Ce travail a été financé par la NSF CAREER CBET-0747615. Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Douglas H. Smith et David F. Meaney pour leur encadrement et leur soutien.

1. Présentation du système extensible Axon bioréacteur croissance <ol><li> Deux approches prédominantes ont été utilisés pour appliquer des forces expérimentales pour les neurones. Dans la première approche, les forces sont appliquées à l&#39;ensemble du neurone (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). Dans la seconde approche, les forces sont appliquées directement à l&#39;axone en tirant sur le cône de croissance. Utilisation d&#39;aiguilles de verre, cette dernière approche a été utilisée pour modéliser la formation de nouveaux axones (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O&#39;Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), pour identifier les seuils de force pour un allongement et la rétraction (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), et d&#39;analyser le regroupement des neurotransmetteurs dans terminaisons axonales (Siechen, Yang et al 2009).. Une extension des tissus uniques d&#39;ingénierie de cette méthode a été développée pour produire de grandes nerveuses construit en utilisant une croissance axonale automatisés Stretch (ASG) bioréacteur (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Récemment, nous avons développé une version miniaturisée du système de bioréacteur à l&#39;étude au microscope ASG en temps réel (Loverde, Ozoka et al. 2011). Ici, nous détaillons le protocole de 9 jours (tableau 1) nous utilisons actuellement pour préparer et effectuer des bioréacteurs ASG régulièrement. </li><li> Opération d&#39;ensemble: Le système de bioréacteur GSS est composé de trois éléments principaux: 1) une chambre de bioréacteur avec des voies indépendantes (allongée puits) où les neurones sont cultivés et étirée, 2) une table de mouvements automatiques linéaires d&#39;appliquer des forces d&#39;étirement et 3) un moteur pas à pas variateur avec un logiciel pour contrôler la croissance étirement (figure 1). </li><li> Brièvement, la fabrication de prototypes bioréacteur a été effectué dans un magasin de machine à l&#39;aide d&#39;une machine à fraiser verticale (Bridgeport, Elmira, NY). Pour la biocompatibilité, la facilité de stérilisation et de la durabilité, les composants internes ont été bioréacteur usinées à partir de 3 / 8 &quot;polyétheréthercétone (PEEK). Polycarbonate transparent a été utilisé pour les couvercles pour permettre la microscopie optique et la visualisation des cultures. Résistant à la corrosion vis en acier inoxydable 316 et de matériel complet l&#39;assemblage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> La chambre de bioréacteur est composé d&#39;un cadre d&#39;étirement qui forme trois voies, un bloc d&#39;attelage réglable qui manipule les cellules à travers les ruelles, et saillante tiges de remorquage pour une manipulation externe (figure 2). Cultures de neurones sont étalées sur des substrats de culture jetables Aclar de remorquage pris en charge par le bloc de remorquage (figures 2 &amp; 3). Un substrat lamelle jetables stationnaires attache au fond de l&#39;image qui s&#39;étend et couvre tous les 3 voies. Avant d&#39;étirement, les neurones en plaqué doit s&#39;étendre processus axonaux du substrat de remorquage sur le substrat stationnaire via l&#39;extension du cône de croissance. La population d&#39;axones qui relient les substrats subiront ultérieurement étirer par le déplacement du bloc de contrôle de traction. </li><li> Le tableau mouvements automatiques linéaires se compose d&#39;un moteur pas à pas (HT23-397, Motion Produits appliquée, Watsonville, CA) et une table de mouvement linéaire (MIPS-2-10-1.0mm, systèmes servo, Monteville, NJ), monté sur une table d&#39;alignement delrin . La chambre de bioréacteur est assis dans la table parallèle à la table de mouvement linéaire. Les tiges de remorquage allant de la chambre de bioréacteur sont fixés à la table de déplacement linéaire à l&#39;aide d&#39;un adaptateur. </li><li> L&#39;étape d&#39;entraînement du moteur du contrôleur (Si 2035, Motion Produits Appliquée) est programmé en utilisant le logiciel de programmation inclus Si pour