이 작품은 NSF 경력 CBET - 0747615에 의해 투자되었다. 저자 DRS 감사하고 싶습니다. 그들의 비열한 짓들을 및 지원에 대한 더글러스 H. 스미스와 데이비드 F. 미니.

1. 액슨 스트레치 성장 생물 반응기 시스템의 개요 <ol><li> 두 개의 주된 방법은 뉴런에 실험 세력을 적용하기 위해 이용되었다. 첫 번째 접근에서, 미군은 전체 신경 세포 (.; 체타, Kye 외 2010;.. Lindqvist, 리우 외 2010 류, Franze 외 2006)에 적용됩니다. 두 번째 접근에서 세력은 성장 원추 당겨 축삭에 직접 적용됩니다. 신장에 대한 강제 임계값을 식별, 유리 바늘을 사용하여,이 후자의 접근 방법은 새로운 축삭 (라무오, Heidemann 외 2010.,, 오툴, 라무오 외 2008.. 버널, Pullarkat 외 2007) 모델 형성하기 위해 사용되었습니다 그리고 철회 (Dennerll, 라무오 외 1989;. 정아, 라무오 외 1991;.. 라무오, 청 외 1992), 그리고 (. Siechen, 양 외 2009) 축삭 터미널에서 신경 전달 물질의 클러스터링을 분석합니다. 이 방법의 독특한 조직 공학 확장 큰 용기를 생산하기 위해 개발된 자동 액슨 스트레치 증가율 (ASG) 생물 반응기 시스템 (이와타, 브라운 외 2006..; 피스터, 이와타 외 2006)를 사용 구성. 최근 우리는 (Loverde, Ozoka 외. 2011) 실시간으로 미세 ASG 공부를 생물 반응기 시스템의 소형 버전을 개발했습니다. 여기, 우리는 자세하게 9 일 프로토콜 (표 1) 현재 bioreactors를 준비하고 일상적 ASG 수행하기 위해 사용합니다. </li><li> 전체 작업 : ASG 생물 반응기 시스템은 뉴런은 교양과 뻗어 아르 독립 차선 (길쭉한 우물), 2)와 생물 반응기 챔버 스트레칭 세력 및 3) ​​단계 모터를 적용하는 자동 직선 운동 테이블 세 가지 주요 구성 요소, 1)로 구성되어 있습니다 스트레치 성장 (그림 1)을 제어하는​​ 소프트웨어와 컨트롤러를 운전. </li><li> 간단히, 생물 반응기의 프로토 타입의 제작은 수직 밀링 머신 (브리지, 엘미라, NY)를 사용하여 기계 공장에서 수행되었다. biocompatibility 들어, 살균 및 내구성의 용이성, 내부 생물 반응기의 구성 요소는 3 / 8 &quot;polyetheretherketone (피크)에서 가공되었습니다. 투명 폴리 카보 네이트는 문화의 빛 현미경 및 볼 수 있도록 뚜껑을 위해 사용되었습니다. 내식성 316 스테인리스 나사 완벽한 하드웨어 어셈블리 (맥매스터 - 카, 엘므허스트, IL). </li><li> 생물 반응기 챔버는 외부 조작 (그림 2) 3 차선, 차선에 걸쳐 세포를 조작 조정 견인 차단하고, 튀어나온 견인 봉을 형성하는 스트레칭 프레임으로 구성되어 있습니다. 의 연결을 문화가 견인 블록 (그림 2 및 3)에서 지원하는 일회용 Aclar 견인 문화 기판에 도금입니다. 일회용 coverslip 고정 기판은 스트레칭 프레임의 하단에 부착하고 모든 3 차선을 펼쳐져. 이전 스트레칭으로, 도금 신경 성장 원추 확장을 통해 정지 기판에 견인 기판에서 axonal 프로세스를 확장해야합니다. 다리 기판이 후 견인 제어 블록의 변위에 의해 스트레치를 받게됩니다 axons의 인구. </li><li> 자동 직선 운동 테이블 delrin 정렬 테이블에 탑재 스테퍼 모터 (HT23 - 397, 응용 모션 제품, 와턴스빌, CA) 및 직선 운동 테이블 (MIPS - 2 - 10 - 1.0mm, 서보 시스템, 몬테빌, NJ)로 구성되어 있습니다 . 생물 반응기 챔버는 직선 운동 테이블 병렬 테이블 안에 앉아있다. 생물 반응기 챔버에서 연장 견인 막대는 어댑터를 사용하여 직선 운동 테이블로 고정됩니다. </li><li> 스텝 모터 드라이브 컨트롤러 (시 2,035, 응용 모션 제품)은 견인 기판의 조작을 제어하는 포함된시 프로그래머 소프트웨어를 사용하여 프로그램입니다. Axonal 스트레칭이 (..; 피스터, 이와타 외 2,006 피스터, 이와타 외 2004) 번 머물러하여 간격 작은 변위 일련의 단계를 복용하여 stepwise 방식으로 적용됩니다. 이 컴퓨터 제어 시스템은 ASG에 맞게 프로파일을 프로그램하는 능력을 제공하며, 주 며칠 동안 지속적인 실험을 위해 필수적입니다. </li></ol> 2. 