Questo lavoro è stato finanziato dalla NSF CARRIERA cbet-0747615. Gli autori desiderano ringraziare Drs. Douglas H. Smith e David F. Meaney per il loro mentore e supporto.

1. Panoramica del sistema di bioreattori Stretch Axon crescita <ol><li> Due approcci predominanti sono stati utilizzati per applicare le forze sperimentale ai neuroni. Nel primo approccio, le forze vengono applicate al neurone intero (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). Nel secondo approccio, le forze vengono applicate direttamente l&#39;assone tirando il cono di crescita. Con aghi di vetro, quest&#39;ultimo approccio è stato utilizzato per la formazione del nuovo modello di assone (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O&#39;Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), individuare soglie vigore per allungamento e retrazione (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992) e di analizzare il clustering neurotrasmettitore nei terminali degli assoni (Siechen, Yang et al 2009).. Un unico estensione ingegneria dei tessuti di questo metodo è stato sviluppato per produrre nervo grande costruisce utilizzando un sistema automatizzato di crescita Stretch Axon (ASG) sistema di bioreattore (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Recentemente, abbiamo sviluppato una versione miniaturizzata del sistema bioreattore per lo studio ASG microscopicamente in tempo reale (Loverde, Ozoka et al. 2011). Qui, dettaglio il protocollo di 9 giorni (tabella 1) attualmente in uso per preparare ed eseguire bioreattori ASG di routine. </li><li> Il funzionamento generale: Il sistema bioreattore ASG è costituito da tre componenti principali: 1) una camera bioreattore con corsie indipendenti (allungata pozzi), dove sono coltivate neuroni e allungato, 2) una tabella automatica di movimento lineare di applicare forze stretching e 3) un motore passo passo il controller di unità con il software per controllare la crescita allungare (figura 1). </li><li> In breve, la fabbricazione di prototipi bioreattore è stata effettuata in un negozio di macchine utilizzando una macchina fresatrice verticale (Bridgeport, Elmira, NY). Per la biocompatibilità, la facilità di sterilizzazione e la durata, i componenti interni bioreattore sono stati lavorati da 3 / 8 &quot;(PEEK). Trasparente in policarbonato è stato usato per i coperchi per consentire la microscopia ottica e la visualizzazione delle culture. Anticorrosione 316 viti in acciaio inox e hardware completo l&#39;assemblea (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> La camera di bioreattore è composto da una struttura che si forma si estende 3 corsie, un blocco di traino regolabile che manipola le cellule attraverso i vicoli, e sporgenti barre di traino per la manipolazione esterna (figura 2). Culture neuronali sono placcati su supporti cultura usa e getta Aclar traino sostenuto dal blocco di traino (figure 2 e 3). Un substrato coprioggetto usa e getta stazionario si attacca alla parte inferiore del telaio che si estende e si estende su tutte e 3 le corsie. Prima dello stretching, i neuroni placcato deve estendere i processi assonale dal substrato di traino sul substrato fisso tramite l&#39;estensione del cono di crescita. La popolazione di assoni che colmare il substrati successive cui saranno soggetti tratto dallo spostamento controllo del blocco di traino. </li><li> La tabella automatizzati movimento lineare è costituito da un motore passo-passo (HT23-397, prodotti di movimento applicata, Watsonville, CA) e la tabella di movimento lineare (MIPS-2-10-1,0 millimetri, servosistemi, Monteville, NJ) montato a una tabella di allineamento in delrin . La camera di bioreattore è seduto nel tavolo parallelo al piano di movimento lineare. Le aste di traino che si estende dalla camera di bioreattore vengono fissati al tavolo movimento lineare utilizzando un adattatore. </li><li> La fase di controllo motore (Si 2035, Prodotti movimento Applicata) è programmato utilizzando il software incluso Si programmatore di controllare la manipolazione dei substrati di traino. Allungamento assonale è applicata in maniera graduale facendo una serie di passaggi di piccola cilindrata distanziati da tempi di permanenza (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Questo sistema computerizzato offre la possibilità di programmare profili personalizzati per l&#39;ASG, ed è essenziale per la continua sperimentazione di diversi giorni o settimane. </li></ol> 2. Preparazione del bioreattore Camera <ol><li> Preparare il substrato della cultura usa e getta di traino e fissi per la cultura neuronale: <ol><li> Substrati cultura traino sono tagliati da 8,5 &quot;x 11&quot; fogli di pellicola Aclar (33C 2,0 milioni, Sonda Struttura, West Chester, PA). Utilizzando una lama affilata tagliare i supporti a circa 0,5 x 2,5 centimetri, o leggermente inferiore alla larghezza delle corsie per consentire almeno 1-2mm distanza su entrambi i lati. </li><li> Carteggiare leggermente inferiore di 1 / 3 ° dei substrati cultura traino sui due lati con belle 1200-grana carta vetrata (McMaster Carr). Levigatura dei substrati traino facilita la crescita degli assoni dai substrati di traino sul substrato coprioggetti fermo. </li><li> Tagliare un 5 x 7 centimetri pezzo di Aclar o utilizzare un 1 coprioggetto di vetro No. servire come substrato fisso (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> ° puliziasubstrati