contrôler la manipulation des substrats de remorquage. Étirer axonale est appliquée de façon progressive en prenant une série de mesures de petite cylindrée espacées par temps de séjour (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Ce système contrôlé par ordinateur offre la possibilité de programmer des profils personnalisés pour ASG, et est essentielle pour l&#39;expérimentation continue pendant plusieurs jours à quelques semaines. </li></ol> 2. Préparation du bioréacteur <ol><li> Préparer les substrats de culture jetables de remorquage et fixes pour la culture neuronale: <ol><li> Substrats de culture de remorquage sont coupés de 8,5 &quot;x 11&quot; feuilles de film Aclar (33C 2,0 millions, sonder la structure, West Chester, PA). En utilisant une lame tranchant, couper des substrats à environ 0,5 x 2,5 cm, soit un peu plus courte que la largeur des voies pour permettre au moins de 1-2mm dégagement des deux côtés. </li><li> Poncez légèrement inférieure au 1 / 3 rd des substrats de culture de remorquage sur les deux côtés à l&#39;aide fines papier abrasif de grain 1200 (McMaster Carr). Ponçage des substrats de remorquage facilite la croissance des axones des substrats de remorquage sur la lamelle substrat stationnaire. </li><li> Coupez un 5 x 7cm morceau de Aclar ou utiliser une lamelle de verre n ° 1 pour servir de substrat stationnaire (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> E Nettoyersubstrats de culture électronique avec une solution diluée Alconox et rincez abondamment à purifier dH 2 O. </li><li> Stériliser les substrats de culture par immersion dans de l&#39;éthanol à 70% pendant 30 minutes. Autoriser les substrats sécher à l&#39;air sous une hotte de culture de tissus stériles. </li></ol></li><li> Nettoyer la chambre de bioréacteur avec diluer Alconox et autoclave stériliser dans un récipient autoclave. Immédiatement après l&#39;autoclavage, le transfert d&#39;une hotte stérile et laissez sécher à l&#39;air. </li><li> Poursuivant dans le capot, la colle stériles les substrats de culture dans le bioréacteur utilisant du silicium RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) et de coton stérile à pointe écouvillons (McMaster Carr): <ol><li> Avec les jambes bloc de remorquage dans leur position verticale complète, colle les substrats de culture de remorquage pour les jambes bloc de remorquage à la portion non sablée. Eviter le contact avec la surface de culture poncé. </li><li> Collez le substrat de culture stationnaire au fond de la chambre de bioréacteur. </li><li> Retirer l&#39;excès de colle et de poches d&#39;air en appuyant délicatement sur un écouvillon sec contre les substrats collés. </li><li> Depuis lixivie RTV silicone acide acétique qui est toxique pour les neurones, le bioréacteur est laissé à sécher sous la lumière UV dans le capot pour 2 jours complets avant d&#39;introduire des cultures de neurones. </li></ol></li><li> Abaissez le bloc de remorquage de jambes pour atteindre un chevauchement de 2-3mm entre les extrémités des sablés substrats de remorquage et le substrat stationnaire. Une attention cruciale doit être portée à la taille de la superposition, si elle est trop grande, le bout des substrats de remorquage peut dévier hors du substrat stationnaire; réduire le nombre d&#39;axones qui couvrent le chevauchement (figure 3). </li><li> Positionner le bloc de remorquage à la position de départ, avec les tiges de remorquage rétracté à l&#39;intérieur du bioréacteur. Serrer les vis de l&#39;immobilisation pour empêcher le mouvement des barres de remorquage avant d&#39;étirer la croissance. </li></ol> 3. Cultures de neurones <ol><li> 1mL piscine de 10 ug / ml de poids moléculaire élevé de poly-D-lysine (cat # 354210, BD, Bedford, MA) dans un milieu sans sérum à la zone d&#39;interface substrat de chaque couloir. Laisser la solution d&#39;adhérer au repos pendant 1 heure à température ambiante. Rincer délicatement 3x avec dH 2 O, suivi par un rinçage final avec les milieux de culture. Pipetage doit être effectué à l&#39;arrière des voies, la plus éloignée de l&#39;interface substrat. </li><li> Isoler dorsale explants ganglions de la racine (GHM) à partir d&#39;un rat E16 chiot. En utilisant un microscope stéréoscopique, diluer les