Bu çalışma, NSF KARİYER CBET-0747615 tarafından finanse edildi. Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. , Rehberlik ve destek için Douglas H. Smith ve David F. Meaney.

1. Akson Streç Büyüme Biyoreaktör Sistemi Genel Bakış <ol><li> Nöronlar deneysel güçleri uygulamak için iki baskın yaklaşım kullanılmıştır. Ilk yaklaşım, kuvvetler tüm nöron (. Chetta, Kye ve ark 2010;. Lindqvist, Liu ve ark 2010 Lu, Franze et al 2006) uygulanır. İkinci yaklaşımda ise, kuvvetler akson büyüme konisi çekerek doğrudan uygulanır. Uzama için yürürlüğe eşikleri belirlemek için, cam iğneler kullanarak, bu ikinci yaklaşım, yeni bir akson (Lamoureux, Heidemann ve ark 2010; O&#39;Toole, Lamoureux ve ark 2008. Bernal, Pullarkat ve ark 2007) model oluşturma kullanılır olmuştur retraksiyon (Dennerll, Lamoureux ve ark 1989; Zheng, Lamoureux ve ark 1991;. Lamoureux, Zheng ve ark 1992) ve akson terminalleri (Siechen, Yang ve ark 2009) nörotransmitter kümeleme analiz etmek. Bu yöntem benzersiz bir doku mühendisliği uzantısı büyük sinir üretmek için geliştirilen otomatik bir Axon Streç Büyüme (ASG) biyoreaktör sistemi (Iwata, Browne ve ark 2006; Pfister, Iwata ve ark 2006) kullanarak oluşturur. Son zamanlarda, biyoreaktör sistemi, gerçek zamanlı olarak mikroskobik ASG (Loverde, Ozoka ve ark 2011) çalışmak için bir minyatür versiyonu geliştirdi . Burada, detay 9 gün protokolü (Tablo 1) şu anda biyoreaktörler hazırlamak ve rutin ASG gerçekleştirmek için kullanabilirsiniz. </li><li> Genel Çalışma: ASG biyoreaktör sistemi biyoreaktör odasına uzanan güçleri ve 3) bir adım motoru uygulamak için otomatik bir doğrusal hareket tablosu nöronlar kültür ve gergin bağımsız şerit (uzunlamasına kuyuları), 2) ile üç ana bileşenden, 1) oluşur streç büyüme (Şekil 1) kontrol yazılımı ile denetleyici sürücü. </li><li> Kısaca, biyoreaktör prototip imalat dikey freze makinesi (Bridgeport, Elmira, NY) kullanarak bir makine atölyesi yapıldı. Biyouyumluluk için, sterilizasyon kolaylığı ve dayanıklılık, iç biyoreaktör bileşenleri, 3 / 8 &quot;polyetheretherketone (PEEK) işlendi Şeffaf polikarbonat ışık mikroskobu ve kültürlerin görüş için izin kapakları için kullanılmıştır. Korozyona dayanıklı 316 paslanmaz çelik vidalar ve eksiksiz bir donanım montaj (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> Biyoreaktör odasının dış güçlerin manipülasyonuna (Şekil 2) için 3 şerit, şerit boyunca hücreleri manipüle ayarlanabilir çekme blok ve çıkıntılı çekme çubuklar oluşturan uzanan bir çerçeve oluşur . Nöronal kültürler çekme blok (Şekil 2 ve 3) tarafından desteklenen tek Aclar çekme kültür substratlar üzerine kaplanmıştır. Bir tek lamel sabit yüzey germe çerçevesi altında verdiği ve 3 şeritli yayılan. Önce germe, büyüme konisinin uzantısı üzerinden sabit bir yüzey üzerine kaplama nöronların aksonal süreçleri çekme substrat genişletmek gerekir. Akson nüfusu köprü substratlar sonradan çekme blok kontrol deplasman streç uğrayacaktır. </li><li> Otomatik doğrusal hareket tablosu bir delrin hizalama masaya monte edilmiş bir step motor (HT23-397, Uygulamalı Motion Ürünleri, Watsonville, CA) ve doğrusal hareket tablosu (MIPS-2-10-1.0mm, Servo Sistemler, Monteville, NJ) oluşur . . Biyoreaktör odası doğrusal hareket tabloya paralel bir tablo içinde oturtulur. Biyoreaktör odasına uzanan bir adaptör kullanılarak doğrusal hareket tablosu çekme çubuklar bağlanır. </li><li> Step motor sürücü denetleyicisi (Si 2035, Uygulamalı Hareket Ürünler) dahil Si