Bu çalışma bir RO1 NIH (NINDS) hibesi ile desteklenmektedir.

1. Enjeksiyon için hazırlanması virüsler <ol><li> rAAVs önerilen ticari bir satıcıdan satın alındı, ancak kişinin kendi laboratuarında imal edilebilir onlar da (aşağıya tartışma bakınız). Virüs çözümü genellikle mililitrede ~ 1x10 12 genom kopya (GC / ml) bir titrede üretilir ve tam titresi hücrelerinin çok sayıda işlemek için kullanılan olabilir. Alternatif olarak, seyrek etiketleme istenilen düzeyde üretmek için seyreltilmiş olabilir. Kullanıcı tarafından belirlenen uygun seyreltme gerekir, ancak 1:10 seyreltme başlanması tavsiye edilir. </li><li> Kullanmadan önce buz üzerinde virüs hemen çözülmesini sağlayın. Virüs çözümü istenen ön sulandırma hacmi küçük bir (~ 250μl) PCR tüp içine aktarın. Bir doku kültürü kaputu steril DPBS uygun bir hacmi kullanarak virüs çözümü sulandırınız. Sulandırılmış virüs çözümü gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın. </li></ol> NOT: tüm virüsleri taşıma, kurum tarafından onaylanmış bir biyogüvenlik protokolü uyarınca yapılmalıdır 2. Şırınga yükleme ve ekipman montajı <ol><li> Cam şırınga pistonu hafifçe çekerek yükleme iğne bağlayın ve PCR tüp virüs çözümü hazırlamak. Hava çok küçük bir kabarcık şırınga görülebilir kadar pistonu çekerek, bu çözüm şırınga ve yükleme iğne sol olmadığını gösterir. Alternatif olarak, küçük bir miktarda inert boya görünür hale getirmek için çözüm olabilir. NOT: küçük bir PCR tüp olarak kullanılmalıdır yükleme iğne genellikle çoğu diğer tüplerin alt ulaşmak için yeterince uzun değildir. </li><li> Kaldır yükleme iğne ve şırınga tutucu ile güvence, bir şırınga pompası şırınga blok şırınga. </li><li> Şırıngaya bağ hortumun bir ucunu nazikçe, iğne tutucu diğer ucunu takın. Iğne tutucu içine bir iğne takın. Enjeksiyon iğne ucu, doğrudan iğne tutucu bağ tüp içinde sonuna başvurmalısınız. </li><li> Yavaş yavaş bağ tüp yoluyla çözüm itmek için piston elle bastırın. Çözüm küçük bir damla, bir iğne ucu görünür kadar itin. </li><li> Dikkatle itici blok yanında piston konumu ve itici blok dirseğini ile sabitleyin. </li><li> Enjeksiyon parametrelerini ayarlayın: enjeksiyon oranı yaklaşık 8μl/min (~ 130nl / s); enjeksiyon hacmi genellikle 1-2ul; şırınga boyutu için (kılavuzlar için şırınga pompası kılavuzuna bakın) kullanarak uygun şırınga çapı seçin. </li><li> Ocak ayarlayın ~ 38 ° C ve iyileşme döneminde yavrular korumak için, bir kağıt havlu veya ince bir bariyer ile kaplayın. </li></ol> 3. Enjeksiyon prosedürü ve yavru kurtarma <ol><li> P0 ve P1 fare yavrular, bir IACUC onaylanan protokole soğuk anestezi onlara tabi enjeksiyon için hazırlayın. Birkaç kağıt havlu, su ve buz üzerinde yer ile nemlendirin. Yavrular istenilen sayıda (4-5) (ayrı tutmak) kağıt havlu yerleştirin ve hafifçe nemli kağıt havlu ile kaplıdır, böylece yavrular üzerine kağıt havlu kat. Kağıt havlu üstüne hafifçe ezilmiş buz bir miktar yerleştirin ve yavrular yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe edin. Yavrular 15 dakika kadar buz üzerinde saklanır ve daha sonra ince kurtarmak olabilir. </li><li> Yavru yeterince uyuşturulduktan sonra, bir montaj bloğu yerleştirin (normalde 15ml tüpleri tutan plastik bir blok kullanın) ve enjeksiyon için en iyi erişim için pozisyon. Korteks için beyincik için blok kenarına yavru kafatasının arkasına daha iyi bir erişim sağlamak için baş pozisyonu yardımcı olur, karın hayvan düz koymak için en kolay yoldur. Istenirse yavru bir bant yardımı ile yerine sabitlenir olabilir. </li><li> Iğne elle diğer elinizle istediğiniz siteye kafatası yoluyla takılı iken tek elle yerde yavru kafa tutun. Enjeksiyon sırasında hareket