Bu protokol özellikle görsel olarak kusurlu Drosophila mutantlarının genetik taraması için uygundur. Bunun nedeni, Drosophila fototransdüksiyonunda, özellikle fotopigment seviyelerinde ve katman akranla ilgili fonksiyonlarda küçük anormalliklerin bile tespit edilmesine izin vermeleridir. Bu teknik in vivo olarak derindir, uygulanması kolaydır ve oldukça sağlamdır, fototransdüksiyon proteinlerinin aktivitesindeki küçük değişikliklerin tespit edilmesini sağlar.
Benim düşünceme göre, canlılığı korurken sinekleri sabitlemek muhtemelen bu yöntemin kritik kısmıdır. Bilgisayarı açın ve Clampex yazılımını açın. Amplifikatörü ve Master-8 darbe jeneratörünü açın, ardından xenon lambasını ve deklanşör denetleyicisini açın.
Çektirmeyi açın ve çektirmeye bir cam kılcal damar yerleştirin ve çekin. Cam kılcal damarı çektirmede çıkarın. Cam kılcal damarı, uzun uçlu bir şırınga kullanarak filtrelenmiş zil çözeltisi ile doldurun.
Tel elektrodu cam kılcal damara yerleştirin. Kılcal damar içindeki çözeltinin gümüş tel ile temas halinde olduğundan emin olun. Elektrot tutucuları iki elektrot mikromanipülatörüne yerleştirin.
Lehimleme demirinin güç kaynağını açın. Akımı yaklaşık 2,25 ampere ayarlayın. Bu akım, 0.25 milimetrelik platin-iridyum filamentini yaklaşık 55 ila 56 santigrat dereceye ısıtmalıdır.
Havya üzerine düşük erime sıcaklığına sahip bir damla balmumu yerleştirin. Şişe içindeki sinekleri anestezi altına alın. Anestezi altındaki sinekleri uyuyan kaba dökün, bir sinek seçin ve sineklerin geri kalanını bir Petri kabı ile örtün.
Keskin bir cımbız kullanarak sineği kanatlarından dikkatlice tutun ve sinek tutucuya yerleştirin. Sinek tutucusuna, sineği sırtı ele doğru olacak şekilde yan yatacak şekilde yerleştirin. Cımbız kullanarak, sineği kanatlarından kaldırın ve havyayı kullanarak kanatlarını sinek tutucusuna sabitleyin.
Sineğin sırtını, havyayı kullanarak balmumu ile stand yüzeyine bağlayın. Havyanın ucunu bacakların birleşme noktasına indirin, ardından tüm bacakları birlikte örtmek için balmumunu eritin. Boyun bölgesinde baş ve boyun arasına küçük bir damla balmumu yerleştirin.
Sinek tutucuyu bir mıknatıs bloğu üzerindeki karanlık bir faraday kafesine yerleştirin ve sineğin ışık kılavuzunun ucundan yaklaşık beş milimetre uzakta olduğundan emin olun. Kayıt elektrodunu sineğin gözünün üzerine ve toprak elektrotunu mikromanipülatörleri kullanarak sineğin üst sırtına yerleştirin. Daha sonra mikromanipülatörleri kullanarak toprak elektrodunu sineğin arkasına yerleştirin.
Kayıt elektrodunu sinek gözünün dış çevresine, tercihen mikro manipülatörleri kullanarak yerleştirin. Faraday kafesini kapatın ve beş dakika boyunca karanlığa adaptasyona izin vermek için odadaki ışıkları kapatın. Saniyede 500 metrelik bir darbe süresinden, 60 saniyelik bir darbe aralığından ve altıya ayarlanmış darbe sayısından başlayan parametreleri girin.
PDA'yı ölçmek için, Master-8 darbe jeneratörünü TRAIN moduna ayarlayın, ardından turuncu bir filtre kullanarak maksimum yoğunlukta beş saniyelik bir ışık darbesi verin. Voltaj tepkisini kontrol edin. Turuncu filtreyi geniş bant mavi filtreyle değiştirin ve maksimum yoğunlukta üç adet 5 saniyelik ışık darbesi verin.
Voltaj tepkisini kontrol edin. Karanlıkta en az 60 saniye bekleyin. Mavi filtreyi önceki turuncu filtreyle değiştirin.
Ardından, 60 saniyelik aralıklarla iki adet 5 saniyelik ışık darbesi verin. Voltaj tepkisini kontrol edin. ERP M potansiyelini ölçmek için, kararlı durum voltaj tepkisine ulaşılana kadar sürekli bir mavi ışık darbesi verin.
20 nanometre bant geçişli bir filtre kullanarak 350 ila 700 nanometre arasında bir dalga boyunda kısa bir yoğun ışık parlaması verin. Daha sonra, fotodengede bu spesifik dalga boyundaki metarodopsin absorpsiyonunu yansıtan M-potansiyel yanıtının M1 fazının tepe genliğini ölçün. PDA yanıtları farklı mutant sinekler için değerlendirildi.
Vahşi tip sinekler, yoğun mavi ışık stimülasyonunu takiben, karanlıkta uzun süreli kornea negatif ERG olarak ortaya çıkan doymuş bir depolarizasyon gösterdi. Aşağıdaki mavi ışıklar, PDA üzerine bindirilmiş, açma ve kapama geçicilerinden yoksun küçük tepkiler üretti. NinaE gibi anormal fotopigment biyogenezi olan mutant sineklerde, voltaj tepkisi yoğun mavi ışık stimülasyonunu takiben taban çizgisine geri döndü ve ek bir mavi ışığa verilen yanıt bastırılmadı ve normal açılma ve kapanma geçicileri gösterdi.
Sineklerin vahşi tip ERP'si aynı protokolle elde edilir, ancak PDA sırasında yoğun bir yeşil flaş uygulanır. Bu yeşil flaş ERP'yi ortaya çıkardı ve PDA'yı bastırdı. M-potansiyeli, mavi aydınlatmayı takip eden yeşil flaşla elde edildi, ancak vahşi tip sineklerde mavi aydınlatmadan sonra mavi bir flaşla elde edilmedi.
Bu protokol vahşi tipte, fotopigment hipomorf mutant ninaE'de ve normal fotopigment düzeyleri norpA olan fototransdüksiyon eksikliği olan mutantta tekrarlandı. Sinek rodopsinin ve metarodopsinin nispi absorpsiyon spektrumları, farklı spektrumun ve fotodenge spektrumunun fotometrik ölçümlerinden hesaplandı. Sineklerin hayatta kalması için aşırı ısınmaktan kaçınarak balmumu viskozitesine dikkat etmek önemlidir.
Bu prosedür genetik ve kusurlu görsel mutantların taranması için uygundur. Görsel mutasyonları rastgele izole eden ve tanımlayan yöntemler, Drosophila fototransdüksiyonunda yer alan yeni proteinlerin ve mekanizmaların keşfedilmesini kolaylaştırabilir. PDA protokolü, önemli ve yeni görsel mekanizmaların izolasyonunu sağladı.
Katılım muhtemelen başka türlü keşfedilmemiş veya hatta beklenmeyecekti.