Programlayıcı yazılımı kullanarak çekme substratların manipülasyon kontrol etmek için programlanmıştır. Aksonal streç kez yaşamak (. Pfister, Iwata ve ark 2006 Pfister, Iwata ve ark 2004) aralıklı küçük deplasman adımları bir dizi alarak kademeli bir biçimde uygulanır. Bu bilgisayar kontrollü bir sistem ASG için özelleştirilmiş profilleri programına yeteneği sağlar, ve hafta birkaç gün içinde sürekli deneyler için çok önemlidir. </li></ol> 2. Biyoreaktör Odası hazırlanması <ol><li> Nöron kültürü için tek çekme ve sabit kültür substratları hazırlayın: <ol><li> Çekme kültür substratları 8.5 kesilir Aclar film &quot;x 11&quot; yaprak (33C 2.0 milyon, Yapı Probe, West Chester, PA). Keskin bir bıçak kullanarak yaklaşık 0.5 x 2.5cm yüzeylerde kesme veya her iki tarafta en az 1-2mm boşluk izin şerit genişliği biraz daha kısa. </li><li> 1200 grit zımpara (McMaster Carr) kullanarak her iki taraftan çekme kültür yüzeylerin alt 1 / 3 üncü zımparalayın. Çekme yüzeylerde Zımpara lamel sabit yüzey üzerine çekme substratlar akson büyüme kolaylaştırır. </li><li> Aclar 5 x 7 cm parça Kes veya sabit substrat olarak hizmet (# 4865-1, Beyin Araştırma Laboratuvarları, Newton, MA) 1 numaralı cam lamel kullanın. </li><li> Temizlik incie kültürü seyreltilmiş Alconox çözümü ile yüzeyleri ve saflaştırılmış dH 2 O ile iyice durulayın </li><li> 30 dakika boyunca% 70 etanol daldırma kültür substratları sterilize edin. Substratları steril doku kültürü kaputu içinde kurumaya bırakın. </li></ol></li><li> Biyoreaktör odasına seyreltik Alconox ve otoklav ile sterilize otoklav bir konteyner içinde temizleyin. Otoklav hemen sonra, steril bir kaput transfer ve kurumaya bırakın. </li><li> : Steril davlumbaz, tutkal içinde devam eden kültür substratları Silikon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) ve steril pamuk kullanarak biyoreaktör bezlerden (McMaster Carr) uçlu <ol><li> Tam dik pozisyonda, kumlanmamış kısmını çekme blok bacaklar tutkal çekme kültür substratları çekme blok bacaklar. Zımparalanmış kültür yüzeyi ile temasından kaçının. </li><li> Tutkal biyoreaktör odasının altındaki sabit kültürü substrat. </li><li> Yapıştırılmış substratlar karşı kuru bir çubukla hafifçe basılarak fazla tutkal ve hava keseciklerinin çıkarın. </li><li> Biyoreaktör nöronlar için toksik Silikon RTV leaches asetik asit bu yana, kaput içinde nöronal kültürleri tanıtmak için önce 2 tam gün boyunca UV ışık altında kurumaya bırakılır. </li></ol></li><li> 2-3mm zımparalanmış çekme yüzeylerde ve sabit yüzey uçları arasında bir örtüşme ulaşmak için çekme blok bacaklar indirin. Crucial dikkat örtüşme boyutu çok büyükse, çekme substratların ipuçları sabit zemin kapalı saptırmak, ödenmiş olması gerekir; örtüşme (Şekil 3) yayılan akson sayısının azaltılması. </li><li> Biyoreaktör içinde retrakte çekme çubuklar, çekme blok başlangıç ​​pozisyonuna yerleştirin. Büyüme germek için önce çekme çubuklar hareket etmesini önlemek için immobilizasyon vidalarını sıkın. </li></ol> 3. Nöronal Kültürler <ol><li> 10 mcg / ml yüksek molekül ağırlıklı serum substrat arayüzü alanında her sokağın özgür medya poli-d-lisin (kedi # 354.210, BD, Bedford, MA) Havuzu 1mL. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle rahatsız uymak çözüm izin ver. DH 2 O, son bir kültür ortamı ile durulayın takip hafifçe 3x durulayın. Pipetleme substrat arayüzü uzak, şerit arka yapılmalıdır. </li><li> E16 sıçan yavru bir Dorsal Kök Ganglia eksplantlar (DRG) yalıtın. Bir stereomikroskopta kullanarak, petri kaplarına kullanarak damla eksplantlar sulandırmak. Zımparalanmış çekme kültür substrat kenarına 100 mcL pipet ve plaka kullanılarak 3-4 eksplantlar toplayın. Bakım plakası küçük bir su birikintisi bir ortam kullanarak çekme substrat kenarında eksplantlar alınmalıdır. Kültür ortamı hat başına 1 ml eksplant hareketini sınırlayan birkaç saat için buharlaşmasını önlemek için yeterli. Medya formülasyon: B-27 + 0.5mm L-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA),% 1 FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glikoz (G-7528, Sigma, St ile Neurobasal Louis, MO), 20ng/mL NGF (13.290-010, Invitrogen) ve 20 mcM FDU + 20 mcM üridin mitoz inhibitörleri (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Kapağı takın ve hücreleri uymak kadar 1 saat veya bir kuluçka biyoreaktör transfer. </li><li> Biyoreaktör eksplantlar dislodgment önlemek için uzak noktada kültür ortamı ile doldurun. Nöronlar sabit bir yüzey üzerine aksonal süreçleri uzatmak 5 gün en az biyoreaktör inkübe edin. </li></ol> 4. Akson Streç Büyüme <ol><li> Biyoreaktör steril bir kaput içinde son hazırlık prosedürleri uğrar: <ol><li> Odası ve kültür ortamı sınırı buharlaşma nemlendirmektir fosfat tamponlu salin ile biyoreaktör içinde rezervuarları doldurun. Bizim sistemde, oyulmuş muhafaza duvarları rezervuar olarak hizmet vermektedir. Alternatif olarak, küçük petri kapaklarının kültür şerit tepesinde çekme blok her iki tarafında yer alabilir. </li><li> Kültür ortamı değiştirin ve kapasite şerit doldurun. Pipetleme substrat arayüzü uzak, şerit arka yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Seat biyoreaktör otomatik doğrusal hareket tablo içinde. Deney bir kuvöz içinde çalıştırmak için ise, otomatik doğrusal hareket tablosu olası korozyon nedeniyle nemlendirilmelidir olmamalıdır. </li><li> Çekme çubukların çekme çubuk adaptörü sabitleyin. </li><li> Çekme çubuk adaptörü ile uyum ve sahneye tutturmak için doğrusal hareket tablosu aşamasında jog Si Programcı yazılımı kullanarak. Kolaylık sağlamak için, belirli aralıklarla sahne işlemek için önceden Si Programcı dizileri hazırlamak. </li><li> Çekme blok serbest dolaşımına izin biyoreaktör odasına immobilizasyon vidayı gevşetin. </li><li> Streç kez yaşamak (Pfister, Iwata ve ark 2006) aralıklı küçük deplasman adımları bir dizi başlatarak, kademeli bir biçimde uygulanır . Paradigma, her 172 saniyede bir 2 mikron adımları alarak başlar.24 saat boyunca net 1mm streç. Bir gün sonra, streç oranı yerinden artan ya da azalan bekleme süresi (Tablo 2) şaha kalkmış olabilir. </li><li> ASG başlatılır sonra, medya değişiklikleri genellikle gerekli değildir. Ancak zaman içinde, kültür ortamı genellikle asidik döner ve sarımsı bir renk değişimi ile açıktır. Daha fazla deney gerekiyorsa, eski medya kayan aksonlar travma en aza indirmek için tamamen boşaltılır, ancak yerine sadece kısmen değişti asla. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Aksonal süreçleri, son derece hızlı ve sağlam streç büyüme tabi. Başlangıçta, bu süreç, küçük, seyrek değiştirmeler oluşur (≤ 1mm/day) yavaş uzanan bir dönemi ile başlar. Ilk 24 saat içinde germe, nöronal büyüme yollarının mechanotransduction oluşur, bu sayede nöronların akson silindir ek başlar. Sürekli ASG 24 saat içinde, aksonlar, daha fazla ve daha sık değiştirmeler artan bir tolerans göstermektedir. Genel olarak, aksonlar 1mm/day her 12-24 saat streç oranı (; Pfister, Bonislawski ve ark 2006;. Pfister, Iwata