Bu çalışma, NSF KARİYER CBET-0747615 tarafından finanse edildi. Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. , Rehberlik ve destek için Douglas H. Smith ve David F. Meaney.

1. Akson Streç Büyüme Biyoreaktör Sistemi Genel Bakış <ol><li> Nöronlar deneysel güçleri uygulamak için iki baskın yaklaşım kullanılmıştır. Ilk yaklaşım, kuvvetler tüm nöron (. Chetta, Kye ve ark 2010;. Lindqvist, Liu ve ark 2010 Lu, Franze et al 2006) uygulanır. İkinci yaklaşımda ise, kuvvetler akson büyüme konisi çekerek doğrudan uygulanır. Uzama için yürürlüğe eşikleri belirlemek için, cam iğneler kullanarak, bu ikinci yaklaşım, yeni bir akson (Lamoureux, Heidemann ve ark 2010; O&#39;Toole, Lamoureux ve ark 2008. Bernal, Pullarkat ve ark 2007) model oluşturma kullanılır olmuştur retraksiyon (Dennerll, Lamoureux ve ark 1989; Zheng, Lamoureux ve ark 1991;. Lamoureux, Zheng ve ark 1992) ve akson terminalleri (Siechen, Yang ve ark 2009) nörotransmitter kümeleme analiz etmek. Bu yöntem benzersiz bir doku mühendisliği uzantısı büyük sinir üretmek için geliştirilen otomatik bir Axon Streç Büyüme (ASG) biyoreaktör sistemi (Iwata, Browne ve ark 2006; Pfister, Iwata ve ark 2006) kullanarak oluşturur. Son zamanlarda, biyoreaktör sistemi, gerçek zamanlı olarak mikroskobik ASG (Loverde, Ozoka ve ark 2011) çalışmak için bir minyatür versiyonu geliştirdi . Burada, detay 9 gün protokolü (Tablo 1) şu anda biyoreaktörler hazırlamak ve rutin ASG gerçekleştirmek için kullanabilirsiniz. </li><li> Genel Çalışma: ASG biyoreaktör sistemi biyoreaktör odasına uzanan güçleri ve 3) bir adım motoru uygulamak için otomatik bir doğrusal hareket tablosu nöronlar kültür ve gergin bağımsız şerit (uzunlamasına kuyuları), 2) ile üç ana bileşenden, 1) oluşur streç büyüme (Şekil 1) kontrol yazılımı ile denetleyici sürücü. </li><li> Kısaca, biyoreaktör prototip imalat dikey freze makinesi (Bridgeport, Elmira, NY) kullanarak bir makine atölyesi yapıldı. Biyouyumluluk için, sterilizasyon kolaylığı ve dayanıklılık, iç biyoreaktör bileşenleri, 3 / 8 &quot;polyetheretherketone (PEEK) işlendi Şeffaf polikarbonat ışık mikroskobu ve kültürlerin görüş için izin kapakları için kullanılmıştır. Korozyona dayanıklı 316 paslanmaz çelik vidalar ve eksiksiz bir donanım montaj (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> Biyoreaktör odasının dış güçlerin manipülasyonuna (Şekil 2) için 3 şerit, şerit boyunca hücreleri manipüle ayarlanabilir çekme blok ve çıkıntılı çekme çubuklar oluşturan uzanan bir çerçeve oluşur . Nöronal kültürler çekme blok (Şekil 2 ve 3) tarafından desteklenen tek Aclar çekme kültür substratlar üzerine kaplanmıştır. Bir tek lamel sabit yüzey germe çerçevesi altında verdiği ve 3 şeritli yayılan. Önce germe, büyüme konisinin uzantısı üzerinden sabit bir yüzey üzerine kaplama nöronların aksonal süreçleri çekme substrat genişletmek gerekir. Akson nüfusu köprü substratlar sonradan çekme blok kontrol deplasman streç uğrayacaktır. </li><li> Otomatik doğrusal hareket tablosu bir delrin hizalama masaya monte edilmiş bir step motor (HT23-397, Uygulamalı Motion Ürünleri, Watsonville, CA) ve doğrusal hareket tablosu (MIPS-2-10-1.0mm, Servo Sistemler, Monteville, NJ) oluşur . . Biyoreaktör odası doğrusal hareket tabloya paralel bir tablo içinde oturtulur. Biyoreaktör odasına uzanan bir adaptör kullanılarak doğrusal hareket tablosu çekme çubuklar bağlanır. </li><li> Step motor sürücü denetleyicisi (Si 2035, Uygulamalı