etmesini engellemek için cildin sıkı çekmek için yararlıdır. Korteks için gelecek enjeksiyonları yardımcı olacak, kafatası lambda dikiş gibi iyi tanımlanmış bir anatomik işaretine göre enjeksiyonları yapmak için yararlıdır. Beyincik dokusu colliculus doğrudan kaudal yatan ince bir şerit olarak kafatası yoluyla görülebilir. Iğne takılı olmalıdır derinliği bireysel hayvanlar ve suşları arasında biraz değişir ve iğne üzerinde önceden belirlenmiş belirteçleri ile ölçülür olabilir, ancak biz korteks ve serebellum ~ 0.5 derinliği bulmak yüzeyinden 1mm genellikle uygundur. Diğer siteler için ekleme derinliği son kullanıcı tarafından deneysel olarak tespit edilmelidir. NOT: iğne kafatası kolayca nüfuz gerektiğini, yoksa bu hayvan zarar verebilir, çok zor TMEY. Iğne yeniden konumlandırmak ve yavaşça tekrar deneyin. </li><li> Virüs çözümü enjekte edilir. Enjeksiyon başlatmak.pompa START düğmesine basarak veya bir ayak pedalı karartıcı, enjektör kullanılan basınç model bağlı ed. Bir ayak pedalı yokluğunda bir meslektaşım enjeksiyon etkileyebilir gereksiz el hareketleri en aza indirmek için düğmeye basarak yardımcı olması tavsiye edilir. </li><li> Seçilen hacim enjekte edildikten sonra, birkaç saniye için iğne yerde tutmak ve daha sonra yavaşça yavaşça kaydırarak iğneyi çıkarın. Gereksiz hareketleri en aza indirmek için yavrunun kafasını tutmak için emin olun. Enjeksiyon ekipmanı temizlenmeli ve sterilize etanol ile deneyler arasındaki yara küçük olduğundan, antiseptik kullanımı gereksizdir. </li><li> ~ 38 sıcaklık set ile kapalı ocak yavru yerleştirin ° C kurtarma, genellikle 5-10 dakika kadar sıcak. Bu süre zarfında diğer yavrular enjekte devam edebilir. </li><li> Yavruların hepsi iyileşti sonra (bunlar pembe ve hareketli olmalıdır), ev yataklar bir kısmını almak ve yavrular hafifçe ovalayın. Bir grup olarak yavrular anne dönün. </li></ol> NOT: Bu yavrular anne onları geri dönen ve bir grup olarak onlara geri dönmek için önce sıcak ve ev yataklar maruz emin olmak için çok önemlidir. Bunu yapmadığınız takdirde yavrular yaralanmasına ya da öldüren anne neden olabilir. 4. Ekipman temizliği <ol><li> Enjeksiyon tamamlanır ve yavrular annelerinin iade edilmiş sonra, tam olarak aseton veya% 70 etanol ile şırınga yükleyerek enjeksiyon kurulum temiz. Her zaman taze solüsyon kullanarak çözüm, enjeksiyon kurulum birkaç kez yıkayın. Bu kalan virüs çözümü kaldırmak ve çökeltileri. Aseton veya etanol buharlaşır. NOT: Aseton temizlik için tercih edilen, ancak kurulum siyanoakrilat yapıştırıcılar gibi herhangi bir aseton duyarlı bileşenleri kullanır, o zaman bu adımlar için% 70 etanol kullanın. </li><li> Biohazard uygun bir kap içinde, çamaşır suyu ve iptal atık ile çalışma alanı dezenfekte edin. </li></ol> 5. Analiz <ol><li> IACUC onaylanmış bir ötenazi yöntemi kullanılarak istenilen yaşta hayvanların Kurban. Perfüzyon fiksasyon, özellikle yetişkin hayvanların enfekte nöronlar, daha sonra görselleştirme yardımcı olmak için tavsiye edilir. </li><li> Standart immün prosedürleri floresan sinyalini yükseltmek için kullanılıyor olabilir. Kısaca, PBS +% 1 Triton X-100 ile 100 mikron vibratome bölümleri yüzen permeabilize ve PBS +1% Triton X-100% 10 normal keçi serumu bloke. Bölüm 4 geceleme primer antikorlar ° C, yıkama ve engelleme ek çözüm engelleme inkübe edilir. Bölüm, sonra oda sıcaklığında 2 saat için sekonder antikor ile çözüm engelleme inkübe iyice yıkanır, kızaklar üzerinde monte edilmiş ve anti-solmaya montaj medya dakika muamele edilir. Cryosections etiketli nöronlar da görselleştirmek için kullanılabilir, ancak endojen floresan kaybolabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Başarılı