생물 반응기 챔버의 준비 <ol><li> 의 연결을 문화 일회용 견인 및 고정 문화 기판 준비 : <ol><li> 견인 문화 기판은 8.5에서 버렸어요 Aclar 영화 &quot;X 11&quot;시트 (33C 2.0 달러, 구조 프로브, 웨스트 체스터, PA). 날카로운 칼날을 사용하면 약 0.5 X 2.5cm로 기판을 절단, 또는 양쪽에 최소한 1~2밀리미터 통과를 허용하기 위해 차선의 넓이보다 약간 짧아. </li><li> 살짝 모래 벌금 1200 그릿 샌드페이퍼 (맥매스터 카)를 사용하여 양쪽에서 견인 문화 기판의 아래쪽 3분의 1 차 있습니다. 견인 기판 샌딩하면 coverslip 정지 기판에 견인 기판에서 axons의 성장을 용이하게합니다. </li><li> Aclar의 5 X 7cm 부분을 잘라내거나 (# 4865-1, 뇌 연구 연구소, 뉴턴, MA)를 정지 기판 역할을하는 제 1 유리 coverslip을 사용합니다. </li><li> 클린 일전자 문화 희석 Alconox 솔루션으로 기판 및 정화 DH 2 O.로 철저히 씻어 </li><li> 30 분 70 % 에탄올에 집중하여 문화 기판을 소독. 기판은 멸균 조직 문화 후드 이내에 건조 공기를 허용합니다. </li></ol></li><li> 희석 Alconox 및 압력솥과 생물 반응기 챔버가 압력솥 컨테이너 내에 소독 청소. 즉시 autoclaving 후 멸균 후드로 전송하고 건조한 공기 수 있습니다. </li><li> : 멸균 후드, 접착제 내에 계속 실리콘 RTV (다우 코닝 # 732, 맥매스터 카) 및 멸균 면봉을 사용하여 생물 반응기에 문화 기판은 면봉 (맥매스터 카)를 밀고 <ol><li> 자신의 전체 수직 위치가 아닌 모래를 뿌린 부분에서 견인 블록 다리 접착제 견인 문화 기판의 견인 차단 다리. 모래를 뿌린 문화의 표면과 접촉을 피하십시오. </li><li> 생물 반응기 챔버의 바닥에 접착제가 정지 문화 기판. </li><li> 부드럽게 붙어 기판에 대한 마른 면봉을 누르하여 여분의 접착제 및 공기 주머니를 제거합니다. </li><li> 신경에 독성 실리콘 RTV의 리치스 초산 때문에, 생물 반응기는 이전의 연결을 문화를 소개하는 2 전체 일 동안 후드 내에서 자외선 아래에서 건조 남아 있습니다. </li></ol></li><li> 모래를 뿌린 견인 기판 및 정지 기판의 도움말 사이 2-3mm 중복을 달성하기 위해 견인 블록 다리를 낮춥니다. 중요한주의 너무 큰 경우, 견인 기판의 도움말을 정지 기판의에서 비켜 수 있습니다 중복의 크기에 지불되어야하며, 중복 (그림 3) 스팬 axons의 수를 감소. </li><li> 견인 막대 생물 반응기 내부의 철회와 함께 시작 위치에서 견인 블록을 위치. 성장을 스트레칭하기 전에 견인 막대의 움직임을 방지하기 위해 고정 나사를 조이십시오. </li></ol> 3. 문화의 연결 <ol><li> 10 μg / ML 높은 분자량 각 차선의 기판 인터페이스 영역에서 혈청 무료 미디어 폴리 - D - 라이신 (CAT # 354210, BD, 베드 포드, MA)의 풀 1mL. 실온에서 1 시간 동안 그대로 준수하는 솔루션을 허용합니다. 문화 미디어 헹굼 마지막 다음 DH 2 O와 부드럽게 씻어 배. Pipetting는 기판 인터페이스를 먼, 차선의 뒷면에서 수행되어야합니다. </li><li> 강아지 E16 쥐에서 도설 루트 신경의 explants (DRGs)을 분리. stereomicroscope 사용하여 배양 접시를 사용하여 방울로 explants를 희석. 모래를 뿌린 견인 문화 기판의 가장자리에 100 μL 피펫과 플레이트를 사용하여 3-4 explants를 수집합니다. 케어는 접시 미디어의 작은 웅덩이를 사용하여 견인 기판의 가장자리에 explants를 이동해야합니다. 최대 차선 당 문화 미디어 1mL하기 위해서 explants의 움직임을 제한하면서 몇 시간 동안 증발을 방지하기 위해 충분하다. 미디어 제제 : B - 27 + 0.5mM L - 글루타민 (Invitrogen, 칼스 배드, CA), 1 % FBS - HI (Hyclone, 월섬, MA), 2.5G / L D - 포도당 (G - 7528, 시그마, 세인트로 Neurobasal . 루이스, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) 및 20 μm의 FdU + 20 μm의 제품 유리딘의 mitotic 억제제 (F - 0503, U - 3003, 시그마). </li><li> 뚜껑을 부착하고 세포가 준수 때까지 1 시간 동안이나 인큐베이터로 생물 반응기를 전송합니다. </li><li> explants가 dislodgment을 피하기 위해 먼 지점에서 문화 매체와 생물 반응기를 입력합니다. 