, ideal fagostimülanlar ve ideal membran kalınlığındaki modifikasyonlar için bazı testlerle diğer eklembacaklı türlerine uygulanabilir.
Doğru membran kalınlığının üretilmesi biraz pratik gerektirir. Membran üzerindeki çeşitli yerlerdeki kalınlığı ölçmek için bir mikrometre kullandığınızdan emin olun. Laboratuvarımızda doktora sonrası araştırmacı olan Benjamin Cull, prosedürü göstermeme yardımcı olacak.
Başlamak için,% 70 etanol içeren bir kol standının cam bölmesi veya seramik kaplı metal tabanı gibi düz, gözeneksiz bir yüzeyi silin ve ardından tek bir plastik kaplama tabakasıyla örtün. Plastik ambalajın düz olduğundan ve kabarcıklar veya kırışıklıklar olmadığından emin olun. %100 rayon lens temizleme kağıdını hazırlanan yüzeye bantlayın.
Kağıdın dört tarafında da bantla düz ve hafif gergin olduğundan emin olun. 0010 sertlikteki silikon karışımını, silikon kitin her bir parçasının beş mililitresini tek kullanımlık bir kaba ölçerek hazırlayın. İki sıvıyı hafifçe karıştırın ve 1,5 mililitre altıgen ekleyin.
Karışım homojen hale gelene ve iyice karışana kadar karıştırmaya devam edin. Silikon karışımını lens kağıdının üzerine dağıtmak için küçük bir silecek kullanın ve silikonun lens kağıdına batırıldığından emin olmak için bir dakika bekletin. Sabit olarak, fazla silikonu, az miktarda aşağı doğru basınç kullanarak silecek ile yana doğru kazıyın.
Herhangi bir silikon çizgisini çıkarmak ve pürüzsüz bir tabaka oluşturmak için aşağı doğru basınç uygulamadan silecek ile ikinci bir geçiş yapın. Sadece larvalar için, besleme odasının üst kısmını birkaç kez Fluon floropolimer reçinesine batırın ve tutarlı bir tabaka oluşturmak için uygulamalar arasında kurumasını sağlayın. Membranı, kapalı kimyasal veya biyogüvenlik kabini gibi tozsuz bir ortamda en az 24 saat kürlenmeye bırakın.
Daha sonra, odaları membrana tutturmak üzere 30 sertlikteki silikon karışımını hazırlamak için eşit miktarda silikon karışımı A ve B'yi karıştırın. Polikarbonat odalarını silikon karışımına yaklaşık çeyrek inç batırın ve daha sonra bantların hiçbirinin üst üste binmemesine dikkat ederek membran tabakasına yerleştirin. Tutturulan silikonun en az 24 saat boyunca sertleşmesine izin verin.
Bir neşter kullanarak, bağlı odaların her birinin etrafındaki zarı dikkatlice kesin, kenarları kesin, böylece yanlarda fazla kazıma olmadan altı kuyucuklu plakanın bir kuyusuna düzgün bir şekilde sığabilir. Membran ilavesini en üst düzeye çıkarmak için odanın dışına yeterli malzemeye izin verin. Artık membranın küçük bir parçasını her köşeden ve membran tabakasının merkezinden kesin.
Plastik ambalajı her bir parçadan çıkarın ve ortalama membran kalınlığını belirlemek için parçaları bir mikrometre ile ölçün. Besleme odalarını, oda başına bir O-ring ile birlikte, sterilize etmek için en az 20 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlanacak bir cam kabın içine yerleştirin. Kullanmadan önce odaların soğumasını bekleyin.
Önceden hazırlanmış, otoklavlanmış membran odalarını çıkardıktan ve O-ringi etraflarına yerleştirdikten sonra, her odayı membranı örtmek için yeterli% 70 etanol ile doldurun. Altı kuyucuklu bir plakada beş dakika bekletin ve ardından oda ile membran arasında ve membranın kendisinde herhangi bir sızıntı olup olmadığına bakın. Etanol'ü odalardan boşaltın ve ardından bir biyogüvenlik kabini veya laminer akış davlumbazının içinde hava ile kurumasını bekleyin.