Hareket Ürünler) dahil Si Programlayıcı yazılımı kullanarak çekme substratların manipülasyon kontrol etmek için programlanmıştır. Aksonal streç kez yaşamak (. Pfister, Iwata ve ark 2006 Pfister, Iwata ve ark 2004) aralıklı küçük deplasman adımları bir dizi alarak kademeli bir biçimde uygulanır. Bu bilgisayar kontrollü bir sistem ASG için özelleştirilmiş profilleri programına yeteneği sağlar, ve hafta birkaç gün içinde sürekli deneyler için çok önemlidir. </li></ol> 2. Biyoreaktör Odası hazırlanması <ol><li> Nöron kültürü için tek çekme ve sabit kültür substratları hazırlayın: <ol><li> Çekme kültür substratları 8.5 kesilir Aclar film &quot;x 11&quot; yaprak (33C 2.0 milyon, Yapı Probe, West Chester, PA). Keskin bir bıçak kullanarak yaklaşık 0.5 x 2.5cm yüzeylerde kesme veya her iki tarafta en az 1-2mm boşluk izin şerit genişliği biraz daha kısa. </li><li> 1200 grit zımpara (McMaster Carr) kullanarak her iki taraftan çekme kültür yüzeylerin alt 1 / 3 üncü zımparalayın. Çekme yüzeylerde Zımpara lamel sabit yüzey üzerine çekme substratlar akson büyüme kolaylaştırır. </li><li> Aclar 5 x 7 cm parça Kes veya sabit substrat olarak hizmet (# 4865-1, Beyin Araştırma Laboratuvarları, Newton, MA) 1 numaralı cam lamel kullanın. </li><li> Temizlik incie kültürü seyreltilmiş Alconox çözümü ile yüzeyleri ve saflaştırılmış dH 2 O ile iyice durulayın </li><li> 30 dakika boyunca% 70 etanol daldırma kültür substratları sterilize edin. Substratları steril doku kültürü kaputu içinde kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> Biyoreaktör odasına seyreltik Alconox ve otoklav ile sterilize otoklav bir konteyner içinde temizleyin. Otoklav hemen sonra, steril bir kaput transfer ve kurumaya bırakın. </li><li> : Steril davlumbaz, tutkal içinde devam eden kültür substratları Silikon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) ve steril pamuk kullanarak biyoreaktör bezlerden (McMaster Carr) uçlu <ol><li> Tam dik pozisyonda, kumlanmamış kısmını çekme blok bacaklar tutkal çekme kültür substratları çekme blok bacaklar. Zımparalanmış kültür yüzeyi ile temasından kaçının. </li><li> Tutkal biyoreaktör odasının altındaki sabit kültürü substrat. </li><li> Yapıştırılmış substratlar karşı kuru bir çubukla hafifçe basılarak fazla tutkal ve hava keseciklerinin çıkarın. </li><li> Biyoreaktör nöronlar için toksik Silikon RTV leaches asetik asit bu yana, kaput içinde nöronal kültürleri tanıtmak için önce 2 tam gün boyunca UV ışık altında kurumaya bırakılır. </li></ol></li><li> 2-3mm zımparalanmış çekme yüzeylerde ve sabit yüzey uçları arasında bir örtüşme ulaşmak için çekme blok bacaklar indirin. Crucial dikkat örtüşme boyutu çok büyükse, çekme substratların ipuçları sabit zemin kapalı saptırmak, ödenmiş olması gerekir; örtüşme (Şekil 3) yayılan akson sayısının azaltılması. </li><li> Biyoreaktör içinde retrakte çekme çubuklar, çekme blok başlangıç ​​pozisyonuna yerleştirin. Büyüme germek için önce çekme çubuklar hareket etmesini önlemek için immobilizasyon vidalarını sıkın. </li></ol> 3. Nöronal Kültürler <ol><li> 10 mcg / ml yüksek molekül ağırlıklı serum substrat arayüzü alanında her sokağın özgür medya poli-d-lisin (kedi # 354.210, BD, Bedford, MA) Havuzu 1mL. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle rahatsız uymak çözüm izin ver. DH 2 O, son bir kültür ortamı ile durulayın takip hafifçe 3x durulayın. Pipetleme substrat arayüzü uzak, şerit arka yapılmalıdır. </li><li> E16 sıçan yavru bir Dorsal Kök Ganglia eksplantlar (DRG) yalıtın. Bir stereomikroskopta kullanarak, petri kaplarına kullanarak damla eksplantlar sulandırmak. Zımparalanmış çekme kültür substrat kenarına 100 mcL pipet ve plaka kullanılarak 3-4 eksplantlar toplayın. Bakım plakası küçük bir su birikintisi bir ortam kullanarak çekme substrat kenarında eksplantlar alınmalıdır. Kültür ortamı hat başına 1 ml eksplant hareketini sınırlayan birkaç saat için buharlaşmasını önlemek için yeterli. Medya formülasyon: B-27 + 0.5mm L-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA),% 1 FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glikoz (G-7528, Sigma, St ile Neurobasal Louis, MO), 20ng/mL NGF (13.290-010, Invitrogen) ve 20 mcM FDU + 20 mcM üridin mitoz inhibitörleri (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Kapağı takın ve hücreleri uymak kadar 1 saat veya bir kuluçka biyoreaktör transfer. </li><li> Biyoreaktör eksplantlar dislodgment önlemek için uzak noktada kültür ortamı ile doldurun. Nöronlar sabit bir yüzey üzerine aksonal süreçleri uzatmak 5 gün en az biyoreaktör inkübe edin. </li></ol> 4. Akson Streç Büyüme <ol><li> Biyoreaktör steril bir kaput içinde son hazırlık prosedürleri uğrar: <ol><li> Odası ve kültür ortamı sınırı buharlaşma nemlendirmektir fosfat tamponlu salin ile biyoreaktör içinde rezervuarları doldurun. Bizim sistemde, oyulmuş muhafaza duvarları rezervuar olarak hizmet vermektedir. Alternatif olarak, küçük petri kapaklarının kültür şerit tepesinde çekme blok her iki tarafında yer alabilir. </li><li> Kültür ortamı değiştirin ve kapasite şerit doldurun. Pipetleme substrat arayüzü uzak, şerit arka yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Seat biyoreaktör otomatik doğrusal hareket tablo içinde. Deney bir kuvöz içinde çalıştırmak için ise, otomatik doğrusal hareket tablosu olası korozyon nedeniyle nemlendirilmelidir olmamalıdır. </li><li> Çekme çubukların çekme çubuk adaptörü sabitleyin. </li><li> Çekme çubuk adaptörü ile uyum ve sahneye tutturmak için doğrusal hareket tablosu aşamasında jog Si Programcı yazılımı kullanarak. Kolaylık sağlamak için, belirli aralıklarla sahne işlemek için önceden Si Programcı dizileri hazırlamak. </li><li> Çekme blok serbest dolaşımına izin biyoreaktör odasına immobilizasyon vidayı gevşetin. </li><li> Streç kez yaşamak (Pfister, Iwata ve ark 2006) aralıklı küçük deplasman adımları bir dizi başlatarak, kademeli bir biçimde uygulanır . Paradigma, her 172 saniyede bir 2 mikron adımları alarak başlar.24 saat boyunca net 1mm streç. Bir gün sonra, streç oranı yerinden artan ya da azalan bekleme süresi (Tablo 2) şaha kalkmış olabilir. </li><li> ASG başlatılır sonra, medya değişiklikleri genellikle gerekli değildir. Ancak zaman içinde, kültür ortamı genellikle asidik döner ve sarımsı bir renk değişimi ile açıktır. Daha fazla deney gerekiyorsa, eski medya kayan aksonlar travma en aza indirmek için tamamen boşaltılır, ancak yerine sadece kısmen değişti asla. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Aksonal süreçleri, son derece hızlı ve sağlam streç büyüme tabi. Başlangıçta, bu süreç, küçük, seyrek değiştirmeler oluşur (≤ 1mm/day) yavaş uzanan bir dönemi ile başlar. Ilk 24 saat içinde germe, nöronal büyüme yollarının mechanotransduction oluşur, bu sayede nöronların akson silindir ek başlar. Sürekli ASG 24 saat içinde, aksonlar, daha fazla ve daha sık değiştirmeler artan bir tolerans göstermektedir. Genel olarak, aksonlar 1mm/day her 12-24 saat streç oranı (; Pfister, Bonislawski ve ark 2006;. Pfister, Iwata ve ark 2006 Pfister, Iwata ve ark 2004) bir artış dayanabilir. Ancak, çok yakında streç hızının artırılması seçin akson daha hızlı büyümesine neden olabilir ama aynı zamanda kopukluk neden patolojik oklüzyon yol açacaktır. Streç büyüyen aksonlar eğilimi fasiküller mimarisini andıran, demetleri oluşturmak için var. Mevcut protokolleri kullanarak, akson demetleri merkezi, streç yetiştirilen kısmı kültürünü yüzeye yapışıklıklar var. Streç büyüyen aksonlar Sadece başlangıçta yapıştırılır, proksimal ve distal segmentleri kültürünü yüzeye bağlı kalır. Buna göre, streç yetiştirilen aksonları orta kısmında serbestçe yüzen ve kullanımdan dolayı bozulma duyarlıdır. Çeşitli nedenlerle, bazı aksonlar uygulanan streç oranında büyümek değil. Örneğin, iki aksonal süreçleri ile DRG nöron, streç geçiren her ikisi de, yeterli protein çevirmek ve uygulanan gerilme oranı büyümeye mümkün olmayabilir. Uygulanan streç barındıramaz Aksonlar Poisson etkisi ince. Müteakip streç patolojik kopukluk önde gelen aksonlar, inhibe montaj tıkanıklığı neden olacaktır. Akson çoğunluğu, ancak, başarılı bir şekilde ASG geçmesi ve akson sadece küçük bir yüzdesi bu budama gibi sürecinden geçmeleri. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Şekil 1 Axon Stretch Büyüme Biyoreaktör Sistemi: (A) Biyoreaktör kültür odası ve Otomatik doğrusal hareket tablo, (B) Adım motor sürücü denetleyicisi ve Si Programlama yazılımı . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Şekil 2 Biyoreaktör Kültür Odası. Bu karikatür kaldırıldı kapaklı üst biyoreaktör odasına gösteriyor. Çekme blok pozisyonu akson streç büyüme son dönem yansıtır. Streç yetiştirilen aksonlar kültür şerit içinde demetler halinde görülebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Şekil 3. Kültür Yüzey Kaplama Arayüzü. Bu karikatür yan görünümden biyoreaktör her kulvarın içinde çekme mekanizmasının bileşenleri gösteriyor. Çekme ve sabit kültür yüzeylerin (Üst) Doğru örtüşmektedir. (Altta) çekme ve sabit yüzeyler aşırı üst üste çekme substrat ucu kıvrılmasına neden olur. Movie 1 Biyoreaktör Odası Kültür Substratlar Eklenti <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Movie 2 Çekme Yüzeyler üzerine eksplantlar DRG Kaplama <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 3 SiProgrammer Kullanımı <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 4 Sabit Yüzey üzerine Büyüme Koni Uzatma <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 5 Axon Streç Büyüme <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Gün </td><td> Adım </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilizasyon ve kuruma </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Yapıştırma &amp; Montaj </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Kaplamalar ve Nöronal Kültür Kaplama</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Streç Büyüme Başlat </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Deney Programı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Zaman [saat] </td><td> Streç Oranı [mm / gün] </td><td> Bekleme Süresi [s] </td><td> Toplam Uzunluk [mm] </td><td> Toplam Streç Time [gün] </td></tr><tr><td> Gösteriş </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Streç Rate Programı. Tüm streç adımları deplasman 2 mikron (10 step motor adım = 2 mikron streç).