ve ark 2006 Pfister, Iwata ve ark 2004) bir artış dayanabilir. Ancak, çok yakında streç hızının artırılması seçin akson daha hızlı büyümesine neden olabilir ama aynı zamanda kopukluk neden patolojik oklüzyon yol açacaktır. Streç büyüyen aksonlar eğilimi fasiküller mimarisini andıran, demetleri oluşturmak için var. Mevcut protokolleri kullanarak, akson demetleri merkezi, streç yetiştirilen kısmı kültürünü yüzeye yapışıklıklar var. Streç büyüyen aksonlar Sadece başlangıçta yapıştırılır, proksimal ve distal segmentleri kültürünü yüzeye bağlı kalır. Buna göre, streç yetiştirilen aksonları orta kısmında serbestçe yüzen ve kullanımdan dolayı bozulma duyarlıdır. Çeşitli nedenlerle, bazı aksonlar uygulanan streç oranında büyümek değil. Örneğin, iki aksonal süreçleri ile DRG nöron, streç geçiren her ikisi de, yeterli protein çevirmek ve uygulanan gerilme oranı büyümeye mümkün olmayabilir. Uygulanan streç barındıramaz Aksonlar Poisson etkisi ince. Müteakip streç patolojik kopukluk önde gelen aksonlar, inhibe montaj tıkanıklığı neden olacaktır. Akson çoğunluğu, ancak, başarılı bir şekilde ASG geçmesi ve akson sadece küçük bir yüzdesi bu budama gibi sürecinden geçmeleri. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Şekil 1 Axon Stretch Büyüme Biyoreaktör Sistemi: (A) Biyoreaktör kültür odası ve Otomatik doğrusal hareket tablo, (B) Adım motor sürücü denetleyicisi ve Si Programlama yazılımı . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Şekil 2 Biyoreaktör Kültür Odası. Bu karikatür kaldırıldı kapaklı üst biyoreaktör odasına gösteriyor. Çekme blok pozisyonu akson streç büyüme son dönem yansıtır. Streç yetiştirilen aksonlar kültür şerit içinde demetler halinde görülebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Şekil 3. Kültür Yüzey Kaplama Arayüzü. Bu karikatür yan görünümden biyoreaktör her kulvarın içinde çekme mekanizmasının bileşenleri gösteriyor. Çekme ve sabit kültür yüzeylerin (Üst) Doğru örtüşmektedir. (Altta) çekme ve sabit yüzeyler aşırı üst üste çekme substrat ucu kıvrılmasına neden olur. Movie 1 Biyoreaktör Odası Kültür Substratlar Eklenti <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Movie 2 Çekme Yüzeyler üzerine eksplantlar DRG Kaplama <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 3 SiProgrammer Kullanımı <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 4 Sabit Yüzey üzerine Büyüme Koni Uzatma <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> Film 5 Axon Streç Büyüme <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">video izlemek için buraya tıklayın</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Gün </td><td> Adım </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilizasyon ve kuruma </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Yapıştırma &amp; Montaj </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Kaplamalar ve Nöronal Kültür Kaplama</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Streç Büyüme Başlat </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Deney Programı. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Zaman [saat] </td><td> Streç Oranı [mm / gün] </td><td> Bekleme Süresi [s] </td><td> Toplam Uzunluk [mm] </td><td> Toplam Streç Time [gün] </td></tr><tr><td> Gösteriş </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Germek </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Streç Rate Programı. Tüm streç adımları deplasman 2 mikron (10 step motor adım = 2 mikron streç).