bir enjeksiyon prosedürü gözlemlenebilir doku hasarı veya hayvansal diğer kötü etkileri ile enjeksiyon yerinde bölgedeki nöronların sağlam enfeksiyonu üretecektir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, enfeksiyonun yayılmasını çeşitli anatomik siteleri rAAV8-Cre enjekte Cre-muhabiri fareler (ROSA26R) 12 görülebilir. Korteks ve üstün colliculus gibi belirli bölgelerde, içine enjeksiyon, genellikle komşu bölgeler (Şekil 1A-B) minimal yayılması ile yerel enfeksiyonlar oluşturur. Yüksek titreye virüs çözümü kullanılması daha muhtemeldir (Şekil 1A) hipokampus gibi bitişik olan alanlarda, enfeksiyon yapar. ROSA26R muhabiri fareler (Şekil 1C-D) orta hat serebellar rAAV8 Cre enjeksiyon gösterildiği gibi, tipik olarak enjeksiyon yeri yakınında kalır seyrek enfeksiyon düşük titreye virüs çözümü sonuçları, Enjeksiyon. Biz muhabiri genler enfeksiyon, rekombinasyon ve ifade nispeten hızlı bir şekilde oluşabilir düşündüren, rAAV8-Cre enjeksiyondan sonra 2 gün içinde ROSA26R muhabiri farelerde rekombinasyon gözlemledik. Ayrıca, başarılı floxed koşullu allel olmayan bir ROSA lokustaki gen silme etkilerini incelemek amacıyla bu tekniği kullandık, sonuçları başka bir yerde ilan edilecektir. Enfekte hücrelerin sayısı enjekte viral çözüm titresi ile ilişkili olmalıdır. Örneğin, yüksek titresi çözümleri, beyincik farklı floresan proteinleri ifade iki rAAV8 virüslerinin bir karışımı enjekte farklı (Şekil 2A) etiketli birçok Purkinje hücreleri bozar. Aksine, düşük titresi virüs solüsyon enjekte tek hücre (Şekil 2B) görselleştirmek yardım etmek için seyrek enfeksiyona neden olabilir. Floresan etiketli nöronlar taze kesilmiş, canlı doku (Şekil 2B) doğrudan gözlenemeyen veya geniş alan veya ortak, daha sonra görüntü elde etmek için endojen floresan sinyalleri güçlendirmek için immün tabi tutulabilirnOdak floresan mikroskobu (Şekil 2A, Şekil 3A-C). Son olarak, rAAV8 ince süreçlerin güçlü etiketleme (Şekil 3A-C) ile kortekste nöron tipleri çeşitli bulaştırma yeteneğine sahiptir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> Şekil 1: P0 rAAV8-Cre enjekte edildi ROSA26R muhabiri farelerin beyin LacZ boyama Cre aktivite ve enfeksiyon yerini göstermektedir. <ol type="A"><li> P14 beyin yüksek titresi (1x10 12 GC / ml), korteks ve üstün colliculus içine enjeksiyon gösteren bir geniş alan sagital görünüm . Yüksek titresi virüs komşu alanlarda aynı zamanda enfekte olacağını daha olası hale getirir. </li><li> Alt titresi (1x10 11 GC / ml) enjekte P14 korteksin sagital kesiti, virüs yaymak için daha az bir lokal enfeksiyon gösterir . </li><li> Düşük titreye sahip orta hat (1x10 9 GC / ml) virüs çözümü enjekte P28 beyincik wholemount görünümü enfeksiyon seyrek ve genellikle enjeksiyon yerinde yakın kaldığını gösterir. </li><li> C beyinciğin orta hat sagittal görünüm). Genellikle sadece Purkinje hücreleri rAAV8 tarafından enfekte unutmayın. </li></ol><img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> Şekil 2: floresan proteinleri ifade rAAV8 yüksek ve düşük titreleri ile enjeksiyon Serebellar etiketleme. <ol type="A"><li> EGFP (yeşil) ve DsRed (kırmızı) ifade eden bir karışımı iki virüs ile enfekte P21cerebellum sagital bölümü. Purkinje hücreleri çok sayıda enfekte virüslerin yüksek titresi karışımı kullanılmıştır. </li><li> Çok düşük titreye viral enfeksiyon canlı P14 beyincik Purkinje hücre diseksiyonu sonra hemen görüntülenmiş. </li></ol><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> Şekil 3: rAAV8-DsRed Kortikal etiketleme. P0 az rAAV8-DsRed bulaşmış olan bir P21 korteksin koronal bölümlerde çeşitli kortikal nöron tipleri örnekleri.