<ol>
	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+axons.">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons.">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration.">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li><li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neural+growth:+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler.">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth.">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development.">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li><li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomechanics+of+axonal+development.">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li><li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions.">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li><li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon.">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li><li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces.">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li><li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+(Muller)+cells:+sensing+and+responding+to+tissue+stretch.">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li><li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons.">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , (2011).</li><li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals.">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li><li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair:+Surgical+Applications,+State+of+the+Art,+and+Future+Challenges.">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons.">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li><li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals.">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

Nöronal hücrelerin ex vivo mekanik uzama ABD Patent # 6264944 ve 7429267 altında patentli.

İki kritik adımlar biyoreaktörlerin hazırlanması sırasında dikkat edilmelidir. İlk olarak, substrat arayüzü optimal bir örtüşme aksonlar sabit bir yüzey üzerine çapraz sağlamak için gerekli. Aşırı kıvrılmış veya başka bir şekilde kusurlu Aclar (Şekil 3) kullanılmamalıdır. Örtüşme optimize etmek için, çekme substrat 2-3mm uzun temas üzerinden sabit zemin düzgün eşit zımparalanmış ve rehber olduğunu onaylayın. Üst üste çekme bacaklar yüksekliği dikkatlice ayarlayarak her deney öncesinde optimize edilmelidir. İkincisi, nöronların tutturulması için sağlarken, substrat boyalar aksonlar (Pfister, Iwata ve ark, 2004;. Loverde, Ozoka ve ark 2011 Heidemann ve Buxbaum 1990) biyoreaktör ve kontraktil gerginlik değiştirmesinden kaynaklanan önemli Sheering güçlerine dayanma. Substratlar lisin kaplama öncesinde ve sonrasında her iki steril su ile iyice durulanması gerekir. Kaplamalar taze çözülmüş alikotları uygulanan ve mümkün olduğu kadar eşit bir şekilde yayılmış olmalıdır. Yüzeylerde yapışma döneminde önemlisi, hareket ettirilebilir olmamalı veya başka bir şekilde rahatsız. Bir sonraki adımda, kaplama sırasında substratlar ile temasından kaçınmak ve şeritlerinin substrat arayüzü uzak uzak sonundan itibaren tüm çözümler pipetlemeyin. Her biyoreaktör bileşeni bağlantıları toleranslar bolluk şeklinde tezahür edebilir. Otomatik doğrusal hareket tablosu hareketi çekme blok hareketi olmadan oluşur ASG ilk dönemde, sistem bolluk açıktır. Slack Deneme başına değişir, ancak bizim deneyim genellikle &lt;1mm. Bu nedenle, bir &quot;ön-gerilim&quot; 1mm/day, gevşek eliminasyon fazı, bir gün, biyoreaktör parçalar çekme yüzeylerde hareketi sırasında meşgul ve başlamak ASG program önce gelir. Otomatik doğrusal hareket tablosu yerinden adım öncesi gerginlik aşamasından sonra çekme blok yerinden eşleşmiyorsa Sorun Giderme gerekebilir tamamlandı. , Çekme blok Asenkron, yanlış değiştirmeler &#39;stiction&#39; ya da statik sürtünme ve çekme donanım içinde adaptörün esneme ile ilişkilidir. Meydana gelen bu sorunları önlemek için, çekme blok hareketi pürüzsüz yakın zahmetsiz hareketi için, montajdan sonra, el ile kontrol edilmelidir. Bağlama oluşursa, çekme montaj deneye önce serbest olmalıdır. Adaptörün yeterli sertliği de çekme donanım stiction üstesinden gelmek değildir, doğru, eş zamanlı değiştirmeler sağlamak için gerekli.