<ol>
	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+axons.">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons.">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li><li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction.">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li><li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration.">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li><li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neural+growth:+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler.">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth.">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development.">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li><li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomechanics+of+axonal+development.">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li><li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions.">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li><li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon.">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li><li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces.">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li><li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+glial+(Muller)+cells:+sensing+and+responding+to+tissue+stretch.">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li><li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons.">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , (2011).</li><li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li><li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physical+model+of+axonal+elongation:+force,+viscosity,+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth.">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li><li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals.">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li><li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair:+Surgical+Applications,+State+of+the+Art,+and+Future+Challenges.">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons.">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li><li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals.">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li><li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts:+extremes+and+exploitations.">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

Nöronal hücrelerin ex vivo mekanik uzama ABD Patent # 6264944 ve 7429267 altında patentli.

İki kritik adımlar biyoreaktörlerin hazırlanması sırasında dikkat edilmelidir. İlk olarak, substrat arayüzü optimal bir örtüşme aksonlar sabit bir yüzey üzerine çapraz sağlamak için gerekli. Aşırı kıvrılmış veya başka bir şekilde kusurlu Aclar (Şekil 3) kullanılmamalıdır. Örtüşme optimize etmek için, çekme substrat 2-3mm uzun temas üzerinden sabit zemin düzgün eşit zımparalanmış ve rehber olduğunu onaylayın. Üst üste çekme bacaklar yüksekliği dikkatlice ayarlayarak her deney öncesinde optimize edilmelidir. İkincisi, nöronların tutturulması için sağlarken, substrat boyalar aksonlar (Pfister, Iwata ve ark, 2004;. Loverde, Ozoka ve ark 2011 Heidemann ve Buxbaum 1990) biyoreaktör ve kontraktil gerginlik değiştirmesinden kaynaklanan önemli Sheering güçlerine dayanma. Substratlar lisin kaplama öncesinde ve sonrasında her iki steril su ile iyice durulanması gerekir. Kaplamalar taze çözülmüş alikotları uygulanan ve mümkün olduğu kadar eşit bir şekilde yayılmış olmalıdır. Yüzeylerde yapışma döneminde önemlisi, hareket ettirilebilir olmamalı veya başka bir şekilde rahatsız. Bir sonraki adımda, kaplama sırasında substratlar ile temasından kaçınmak ve şeritlerinin substrat arayüzü uzak uzak sonundan itibaren tüm çözümler pipetlemeyin. Her biyoreaktör bileşeni bağlantıları toleranslar bolluk şeklinde tezahür edebilir. Otomatik doğrusal hareket tablosu hareketi çekme blok hareketi olmadan oluşur ASG ilk dönemde, sistem bolluk açıktır. Slack Deneme başına değişir, ancak bizim deneyim genellikle &lt;1mm. Bu nedenle, bir &quot;ön-gerilim&quot; 1mm/day, gevşek eliminasyon fazı, bir gün, biyoreaktör parçalar çekme yüzeylerde hareketi sırasında meşgul ve başlamak ASG program önce gelir. Otomatik doğrusal hareket tablosu yerinden adım öncesi gerginlik aşamasından sonra çekme blok yerinden eşleşmiyorsa Sorun Giderme gerekebilir tamamlandı. , Çekme blok Asenkron, yanlış değiştirmeler &#39;stiction&#39; ya da statik sürtünme ve çekme donanım içinde adaptörün esneme ile ilişkilidir. Meydana gelen bu sorunları önlemek için, çekme blok hareketi pürüzsüz yakın zahmetsiz hareketi için, montajdan sonra, el ile kontrol edilmelidir. Bağlama oluşursa, çekme montaj deneye önce serbest olmalıdır. Adaptörün yeterli sertliği de çekme donanım stiction üstesinden gelmek değildir, doğru, eş zamanlı değiştirmeler sağlamak için gerekli.