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan yenidoğan viral enjeksiyon yöntemi, doğum sonrası beyin gelişimi ve çalışması için in vivo mozaikleri oluşturmak için basit ve hızlı bir şekilde sağlar . Bu yöntem yanı sıra şu anda proje 6 Hedefleme Yüksek Verimli Gen yoluyla alınıyor olduğunu mevcuttur floxed allellerin yararlanır . Cre transgenik ifade kullanımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem floxed allel taşıyan fareleri deneyler için doğrudan kullanılabildiği gibi, çeşitli hücre ti...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre, GFP, DsRed </td><td> Vektör Biolabs </td><td> # 7060 # 7061, özel sipariş </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Pompa 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702.208 </td><td> (Hayır ayak pedalı bağlantı noktası) </td></tr><tr><td> Retina pigment epiteli Enjeksiyon Kiti </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> RPE-KIT </td><td> Bağ boru, enjeksiyon iğneler (36G) ve iğne tutucu </td></tr><tr><td> NanoFil Şırınga, 100μl </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Yeniden kullanılabilir yükleme iğne içerir </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP antikor </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed antikor </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Isıtma Blok </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R fare </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Normal beyin fonksiyonu, sinir devreleri olgunlaştı ve rafine zaman doğum sonrası gelişim üzerinde de sadece büyük nöronal yollarda kurulan embriyonik gelişim dayanır, ama. Bu aşamada Misregulation gibi otizm ve şizofreni 1,2 gibi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklara yol açabilir. Birçok genin prenatal beyin okudu ve birçok gelişim süreçleri 3-5 için çok önemlidir bulundu. Ancak, doğum sonrası beyin işlevi farelerde silinmesi genellikle neonatal gelişim sırasında ölümcül götüren kısmen ve erken gelişim kendi ihtiyacı postnatal analiz engellemektedir kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu engelleri aşmak için, bu genlerin floxed allel farelerde 6 oluşturulan ediliyor. Ifade Cre recombinase belirli hücre tipleri, koşullu silme postnatal beyin gen fonksiyonu çalışma elde edilebilir ki transgenik allel ile birleştirildiği zaman. Ancak bu yöntem, böylece fare beyni büyük bir ölçekte genetik analiz genişleme sınırlama, uygun genotipler ile fareler üretmek için ek allelleri ve ekstra zaman (3-6 ay) gerektirmektedir. Burada postnatal beyin geliştirme, hızlı ve sistematik bir şekilde bu floxed allel çalışma viral-ifade Cre kullanan tamamlayıcı bir yaklaşım göstermektedir. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) 7,8 kodlama Cre neonatal beyin içine enjekte edilerek, beynin farklı bölgelerinde ilgi gen silebilir. Viral titresi kontrol ve floresan protein işaretleyici coexpressing, biz aynı zamanda mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, erken geliştirme birçok genin gereksinimi, dallanma ve döşeme, sinaps oluşumu ve arıtmanın yanı sıra, atlar ve bize aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere, doğum sonrası beyin gelişiminde çok kritik süreçlerin kendi hücre otonom fonksiyon, çalışma sağlar. Bu yöntem, kendi laboratuvarı (yayınlanmamış) ve diğerleri 8,9 başarıyla kullanılmaktadır ve lentivirüs 9 yanı sıra, shRNA veya baskın olarak aktif proteinlerdeki 10 ifade gibi diğer virüsler, uzatılabilir . Ayrıca, elektrofizyoloji bu tekniği birleştiren yanı sıra yakın zamanda geliştirilen optik görüntüleme araçları 11 genetik yollar fare ve sıçanlarda sinir devresi gelişimi ve işlevi nasıl etkilediğini incelemek için yeni bir strateji, bu yöntem sağlar .

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Bir<em&gt; In vivo</em&gt; Postnatal beyin gen fonksiyon testi yöntemi açıklanmıştır. Cre ve / veya floresan proteini ifade Rekombinant AAVs yenidoğan fare beyninin içine enjekte edilir. Mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme, gen fonksiyonu nöral devre geliştirme kritik süreçlerin hızlı analiz izin elde edilir.

Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Görüntüleme.  Keck School of Medicine, University of Southern California. Bir In vivo Postnatal beyin gen fonksiyon testi yöntemi açıklanmıştır. Cre ve / veya floresan proteini ifade Rekombinant AAVs yenidoğan fare beyninin içine enjekte edilir. Mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme, gen fonksiyonu nöral devre geliştirme kritik süreçlerin hızlı analiz izin elde edilir.

Video: Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Non-ventriküler Plazmid Enjeksiyon ve Elektroporasyon Postnatal Rat Beyin Gen Teslimat

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Nörobilim

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Erken Postnatal fare beyin içine Interneuron öncüleri Homochronic nakli

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Beyin fonksiyonları çocuklarda Magnetoencephalography kullanarak eğitim

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Kronik yaygın Marmoset bütün kortikal Electrocorticographic dizide implantasyonu

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...