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> PolyEtherEtherKetone (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Özel biyoreaktör kamara yaptı </td></tr><tr><td> Polikarbonat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Özel biyoreaktör odasına kapak yaptı </td></tr><tr><td> Step motor </td><td> Uygulamalı Hareket Ürünleri, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Doğrusal hareket tablosu </td><td> Servo Sistemler, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Step motor sürücü denetleyicisi </td><td> Uygulamalı Hareket Ürünleri, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Yapısı Probe A.Ş., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Çekme kültür yüzeylerde </td></tr><tr><td> No. 1 lamel </td><td> Beyin Araştırma Laboratuvarları, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Yerleşik kültür substrat </td></tr><tr><td> Silikon RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Pamuklu çubuklar </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lizin </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Presinaptik embriyonik gelişim sırasında, nöronal süreçler, büyüme koni aracılığıyla hedeflerine ulaşmak için kısa mesafelerde hareket. Zamanla, nöronal somata nedeniyle iskelet büyütme organizmanın büyüme (. Gri, Hukkanen ve ark 1992 Weiss 1941) akson terminallerinin ayrılır. Bu mechanotransduction indükler akson sürekli uzama uyum yeteneğine nöronal büyüme ikincil bir mod (Bray 1984; Heidemann ve Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux ve ark 1995, Pfister, Iwata ve ark 2004). Akson Streç Büyüme (ASG) makul uzun sinirler ve yetişkin sinir sisteminin karakteristik beyaz cevher yollarında kısa embriyonik süreçlerin olgunlaşması merkezi bir faktördür. In vitro ASG çalışma için, biyoreaktörler nöronal kültürlerin kısa aksonal süreçler (Loverde, Ozoka ve ark 2011) gerilim uygulamak için tasarlanmış. Burada, ayrıntılı biyoreaktörler hazırlamak ve ASG yürütmek için kullandıkları yöntemleri. İlk olarak, biyoreaktör her uzanan şerit içinde, nöronlar, bir mikro-manipüle çekme substrat üzerine kaplanmıştır. Sonra, nöronlar sabit bir yüzey üzerine, büyüme konisinin uzantısı ile, onların aksonal süreçleri yeniden. Son olarak, streç büyüme, sabit bir yüzeye yapıştırılır akson terminalleri kaplama hücre gövdeleri uzaklıkta çekme yapılır; büyüme konisinin uzantısı sonra iskelet büyüme yansıtan. Önceki iş uzunlukları 10cm kadar ulaşan, embriyonik sıçan dorsal kök gangliyon nöronları ASG 10mm/day için eşi görülmemiş büyüme oranları kadar yetenekli olduğunu gösterdi, eş zamanlı olarak artan aksonal çaplarda (Smith, Wolf ve ark 2001, Pfister, Iwata ve ark 2004; Pfister, Bonislawski ve ark 2006, Pfister, Iwata ve ark 2006; Smith 2009). Bu rejeneratif büyüme konisinin uzantısı (mekanik uyaranların yokluğunda) büyüme oranları ile ortalama 1mm/day uzunlukları 3cm daha az sınırlı başarılı rejenerasyon (. Pfister, Gordon ve ark 2011 Fu ve Gordon 1997) dramatik bir zıtlık Buna göre, daha fazla çalışma ASG mekanik uyaranların yokluğunda rejenerasyon sınırı düzensiz büyüme mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth at JoVE.com

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K Görüntüleme.  New Jersey Institute of Technology. Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.