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> PolyEtherEtherKetone (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Özel biyoreaktör kamara yaptı </td></tr><tr><td> Polikarbonat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Özel biyoreaktör odasına kapak yaptı </td></tr><tr><td> Step motor </td><td> Uygulamalı Hareket Ürünleri, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Doğrusal hareket tablosu </td><td> Servo Sistemler, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Step motor sürücü denetleyicisi </td><td> Uygulamalı Hareket Ürünleri, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Yapısı Probe A.Ş., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Çekme kültür yüzeylerde </td></tr><tr><td> No. 1 lamel </td><td> Beyin Araştırma Laboratuvarları, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Yerleşik kültür substrat </td></tr><tr><td> Silikon RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Pamuklu çubuklar </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lizin </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Presinaptik embriyonik gelişim sırasında, nöronal süreçler, büyüme koni aracılığıyla hedeflerine ulaşmak için kısa mesafelerde hareket. Zamanla, nöronal somata nedeniyle iskelet büyütme organizmanın büyüme (. Gri, Hukkanen ve ark 1992 Weiss 1941) akson terminallerinin ayrılır. Bu mechanotransduction indükler akson sürekli uzama uyum yeteneğine nöronal büyüme ikincil bir mod (Bray 1984; Heidemann ve Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux ve ark 1995, Pfister, Iwata ve ark 2004). Akson Streç Büyüme (ASG) makul uzun sinirler ve yetişkin sinir sisteminin karakteristik beyaz cevher yollarında kısa embriyonik süreçlerin olgunlaşması merkezi bir faktördür. In vitro ASG çalışma için, biyoreaktörler nöronal kültürlerin kısa aksonal süreçler (Loverde, Ozoka ve ark 2011) gerilim uygulamak için tasarlanmış. Burada, ayrıntılı biyoreaktörler hazırlamak ve ASG yürütmek için kullandıkları yöntemleri. İlk olarak, biyoreaktör her uzanan şerit içinde, nöronlar, bir mikro-manipüle çekme substrat üzerine kaplanmıştır. Sonra, nöronlar sabit bir yüzey üzerine, büyüme konisinin uzantısı ile, onların aksonal süreçleri yeniden. Son olarak, streç büyüme, sabit bir yüzeye yapıştırılır akson terminalleri kaplama hücre gövdeleri uzaklıkta çekme yapılır; büyüme konisinin uzantısı sonra iskelet büyüme yansıtan. Önceki iş uzunlukları 10cm kadar ulaşan, embriyonik sıçan dorsal kök gangliyon nöronları ASG 10mm/day için eşi görülmemiş büyüme oranları kadar yetenekli olduğunu gösterdi, eş zamanlı olarak artan aksonal çaplarda (Smith, Wolf ve ark 2001, Pfister, Iwata ve ark 2004; Pfister, Bonislawski ve ark 2006, Pfister, Iwata ve ark 2006; Smith 2009). Bu rejeneratif büyüme konisinin uzantısı (mekanik uyaranların yokluğunda) büyüme oranları ile ortalama 1mm/day uzunlukları 3cm daha az sınırlı başarılı rejenerasyon (. Pfister, Gordon ve ark 2011 Fu ve Gordon 1997) dramatik bir zıtlık Buna göre, daha fazla çalışma ASG mekanik uyaranların yokluğunda rejenerasyon sınırı düzensiz büyüme mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth at JoVE.com

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K Görüntüleme.  New Jersey Institute of Technology. Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.

Video: Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gümüş Tohum aracılığı Büyüme Yöntemi ile Altın Nanostar Sentezi

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Biyomühendislik

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Doku Değerlendirilmesinde Manyetik Rezonans Elastography Metodoloji Construct Büyüme Tasarlandı

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Gözenekli silisyum filmleri sinir büyüme faktörü taşıyıcı olarak tasarlama

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

Mechanobiyolojik Çalışmalar için Orbital Çalkalayıcıda Endotel Hücrelerinin 6 Kuyu Plakalarında Parçalanması

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...