cultura e con una soluzione diluita Alconox e risciacquare abbondantemente con purificata dH 2 O. </li><li> Sterilizzare l&#39;substrati cultura per immersione in etanolo al 70% per 30 minuti. Lasciare i substrati di aria secca all&#39;interno di una cappa sterile coltura di tessuti. </li></ol></li><li> Pulire la camera di bioreattore con diluire Alconox e sterilizzare in autoclave all&#39;interno di un contenitore di autoclave. Immediatamente dopo la sterilizzazione in autoclave, trasferimento in una cappa sterile e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Proseguendo all&#39;interno della cappa sterile, colla i substrati cultura al bioreattore utilizzando Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) e punta di tamponi di cotone sterile (McMaster Carr): <ol><li> Con le gambe blocco di traino nella loro posizione verticale pieno, colla i substrati cultura di traino per le gambe blocco di traino nella porzione non levigato. Evitare il contatto con la superficie levigata della cultura. </li><li> Incollare il substrato della cultura stazionaria al fondo della camera bioreattore. </li><li> Togliere la colla in eccesso e bolle d&#39;aria premendo leggermente un bastoncino asciutto contro i substrati incollati. </li><li> Poiché l&#39;acido acetico in silicone RTV liscivie che è tossico per i neuroni, il bioreattore viene lasciato ad asciugare sotto la luce UV all&#39;interno della cappa per 2 giorni interi prima di introdurre le culture neuronali. </li></ol></li><li> Abbassare le gambe blocco di traino per ottenere un 2-3mm sovrapposizione tra le punte delle levigato traino substrati e il substrato fermo. Attenzione cruciali devono essere pagate alla dimensione della sovrapposizione, se è troppo grande, le punte dei substrati trattore possono deviare fuori del substrato fisso, la riduzione del numero di assoni che abbracciano la sovrapposizione (figura 3). </li><li> Posizionare il blocco di traino nella posizione di partenza, con le barre di traino retratto all&#39;interno del bioreattore. Serrare le viti di immobilizzazione per evitare il movimento delle barre di traino prima di allungare la crescita. </li></ol> 3. Culture neuronale <ol><li> 1 ml pool di 10 mg / ml ad alto peso molecolare poli-d-lisina (cat # 354210, BD, Bedford, MA) nel siero-multimediale gratuito presso l&#39;area substrato interfaccia di ogni corsia. Lasciare che la soluzione di aderire indisturbato per 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare delicatamente 3x con dH 2 O, seguita da un risciacquo finale con terreni di coltura. Pipettaggio dovrebbero essere eseguite sul retro delle corsie, più lontano l&#39;interfaccia substrato. </li><li> Isolare espianti gangli dorsali (DRG) da un ratto E16 cucciolo. Utilizzando uno stereomicroscopio, diluire il espianti in gocce utilizzando piastre Petri. Raccogliere espianti 3-4 con una pipetta 100 microlitri e la piastra sul bordo del substrato levigato cultura traino. Bisogna fare attenzione al piatto del espianti ai margini del substrato di traino con una piccola pozza di media. Fino a 1 ml di terreni di coltura per corsia è sufficiente per evitare l&#39;evaporazione per diverse ore, limitando il movimento del espianti. Mezzi di formulazione: Neurobasal con B + 0,5 mm-27 L-Glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 G / L di D-glucosio (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) e 20 mM FDU + 20 mM inibitori della mitosi uridina (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Fissare il coperchio e trasferire il bioreattore di un incubatore per 1 ora o fino a quando le cellule aderiscono. </li><li> Riempire il bioreattore con terreni di coltura nel punto più lontano della espianti per evitare dislodgment. Incubare il bioreattore per un minimo di 5 giorni mentre i neuroni estendere i processi assonale sul substrato fermo. </li></ol> 4. Axon Stretch crescita <ol><li> Il bioreattore subisce le procedure di preparazione finale all&#39;interno di una cappa sterile: <ol><li> Riempire i serbatoi all&#39;interno del bioreattore con tampone fosfato per umidificare la camera di evaporazione e limite dei terreni di coltura. Nel nostro sistema, la cinta muraria scavata fungono da serbatoi. In alternativa, piccoli coperchi capsula di Petri possono essere collocati su entrambi i lati del blocco di traino in cima alla cultura corsie. </li><li> Sostituire il mezzo di coltura e riempire le corsie di capacità. Pipettaggio dovrebbero essere eseguite sul retro delle corsie, più lontano l&#39;interfaccia substrato. </li></ol></li><li> Sedile del bioreattore all&#39;interno della tabella automatizzati movimento lineare. Se l&#39;esperimento deve essere eseguito all&#39;interno di un incubatore, non deve essere umidificata per corrosione potenziali del tavolo automatico movimento lineare. </li><li> Fissare l&#39;adattatore per asta di traino per le barre di traino. </li><li> Utilizzando il software programmatore Si jog la fase della tabella di movimento lineare per allinearsi con l&#39;adattatore per asta di traino e fissarla sul palco. Per comodità, preparare le sequenze Si Programmatore in anticipo al fine di manipolare la scena con incrementi specifici. </li><li> Allentare le viti immobilizzazione sulla camera di bioreattore a consentire la libera circolazione del blocco di traino. </li><li> Stretch è applicata in maniera graduale iniziando una serie di passi di piccola cilindrata distanziati da tempi di permanenza (Pfister, Iwata et al. 2006). Il nostro paradigma inizia prendendo 2 passi micron ogni 172 secondi,risultante in un tratto netto di 1 millimetro in 24 ore. Dopo un giorno, il tasso di percorso può essere dilagato aumentando o diminuendo lo spostamento del tempo di sosta (tabella 2). </li><li> Una volta ASG è avviata, i cambiamenti dei media non sono normalmente richiesti. Nel corso del tempo, però, la cultura dei media in generale si acida ed è evidente da un cambiamento di colore giallastro. Se la sperimentazione è necessaria un&#39;ulteriore, vecchi media non è mai completamente svuotato, ma solo parzialmente modificati per minimizzare il trauma di assoni galleggiante. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Assonale può subire processi di allungare notevolmente la crescita rapida e robusta. Inizialmente, il processo inizia con un periodo di stretching lento (≤ 1mm/day) che consiste di piccoli spostamenti frequenti. Entro le prime 24 ore di stretching, meccanotrasduzione di percorsi di crescita neuronale si verifica, per cui i neuroni cominciano Oltre al cilindro dell&#39;assone. Entro 24 ore dalla ASG continuo, gli assoni mostrano una aumentata tolleranza verso gli spostamenti maggiori e più frequenti. In generale, gli assoni in grado di sopportare un aumento del tasso tratto di 1mm/day ogni 12-24 ore (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). L&#39;aumento del tasso di allungare troppo presto, però, può portare ad una crescita più rapida degli assoni selezionare, ma anche portare ad occlusione patologica che provoca la disconnessione. Stretch crescita assoni hanno la tendenza a formare fasci, simile all&#39;architettura di fascicoli. Utilizzando protocolli di corrente, la centrale, porzione tratto cresciuta di fasci di assoni non hanno aderenze al substrato culturale. Solo inizialmente aderito, i segmenti prossimale e distale del tratto crescita assoni rimangono attaccati al substrato culturale. Di conseguenza, la parte centrale del tratto assoni cresciuto fluttuare liberamente, e sono sensibili alle interruzioni a causa della manipolazione. Per una serie di motivi, alcuni assoni non possono crescere al tasso tratto applicata. Ad esempio, un neurone DRG con due processi assonale, che sono entrambi in fase di allungamento, non può essere in grado di tradurre le proteine ​​sufficienti e crescere al ritmo tratto applicata. Assoni che non può ospitare il tratto applicata sarà sottile seguente effetto Poisson. Allungamento successivo porterà alla occlusione degli assoni, montaggio inibendo, con conseguente disconnessione patologico. La maggior parte degli assoni, tuttavia, sono in grado di sottoporsi ASG con successo e solo una piccola percentuale di assoni sottoporsi a questo tipo di potatura processo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema Stretch Axon crescita bioreattore. (A) Bioreattore camera di cultura e automatizzato tavolo movimento lineare, (B) Fase motore regolatore e Si programmazione software. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Figura 2. Chamber Cultura bioreattore. Questa vignetta raffigura la camera bioreattore dall&#39;alto con il coperchio rimosso. La posizione del blocco di traino riflette lo stadio finale della crescita degli assoni tratto. Tratto assoni cresciuti può essere visto in fasci all&#39;interno della corsia cultura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Figura 3. Substrato interfaccia Cultura placcatura. Questa vignetta raffigura i componenti del meccanismo di traino all&#39;interno di ogni corsia del bioreattore da vista laterale. (Top) sovrapposizione corretta dei substrati cultura di traino e stazionari. (Basso) sovrapposizione eccessiva dei supporti di traino e stazionaria provoca la punta di un substrato di traino ad arricciarsi. Movie 1. Attaccamento di supporti Cultura Bioreattore Camera. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 2. Placcatura di DRG Espianti su substrati di traino. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 3. Utilizzo SiProgrammer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 4. Cono Estensione crescita sul substrato fisso. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 5. Crescita Stretch Axon. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Clicca qui per guardare il video</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Giorno </td><td> Passo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilizzazione ed asciugatura </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Incollaggio &amp; Assembly </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Rivestimenti e placcatura Cultura neuronale</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Inizio tratto di crescita </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Esperimento Pianificazione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tempo [hr] </td><td> Vota tratto [mm / giorno] </td><td> Tempo di sosta [s] </td><td> Lunghezza totale [mm] </td><td> Time Stretch totale [giorni] </td></tr><tr><td> Pretesa </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Tratto </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Stretch Pianificazione Rate. Tutte le fasi tratto di 2 micron di spostamento (10 punti = 2 motore passo-passo tratto micron).