explants en gouttes à l&#39;aide des boîtes de Pétri. Recueillir des explants 3-4 à l&#39;aide d&#39;une pipette 100 ul et plaque sur le bord du substrat de culture de remorquage poncé. Des précautions doivent être prises à l&#39;assiette des explants sur le bord du substrat de remorquage à l&#39;aide une petite flaque de médias. Jusqu&#39;à 1ml de milieu de culture par voie est suffisante pour empêcher l&#39;évaporation pendant plusieurs heures, tout en limitant le mouvement des explants. La formulation des médias: Neurobasal avec B-27 + 0,5 mM L-glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) et 20 uM FdU + 20 uM inhibiteurs mitotiques uridine (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Fixez le couvercle et le transfert dans le bioréacteur dans un incubateur pendant 1 heure ou jusqu&#39;à ce que les cellules adhèrent. </li><li> Remplissez le bioréacteur avec des milieux de culture au point le plus éloigné des explants pour éviter le délogement. Incuber le bioréacteur pendant un minimum de 5 jours alors que les neurones d&#39;étendre les processus axonal sur le substrat stationnaire. </li></ol> 4. Croissance stretch Axon <ol><li> Le bioréacteur subit les procédures de préparation finale à l&#39;intérieur d&#39;une hotte stérile: <ol><li> Remplissez les réservoirs au sein du bioréacteur avec tampon phosphate salin à humidifier la chambre d&#39;évaporation et de la limite de milieux de culture. Dans notre système, les murs d&#39;enceinte creusée servent de réservoirs. Alternativement, les petits couvercles boîte de Pétri peuvent être placés de chaque côté du bloc de remorquage au-dessus des ruelles de la culture. </li><li> Remplacer les milieux de culture et de remplir les ruelles de la capacité. Pipetage doit être effectué à l&#39;arrière des voies, la plus éloignée de l&#39;interface substrat. </li></ol></li><li> Siège du bioréacteur dans la table mouvement linéaire automatisé. Si l&#39;expérience est d&#39;être exécuté dans un incubateur, il ne doit pas être humidifié à cause de la corrosion potentielle de la table de mouvement linéaire automatisé. </li><li> Fixez l&#39;adaptateur tige de remorquage pour les tiges de remorquage. </li><li> En utilisant le logiciel programmeur Si jogging le stade de la table de mouvement linéaire pour s&#39;aligner avec l&#39;adaptateur tige de remorquage et de l&#39;attacher à la scène. Pour plus de commodité, de préparer des séquences Programmeur Si à l&#39;avance afin de manipuler la scène par incréments spécifiques. </li><li> Desserrez les vis d&#39;immobilisation sur la chambre de bioréacteur pour permettre le mouvement libre du bloc de remorquage. </li><li> Stretch est appliquée de façon progressive en initiant une série d&#39;étapes espacées de petite cylindrée temps de séjour (Pfister, Iwata et al. 2006). Notre paradigme commence par prendre deux étapes um toutes les 172 secondes,résultant en un tronçon de filet de 1mm sur 24 heures. Après un jour, le taux d&#39;étirement peut être rampe en augmentant le déplacement ou la diminution du temps de séjour (tableau 2). </li><li> Une fois ASG est lancé, les changements de supports ne sont généralement pas nécessaires. Au fil du temps, cependant, la culture médiatique se tourne généralement acide et se manifeste par un changement de couleur jaunâtre. Si l&#39;expérimentation supplémentaire est nécessaire, les vieux médias ne sont jamais complètement vidée, mais au lieu que partiellement modifiés afin de minimiser les traumatismes aux axones flottant. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Processus axonal peut subir une croissance remarquablement rapide étirer et robuste. Initialement, le processus commence par une période d&#39;étirements lents (≤ 1mm/day) qui se compose de petits déplacements fréquents. Dans les premières 24 heures de stretching, mécanotransduction des voies de croissance neuronale se produit, par lequel les neurones commencent plus à la bouteille axone. Dans les 24 heures d&#39;ASG continue, les axones montrent une tolérance croissante des déplacements plus importants et plus fréquents. En général, les axones peuvent résister à une augmentation du taux d&#39;étirement 1mm/day toutes les 12-24 heures (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Augmenter