Kandaki tamamlayıcıyı ısıtmak ve aktive etmek için, 40 dakika boyunca 56 santigrat derecede ısıtın ve mekanik olarak defibrillenmiş sığır kanını litre glikoz başına iki gram ile destekleyin. Membran kuruduktan sonra, odanın içine yaklaşık 20 mikrolitre fagostimülan uygulayın ve odayı yüzeye yaymak için eğin. Fagostimülan kuruduğunda, keneleri bir fırça veya forseps ile odaya hızla ekleyin.
Su banyosundan gelen ısı yırtılmasına neden olabileceğinden üstünü parafilm ile kapatın. Daha sonra konik bir tüpe kuyu veya oda başına beş mililitre ısı ve aktif kan ekleyin ve 36 santigrat derece olarak ayarlanmış su banyosuna yerleştirin. Tüpe beş mililitre kan başına beş mikrolitre üç milimolar ATP ve 50 mikrolitre 100X penisilin streptomisin mantar bölgesi stoğu ekleyin ve 4.5 mililitre kanı altı kuyucuklu bir plakanın kuyusuna aktarın.
Odayı yavaşça kuyuya yerleştirin, oda üzerindeki O-ring yüksekliğini ayarlayın, böylece zar kanda oturur, ancak yan taraftaki kan seviyesi kuyunun üzerine çıkmaz. Daha sonra kan ve zar arasında hava kabarcığı oluşumunu önlemek için kuyuyu kana bir açıyla yerleştirin. Altı kuyucuklu plakanın kapağını besleme odalarının üzerine yerleştirin.
Hazneli altı kuyucuklu plakayı hazırlanan 34 santigrat derece su banyosuna ve kapağa yerleştirin. Kan tüpüne kuyucuk başına beş mikrolitre üç milimolar ATP ve 50 mikrolitre 100X penisilin streptomisin mantar bölgesi stoğu ekleyin ve 4.5 mililitre kanı daha önce gösterildiği gibi taze altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın. Kene haznesi ile altı kuyu plakasını su banyosundan çıkarın ve odayı kuyudan çıkarın.
Kanı çıkarmak için odanın dışını ve zarı 10 mililitre sterilize edilmiş 1X PBS ile durulayın. Otoklavlanmış filtre kağıdı kullanarak, fazla PBS'yi gidermek için membranı ve hazneyi nazikçe kurulayın. Odanın içinde çok fazla yoğuşma varsa, taze parafilm ile kapatmadan önce ıslak lekeleri otoklavlanmış filtre kağıdı ile kurulayın.
Ardından odanın üstündeki parafilmi değiştirin. Kene haznesini taze kanla yeni altı kuyucuklu plakaya yerleştirin ve gerekirse O-ring yüksekliğini ayarlayın. Plakadaki her oda için bu adımları tekrarlayın.
Son olarak, altı kuyu plakasının kapağını odaların üstüne yerleştirin ve yeni altı kuyu plakasını 34 santigrat derece su banyosuna geri taşıyın. Burada kısmen engorge edilmiş ixodes scapularis nimfleri ile devam eden bir besleme gösterilmektedir. Bağlantı bölgelerinin etrafındaki siyah veya kahverengi noktalar, fagostimülantı yapmak için yem sırasında ve sonrasında toplanabilen dondur.
Kısmen engorge ixodes scapularis nimfleri membrana bağlı olarak görülür. Burada engorged larva kalıbının bir kabuğu da görülebilir. Kene engorgement sayıları ve yumurta kütle ağırlıkları bu tabloda sunulmuştur.
Larva ve nimf engorgement deneysel koşullarında, bu teknikte kullanılan takviyelere ek olarak kana geyik organı homojenatı eklenmiştir. Burada, başarılı engorgement, ya bir sonraki canlı aşamaya başarılı bir şekilde erimiş engorge keneler ya da başarılı bir şekilde yumurta bırakan engorge dişiler olarak tanımlanmıştır. Lens kağıdına silikon uygularken kabul edilebilir kalınlık elde etmek pratik gerektirir, bu nedenle kullanmadan önce membranın kalınlığını ölçmek her zaman önemlidir.
Membran besleme, keneleri patojenlere veya antibiyotiklere maruz bırakabilir. Bunların kene biyolojisinin erime başarısı, yumurtlama ve hayatta kalma gibi yönleri üzerindeki etkileri yem sonrası değerlendirilebilir.