뉴런은 정지 기판에 axonal 프로세스를 확장하는 동안 오일 최소 생물 반응기를 품어. </li></ol> 4. 액슨 스트레치 성장 <ol><li> 생물 반응기는 살균 후드 내부의 최종 준비 절차를 겪습 : <ol><li> 인산염은 챔버 문화 미디어의 제한 증발을 ...을 축이다을 살린 버퍼와 생물 반응기 내에서 저수지를 입력합니다. 시스템에서 빈 인클로저 벽 저수지 역할을합니다. 또는, 작은 페트리 접시의 뚜껑은 문화 차선 위에 견인 블록의 양쪽에 게재될 수 있습니다. </li><li> 문화 미디어를 교체하고 용량 차선을 입력합니다. Pipetting는 기판 인터페이스를 먼, 차선의 뒷면에서 수행되어야합니다. </li></ol></li><li> 자동 직선 운동 테이블 내의 좌석 생물 반응기합니다. 실험 인큐베이터 내에서 실행되어야하는 경우, 그것은 자동 직선 운동 테이블의 잠재적인 부식으로 인해 humidified해서는 안됩니다. </li><li> 견인 막대에 견인 막대 어댑터를 고정. </li><li> 견인 막대 어댑터와 일치하고 무대에 고정하기 위해 직선 운동 테이블의 단계를 조깅시 프로그래머 소프트웨어를 사용합니다. 편의를 위해, 특정 단위로 무대를 조작하기 위해 사전에시 프로그래머 시퀀스를 준비합니다. </li><li> 견인 블록의 자유 운동을 허용하는 생물 반응기 챔버에있는 고정 나사를 풀어. </li><li> 스트레치는 (피스터, 이와타 외. 2006) 시간을 머물러하여 간격 작은 변위 일련의 단계를 시작하여 stepwise 방식으로 적용됩니다. 우리의 패러다임은, 2 μm의 단계마다 172초를 취하여 시작24시간 이상 NET 1mm 스트레치의 결과. 일일 후, 스트레치 속도는 변위를 증가하거나 면만 시간 (표 2)를 줄임으로써 ramped 수 있습니다. </li><li> 일단 ASG가 시작되어 미디어의 변화는 일반적으로 필요하지 않습니다. 시간이 지남에 그러나, 문화, 미디어는 일반적으로 산성 전환과 컬러의 노란 변경으로 분명하다. 추가 실험이 필요한 경우 이전 미디어 부동 axons에 외상을 최소화하기 위해 완전히 탈진 상태 없지만, 대신에 부분적으로만 변경 않습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : Axonal 프로세스는 매우 신속하고 강력한 스트레치 성장을 받아야 수 있습니다. 처음에는 프로세스가 작고, 드문 변위로 구성되어 그 (≤ 1mm/day) 느린 운동의 기간 시작됩니다. 스트레칭의 첫 24 시간 이내의 연결을 성장 경로의 mechanotransduction가 발생, 약자 뉴런이 축삭 실린더에 추가를 시작합니다. 연속 ASG 24 시간 이내에, axons는 더 크고 더 자주 변위에 증가하고 관용을 보여줍니다. 일반적으로 axons은 1mm/day 모든 12-24시간의 스트레치 속도 (.; 피스터, Bonislawski 외 2006;.. 피스터, 이와타 외 2,006 피스터, 이와타 외 2004)의 증가를 견딜 수 있습니다. 너무 빨리 스트레치 속도를 증가하지만, 선택 axons 더 빠른 성장으로 이어질 수 있습니다뿐만 아니라 분리의 원인이 병적인 폐색으로 이어질 것입니다. 스트레치 성장 axons는 경향이 fascicles의 구조를 닮은, 번들을 형성해야합니다. 현재 프로토콜을 활용, 축삭 번들의 중심, 스트레치 자란 부분은 문화 기판 할 adhesions가 없습니다. 신장 성장 axons만이 처음 준수, 근위 및 말초 구간 문화 기판에 붙어 남아 있습니다. 따라서, 스트레치 재배 axons의 중심 부분은 자유롭게 부유하고, 처리에 의한 방해에 민감합니다. 여러 가지 이유로 들어, 일부 axons은 적용 스트레치 속도로 성장할 수 없습니다. 예를 들어, 두 axonal 프로세스와 DRG의 신경 세포는 스트레치를 겪고 둘 중, 충분한 단백질을 번역하고 적용 스트레치 속도로 성장하지 못할 수 있습니다. 적용 스트레칭을 수용할 수없는 Axons는 포이슨의 효과가 다음과 같은 얇은 것입니다. 이후 스트레칭은 병적인 단절로 이어지는, axons, 억제 어셈블리의 폐색으로 이어질 것입니다. axons의 대다수는, 그러나 성공적으로 ASG 받아야 수 있으며, axons만을 작은 비율이 가지치기와 같은 프로세스를 받고있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> 그림 1. 