le taux d&#39;étirement trop tôt, cependant, peut conduire à une croissance plus rapide de sélectionner les axones, mais aussi mener à une occlusion pathologique qui provoque la déconnexion. Étirez croissance des axones ont tendance à former des faisceaux, ressemblant à l&#39;architecture des fascicules. Utilisant les protocoles actuels, la banque centrale, la partie étirer grandi de faisceaux des axones n&#39;ont pas d&#39;adhérences au substrat de culture. Seul le premier respectées, les segments proximal et distal d&#39;étirement croissance des axones restent attachés à des substrats de culture. En conséquence, la partie centrale d&#39;étirement des axones grandi flotter librement, et sont sensibles aux perturbations dues à la manipulation. Pour des raisons diverses, certains axones ne peut pas croître au taux étirer appliquée. Par exemple, un neurone DRG avec deux processus axonaux, qui tous deux font l&#39;objet d&#39;étirer, peut ne pas être capable de traduire suffisamment de protéines et de croître au taux d&#39;allongement appliqué. Les axones qui ne peuvent pas accueillir le tronçon appliquée sera minces suivants effet Poisson. Étirer ultérieures mener à une occlusion de l&#39;axone, l&#39;assemblage inhibant, conduisant à la déconnexion pathologique. La majorité des axones, cependant, sont capables de subir avec succès et ASG seul un faible pourcentage d&#39;axones subissent ce processus d&#39;élagage-like. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Figure 1. Étirez Axon croissance système de bioréacteur (A). Chambre de culture bioréacteur &amp; automatisé de table de mouvement linéaire, (B) Étape moteur d&#39;entraînement du contrôleur et le logiciel de programmation de silicium. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Figure 2. Chambre culture bioréacteur. Cette caricature illustre la chambre bioréacteur par le haut avec le couvercle retiré. La position du bloc de remorquage reflète le stade final de la croissance des axones s&#39;étendent. Étirez les axones adulte peut être vu en paquets au sein des ruelles de la culture. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Figure 3. Interface Placage culture Substrat. Cette caricature illustre les composantes du mécanisme de traction au sein de chaque voie du bioréacteur de la vue latérale. (Top) se chevauchent correcte des substrats de culture de remorquage et stationnaires. (Bas) chevauchement excessif des substrats de remorquage et stationnaires des causes de la pointe du substrat de remorquage à friser. Film 1. Fixation des substrats de culture à bioréacteur. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> Movie 2. Placage du DRG explants sur des substrats de remorquage. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> Movie 3. Utilisation SiProgrammer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> Film 4. Extension du cône de croissance sur le substrat stationnaire. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> Film 5. Croissance stretch Axon. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Jour </td><td> Étape </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Stérilisation &amp; Séchage </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Collage et assemblage </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Coatings &amp; Placage culture neuronale</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Démarrer croissance stretch </td></tr></tbody></table> Horaire Expérience Tableau 1.. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Temps [hr] </td><td> Taux stretch [mm / jour] </td><td> Temps de passage [s] </td><td> Longueur totale [mm] </td><td> Temps total stretch [jours] </td></tr><tr><td> Prétention </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> S&#39;étirer </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> S&#39;étirer </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> S&#39;étirer </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> S&#39;étirer </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> S&#39;étirer </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Taux Horaire Stretch. Toutes les étapes sont étirer 2 um de déplacement (10 moteur pas à pas les étapes stretch = um 2).