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	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+axons.">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons.">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li><li>Dennerll, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

L&#39;ex-vivo allungamento meccanico delle cellule neuronali è brevettato Brevetto US # # 6264944 e 7429267.

A due passi critici devono essere osservate durante la preparazione di bioreattori. In primo luogo, una sovrapposizione ottimale a livello di interfaccia substrato è necessaria per garantire che gli assoni possono attraversare sul substrato fermo. Aclar che è eccessivamente arricciata o meno imperfetta, non deve essere utilizzato (figura 3). Per ottimizzare la sovrapposizione, verificare che il substrato di traino è levigato in modo uniforme e contatti del supporto fisso in modo uniforme su un 2-3mm superficie di contatto a lungo. La sovrapposizione deve essere ottimizzata prima di ogni esperimento con attenzione regolando l&#39;altezza delle gambe di traino. In secondo luogo, pur prevedendo l&#39;attaccamento dei neuroni, rivestimenti substrato di sostenere notevoli forze Sheering causato dallo spostamento della tensione bioreattori e contrattile degli assoni (Heidemann e Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Substrati devono essere risciacquati abbondantemente con acqua sterilizzata sia prima che dopo il rivestimento lisina. Rivestimenti devono essere applicati dalle aliquote appena scongelati e ripartite il più omogeneamente possibile. È importante sottolineare che i substrati non deve essere spostato o comunque disturbato durante il periodo di adesione. In passaggi successivi, evitare il contatto con i substrati durante la placcatura, e seminare tutte le soluzioni dal fondo delle corsie di distanza dal substrato interfaccia. Tolleranze nelle connessioni di ogni componente bioreattore può manifestarsi sotto forma di allentamento. Durante il periodo iniziale di ASG, allentamento del sistema è evidente come il movimento della tavola automatizzati movimento lineare avviene senza il movimento del blocco di traino. Slack può variare per ogni esperimento, ma è tipicamente &lt;1mm nella nostra esperienza. Per questo motivo, un &quot;pre-tensione&quot; fase di eliminazione lasco della 1mm/day, per un giorno, precede il programma di ASG durante il quale le parti bioreattore impegnarsi e iniziare il movimento dei substrati di traino. Risoluzione dei problemi può essere richiesto se il passaggio spostamento del tavolo automatizzati movimento lineare non corrisponde allo spostamento del blocco di traino dopo la fase di pre-tensione è completa. Asincrona, spostamenti imprecisi del blocco di traino sono associati con &#39;stiction&#39; o attrito statico all&#39;interno dell&#39;hardware di traino e la flessione della scheda. Per evitare questi problemi si verifichino, il movimento del blocco di traino devono essere controllati a mano, dopo il montaggio, per il liscio quasi senza sforzo il movimento. Se associazione si verifica, l&#39;assemblea di traino deve essere liberato prima della sperimentazione. Una sufficiente rigidità dell&#39;adattatore è necessario anche per assicurare precisione, gli spostamenti non sono sincroni superato stiction dell&#39;hardware traino.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del componente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> (PEEK) </td><td> McMaster-Carr Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Una soluzione su misura bioreattore da camera </td></tr><tr><td> Policarbonato </td><td> McMaster-Carr Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Una soluzione su misura coperchio della camera bioreattore </td></tr><tr><td> Motore passo-passo </td><td> Prodotti di movimento applicata, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Movimento lineare tavolo </td><td> Sistemi Servo, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Il controller di unità motore passo-passo </td><td> Prodotti di movimento applicata, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Struttura della sonda Inc., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Di traino della cultura substrati </td></tr><tr><td> N. 1 coprioggetto </td><td> Cervello Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Cultura substrato stazionario </td></tr><tr><td> Silicone RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Tamponi di cotone con punta </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Durante la pre-sinaptici sviluppo embrionale, i processi neuronali percorrere brevi distanze per raggiungere i loro obiettivi attraverso cono di crescita. Nel corso del tempo, somata neuronali sono separati dai loro terminali degli assoni a causa della crescita scheletrica dell&#39;organismo ingrandimento (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Questo meccanotrasduzione induce una modalità secondaria di crescita neuronale in grado di ospitare continuo allungamento degli assoni (Bray, 1984; Heidemann e Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004).. La crescita degli assoni Stretch (ASG) è plausibilmente un fattore centrale per la maturazione di processi di breve embrionale nei nervi lungo e tratti di sostanza bianca caratteristica del sistema nervoso adulto. Per studiare ASG in vitro, abbiamo progettato bioreattori per applicare la tensione ai processi brevi assonale di culture neuronali (Loverde, Ozoka et al. 2011). Qui, noi dettaglio i metodi che usiamo per preparare e condurre bioreattori ASG. In primo luogo, all&#39;interno di ogni corsia allungamento del bioreattore, i neuroni sono placcati su uno strato di micro-manipolazione di traino. Successivamente, i neuroni rigenerare i loro processi di assoni, tramite l&#39;estensione del cono di crescita, su un substrato fisso. Infine, la crescita tratto è eseguita da traino i corpi cellulari placcati lontano dai terminali dell&#39;assone aderito al substrato stazionaria; ricapitolando crescita scheletrica dopo l&#39;estensione del cono di crescita. Il lavoro precedente ha dimostrato che di ASG embrionale neuroni dei gangli spinali di ratto sono in grado di tassi di crescita senza precedenti fino a 10mm/day, raggiungendo lunghezze fino a 10 cm, mentre in concomitanza con conseguente aumento diametro assonale (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Questo è in drammatico contrasto con estensione rigenerativa cono di crescita (in assenza di stimoli meccanici), dove i tassi di crescita medi 1mm/day con rigenerazione successo limitato a lunghezze inferiori a 3 cm (Fu e Gordon 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). Di conseguenza, un ulteriore studio di ASG può aiutare a svelare i meccanismi di crescita sregolata che limitano la rigenerazione, in assenza di stimoli meccanici.

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Un unico metodo di ingegneria dei tessuti è stato sviluppato per allungare le fibre nervose in coltura da numerosi ricapitolando allungare la crescita degli assoni, una forma di crescita del sistema nervoso per cui i nervi allungare in concomitanza con la crescita del corpo ingrandimento.

Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K Views.  New Jersey Institute of Technology. Un unico metodo di ingegneria dei tessuti è stato sviluppato per allungare le fibre nervose in coltura da numerosi ricapitolando allungare la crescita degli assoni, una forma di crescita del sistema nervoso per cui i nervi allungare in concomitanza con la crescita del corpo ingrandimento.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Sintesi Nanostar oro con un metodo d&#39;argento crescita Seed Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Ricerca

Bioingegneria

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodologia Elastografia risonanza magnetica per la valutazione dei Tissue Engineered Construct crescita

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Preparazione di idrossi-PAAM idrogel per dissociare gli effetti di meccanotrasduzione Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Studiare la Stechiometria di Epidermal Growth Factor Receptor in cellule intatte con correlativa Microscopia

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Progettazione di film di silicio poroso come elementi portanti del fattore di crescita del nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

Segmentazione della crescita delle cellule endoteliali in piastre a 6 pozzi su uno shaker orbitale per studi meccanobiologici

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...