액슨 스트레치 성장 생물 반응기 시스템. (A) 생물 반응기 배양 챔버 &amp; 자동 직선 운동 테이블, (B) 단계 모터 드라이브 컨트롤러와시 프로그래밍 소프트웨어. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> 그림 2. 생물 반응기 문화 상공 회의소. 이 만화는 제거 뚜껑과 상단에서 생물 반응기 챔버를 묘사. 견인 블록의 위치는 축삭 스트레치 성장의 마지막 단계를 반영합니다. 스트레치 성장 axons은 문화 차선 이내에 번들로 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> 그림 3. 문화 기판 도금 인터페이스를 제공합니다. 이 만화는 측면보기에서 생물 반응기의 각 레인 내에서 견인 장치의 구성 요소를 묘사. 견인 및 정지 문화 기판 (위) 정정 중복됩니다. (아래) 견인 및 정지 기판의 과도한 중복은 견인 기판의 끝부분이 곱슬 곱슬하게됩니다. 영화 1. 생물 반응기 상공 회의소에 문화 기판의 첨부 파일. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> 영화 2. 견인 기판에 Explants을 DRG의 도금이. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> 영화 3. SiProgrammer 사용가. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> 영화 4. 고정 기판에 성장 콘 확장. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> 영화 5. 액슨 스트레치 성장. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> <table border="1"><tbody><tr><td> 일 </td><td> 단계 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 살균 및 건조 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Gluing &amp; 어셈블리 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 코팅 &amp;의 연결을 문화 도금</td></tr><tr><td> 9 </td><td> 스트레치 성장 시작 </td></tr></tbody></table> 표 1. 실험 일정. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 시간 [시간] </td><td> 스트레치 속도 [mm / 일] </td><td> 시간 면만 [S] </td><td> 총 길이 [mm] </td><td> 총 스트레치 시간 [일] </td></tr><tr><td> 겉치레 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172.8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 스트레치 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172.8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 스트레치 </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86.4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 스트레치 </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57.6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 스트레치 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43.2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 스트레치 </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34.6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> 표 2. 스트레치 평가 일정. 모든 스트레치 단계 변위 2 μm의 (10 스텝 모터 단계 = 2 μm의 스트레치)입니다.