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	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. 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J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons.">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li><li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals.">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li><li>Smith, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

L&#39;allongement ex-vivo mécaniques des cellules neuronales est breveté en vertu des brevets américains # 6264944 et # 7429267.

Deux étapes critiques doivent être observées lors de la préparation des bioréacteurs. Tout d&#39;abord, un chevauchement optimal à l&#39;interface substrat est nécessaire pour s&#39;assurer que les axones peuvent traverser sur le substrat stationnaire. Aclar qui est excessivement frisés ou autrement imparfaits ne devraient pas être utilisés (figure 3). Afin d&#39;optimiser le recouvrement, confirment que le substrat de remorquage est sablé de façon uniforme et contact avec le substrat stationnaire uniformément sur une plaque de 2-3mm de contact prolongé. Le chevauchement doit être optimisée avant chaque expérience en prenant soin d&#39;ajuster la hauteur des jambes de remorquage. Deuxièmement, tout en offrant pour la fixation des neurones, les revêtements de substrat de soutenir les forces considérables tonte causé par le déplacement de la tension bioréacteur et contractile des axones (Heidemann et Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Les circuits doivent être soigneusement rincées à l&#39;eau stérilisée à la fois avant et après enrobage lysine. Revêtements doivent être appliqués à partir aliquotes fraîchement dégelé et la propagation le plus uniformément possible. Surtout, les substrats doivent pas être déplacés ou autrement perturbées pendant la période d&#39;adhésion. Dans les étapes suivantes, éviter tout contact avec les substrats pendant le placage, et une pipette toutes les solutions de l&#39;extrémité de la voie éloignée de l&#39;interface substrat. Tolérances dans les connexions de chaque composant bioréacteur peut se manifester sous la forme de relais. Durant la période initiale d&#39;ASG, le mou dans le système est évident que le mouvement de la table de mouvement linéaire automatisée survient sans mouvement du bloc de remorquage. Slack peut varier par expérience, mais il est généralement &lt;1mm dans notre expérience. Pour cette raison, un «pré-tension&quot; phase d&#39;élimination mou de 1mm/day, pour une journée, qui précède le calendrier ASG au cours de laquelle les parties s&#39;engagent bioréacteur et de commencer le mouvement des substrats de remorquage. Dépannage peut être nécessaire si l&#39;étape de déplacement de la table mouvement linéaire automatisée ne correspond pas au déplacement du bloc de remorquage après la phase de pré-tension est terminée. Asynchrone, les déplacements inexactes du bloc de remorquage sont associées aux «stiction» ou frottement statique dans le matériel de remorquage et de flexion de l&#39;adaptateur. Pour éviter ces problèmes de se produire, le mouvement du bloc de remorquage doit être vérifiée par la main, après l&#39;assemblage, pour lisses quasi-effort mouvement. Si la liaison se produit, l&#39;assemblage de remorquage doit être libérée avant l&#39;expérimentation. Une rigidité suffisante de l&#39;adaptateur est également nécessaire pour assurer la précision, les déplacements synchrones ne sont pas surmontées par stiction du matériel de remorquage.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de la composante </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Polyétheréthercétone (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Custom made bioréacteur </td></tr><tr><td> Polycarbonate </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Custom made couvercle de la chambre bioréacteur </td></tr><tr><td> Moteur pas à pas </td><td> Motion Produits appliquée, Watsonville </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Tableau mouvement linéaire </td><td> Systèmes servo, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Contrôleur du lecteur de moteur pas à pas </td><td> Motion Produits appliquée, Watsonville </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Structure Probe Inc, West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Remorquage de la culture des substrats </td></tr><tr><td> N ° 1 lamelle </td><td> Cerveau Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Substrat de culture stationnaire </td></tr><tr><td> Silicon RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Coton-tige tampons </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Pendant la pré-synaptique du développement embryonnaire, les processus neuronaux parcourir de courtes distances pour atteindre leurs objectifs par le biais du cône de croissance. Au fil du temps, soma neuronal sont séparés de leurs terminaisons axonales en raison de la croissance du squelette de l&#39;organisme agrandissement (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Cette mécanotransduction induit un mode secondaire de croissance neuronale capable d&#39;accueillir un allongement continu de l&#39;axone (Bray 1984; Heidemann et Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004).. Croissance stretch Axon (ASG) est concevable un facteur central dans la maturation des processus embryonnaires courtes dans les nerfs de long et faisceaux de matière blanche caractéristique du système nerveux adulte. Pour étudier ASG in vitro, nous avons conçu des bioréacteurs à appliquer une tension sur le processus à court axonale des cultures de neurones (Loverde, Ozoka et al. 2011). Ici, nous détaillons les méthodes que nous utilisons pour préparer et mener des bioréacteurs ASG. Premièrement, dans chaque ruelle étirement du bioréacteur, les neurones sont plaqués sur un substrat micro-manipulation de remorquage. Ensuite, les neurones de régénérer leurs processus axonal, via l&#39;extension du cône de croissance, sur un substrat stationnaire. Enfin, la croissance étirer est effectuée par le remorquage du corps cellulaire plaqués loin de la terminaisons axonales adhéré au substrat stationnaire; récapitulant la croissance du squelette, après l&#39;extension du cône de croissance. Des travaux antérieurs ont montré que des embryons de rats ASG dorsale neurones ganglions de la racine sont capables de taux de croissance sans précédent allant jusqu&#39;à 10mm/day, atteignant des longueurs allant jusqu&#39;à 10cm, tandis que simultanément entraînant une augmentation des diamètres des axones (Smith, Wolf et al, 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Ceci est en contraste dramatique à l&#39;extension de croissance cône de régénération (en l&#39;absence de stimuli mécaniques), où les taux de croissance 1mm/day moyenne avec une bonne régénération limitée à la longueur de moins de 3cm (Fu et Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). En conséquence, une étude plus approfondie d&#39;ASG peuvent aider à révéler les mécanismes de croissance déréglée qui limitent la régénération en l&#39;absence de stimuli mécaniques.

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Une méthode d&#39;ingénierie des tissus uniques a été développée pour allonger les fibres nerveuses dans la culture de nombreux en récapitulant la croissance des axones s&#39;étendent; une forme de croissance des nerfs du système nerveux où s&#39;allongent en conjonction avec la croissance du corps agrandissement.

Croissance stretch Axon: La mécanotransduction de croissance neuronale

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K vues.  New Jersey Institute of Technology. Une méthode d'ingénierie des tissus uniques a été développée pour allonger les fibres nerveuses dans la culture de nombreux en récapitulant la croissance des axones s'étendent; une forme de croissance des nerfs du système nerveux où s'allongent en conjonction avec la croissance du corps agrandissement.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Or Nanostar synthèse avec une méthode de graines Silver croissance Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Recherche

Bio-ingénierie

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Méthodologie élastographie par résonance magnétique pour l&#39;évaluation des tissus Conçu croissance Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Préparation des hydroxy-PAAm hydrogels pour découplage des effets de la mécanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

L&#39;étude de la Stœchiométrie Epidermal Growth Factor Receptor dans des cellules intactes en utilisant la microscopie corrélative

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complexe de polyélectrolyte pour Heparin Binding Domain Growth Factor ostéogénique Livraison

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Conception de silicium poreux Films comme porteurs du facteur de croissance nerveuse

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

Segmentation de la croissance des cellules endothéliales dans des plaques à 6 puits sur un agitateur orbital pour les études mécanobiologiques

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...