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	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. 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J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li><li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals.">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li><li>Smith, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

의 연결을 세포의 전 생체내 기계 신장은 미국 특허 # 6,264,944 및 # 7,429,267에 따라 특허입니다.

두 중요한 단계는 bioreactors의 준비 기간 동안 관찰해야합니다. 첫째, 기판 인터페이스에서 최적의 중복이 axons은 정지 기판에 간 수 있도록 필요합니다. 지나치게 드러하거나 불완전한 것입니다 Aclar은 (그림 3) 사용해서는 안됩니다. 중복을 최적화하려면, 견인 기판이 2-3mm 긴 연락처 패치를 통해 균일하게 정지 기판을 균일하게 모래를 뿌려 장식 및 연락처 있는지 확인합니다. 중복은 조심스럽게 견인 다리의 높이를 조정하여 사전에 각 실험을 최적화해야합니다. 둘째, 뉴런의 첨부 파일 제공함과 동시에, 기판 코팅 axons (; 피스터, 이와타 외 2004;.. Loverde, Ozoka 외 2,011 Heidemann 및 Buxbaum 1990)의 생물 반응기 및 수축성 긴장의 변위로 인한 상당한 쉬어링 세력을 유지. 기판 전에 리신 코팅하고, 이후 두 소독 물로 깨끗이 씻어서해야합니다. 코팅은 갓 해동 aliquots의 적용으로 고르게 가능한 보급하여야한다. 부착 기간 동안 중요한 기판은 이동하지 않아야하거나 방해. 이후 단계에서는 도금하는 동안 기판과의 접촉되지 않도록하고, 멀리 기판 인터페이스에서 차선의 맨 끝에서 pipet 모든 솔루션을. 각각의 생물 반응기 구성 요소의 연결에 허용 오차는 게으름의 형태로 매니 페스트 수 있습니다. 자동 직선 운동 테이블의 운동이 견인 블록의 움직임없이 발생으로 ASG의 초기 기간 동안 시스템에 이완은 분명하다. 슬랙 실험마다 다를 수 있지만, 우리의 경험에서 일반적으로 &lt;1mm입니다 수 있습니다. 이러한 이유로 들어, &quot;사전 긴장감&quot;1mm/day의 게으름 반감기는 하루, 생물 반응기 부품이 견인 기판의 움직임을 참여하고 시작하는 동안 ASG 일정을 앞에. 자동 직선 운동 테이블의 변위 단계 미리 장력 단계 후 견인 블록의 변위와 일치하지 않는 경우 문제 해결이 필요한 수하면 완료됩니다. 견인 블록의 비동기, 정확 변위는 &#39;stiction&#39;또는 정적 마찰이 견인 하드웨어 이내에 어댑터의 flexing과 연결되어 있습니다. 발생하는 이러한 문제를 방지하기 위해 견인 블록의 움직임이 원활하게 가까운 손쉽게 운동을 위해, 조립 후 수동으로 확인하여야한다. 바인딩이 발생하면 견인 조립은 실험하기 전에 해제되어야합니다. 어댑터의 충분한 강성도 견인 하드웨어의 stiction에 의해 극복되지 않은 정확한 동기 변위를 보장하기 위해 필요합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> PolyEtherEtherKetone (피크) </td><td> 맥매스터 - 카, 엘므허스트, IL </td><td> 8504K69 </td><td> 사용자는 생물 반응기 챔버했다 </td></tr><tr><td> 폴리 카보 네이트 </td><td> 맥매스터 - 카, 엘므허스트, IL </td><td> 8574K28 </td><td> 사용자는 생물 반응기 챔버 뚜껑을 만들어 </td></tr><tr><td> 스테퍼 모터 </td><td> 응용 모션 제품, 와턴스빌, CA </td><td> HT23 - 397 </td><td></td></tr><tr><td> 직선 운동 테이블 </td><td> 서보 시스템, 몬트빌, NJ </td><td> MIPS - 2 - 10 - 1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> 스텝 모터 드라이브 컨트롤러 </td><td> 응용 모션 제품, 와턴스빌, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> 구조 프로브 주식 회사, 웨스트 체스터, PA </td><td> 1859 </td><td> 견인 문화 기판 </td></tr><tr><td> 제 1 coverslip </td><td> 뇌 연구 연구소, 뉴턴, MA </td><td> 4865-1 </td><td> 고정 문화 기판 </td></tr><tr><td> 실리콘 RTV </td><td> 맥매스터 - 카, 엘므허스트, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> 커튼 - 날붙이 면봉 </td><td> 맥매스터 - 카, 엘므허스트, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - D - 라이신 </td><td> BD, 베드 포드, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

사전 시냅스 배아 발달 동안의 연결 프로세스는 성장 원뿔 통해 목표에 도달하는 짧은 거리를 통과. 시간이 지남에의 연결을 somata 인해 확대의 유기체의 골격 성장 (., 회색, Hukkanen 외 1,992 와이즈 1941)에 자신의 축삭 터미널에서 구분됩니다. 이 mechanotransduction은 축삭의 지속적인 신장을 수용할 수의 연결을 성장의 보조 모드 유도 (브레이 1984을, Heidemann하고 Buxbaum 1994, Heidemann, 라무오 외 1995;. 피스터, 이와타 외 2004.). 액슨 스트레치 증가율 (ASG)는 이대로 긴 신경 및 성인 신경계의 특성 흰색 물질 책자에 짧은 배아 프로세스의 성숙의 중심 요소이다. 체외에서 ASG 공부하기 위해, 우리는 문화의 연결의 짧은 axonal 프로세스 (Loverde, Ozoka 외. 2011)에 장력을 적용 bioreactors를 설계. 여기서는 세부 사항 우리가 bioreactors를 준비하고 ASG를 수행하는 데 사용하는 방법을. 첫째, 생물 반응기의 각 스트레칭 차선 내에서 뉴런은 마이크로 조작 견인 기판에 도금입니다. 다음 뉴런은 고정 기판에, 성장 원추 확장을 통해, 자신의 axonal 프로세스를 재생. 마지막으로, 스트레치 성장이 정지 기판을 준수 축삭 터미널에서 도금 세포 기관 멀리 견인에 의해 수행되며 성장 원뿔 확장 후 골격 성장을 recapitulating. 이전 작업은 10cm에 길이를 도달, 배아 쥐 등의 루트 신경의 뉴런의 ASG가 10mm/day에 전례없는 성장 속도까지 할 수있다 나타났습니다, 동시에 증가 axonal 지름의 결과로 동안 (스미스, 울프 외 2001;. 피스터, 이와타 외 2004;. 피스터, Bonislawski 외 2006;. 피스터, 이와타 외 2006;. 스미스 2009 년). . 이것은 재생 성장 원뿔 확장 (기계 자극의 부재에서) 성장률 3cm 미만의 길이로 제한 성공적으로 재생과 평균 1mm/day (.; 피스터, 고든 외 2,011 푸와 고든 1997)에 극적인 대조에 따라서, ASG의 진학은 기계적 자극의 부재에서 재생을 제한 dysregulated 성장 메커니즘을 공개하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

독특한 조직 공학 방법은 축삭 스트레치 성장을 recapitulating하여 문화의 수많은 신경 섬유를 길어지다하기 위해 개발되었다; 신경이 확대 본체의 성장과 함께 길어지다 약자 신경계의 성장의 한 형태.

액슨 스트레치 성장의 연결을 성장의 Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K 조회수.  New Jersey Institute of Technology. 독특한 조직 공학 방법은 축삭 스트레치 성장을 recapitulating하여 문화의 수많은 신경 섬유를 길어지다하기 위해 개발되었다; 신경이 확대 본체의 성장과 함께 길어지다 약자 신경계의 성장의 한 형태.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

실버 씨앗 중재 성장 방법과 골드 Nanostar 합성

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

연구

생체공학

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

헤파린 결합 도메인 골 형성 성장 인자 전달을위한 고분자 전해질 복합

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

신경 성장 인자의 사업자로 서 다공성 실리콘 필름을 디자인

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...