Biz bu protokol ile ilgili yorumlar için Dr. Richard Vallée ve Brikha Shrestha utero ve ex vivo retina elektroporasyon teknikleri ile ilgili yardım için teşekkür eder, ve Dr T. Sakurai . Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık Grants F31 NS051008 (TJP), Fondation pour la Recherche medicale ve İnsan Frontier Bilim Programı (AR) ve (CM) R01 EY12736 tarafından da desteklenmiştir.

Bölüm 1: utero ve ex vivo retina electroporations için ayarlama 1. Utero ve ex vivo retina electroporations her ikisi için <ul><li> Ince uçlu mikropipetler hazırlamak ve açılı bir noktaya yapmak için ucu (veya konik ucu) kırmak için bir elektrot çektirmesi kullanın. </li><li> Istenilen konsantrasyonlarda DNA çözümleri hazırlayın ve Hızlı Yeşil Boya (% 0.05) enjeksiyonları görselleştirmek için küçük bir miktar eklemek. Utero retina electroporations için annenin başına 5 ul DNA çözümü ve ex vivo retina electroporations için embriyonik başına 1 ul DNA çözüm öneriyoruz. Transfekte nöronlar görselleştirmek için bir GFP ifade oluşturmak (ya da diğer floresan protein) ekleyin. </li><li> Cerrahi aletler otoklav yoluyla sterilize edin. </li><li> 100 mcg / ml ketamin 1.0:0.2:4.6 hacimsel oranı: 100 mg / ml ksilizin: tuzlu aşağıdaki oranı (her hamile kadın için yaklaşık 0,2 ml) ile ketamin ksilizin anestezik karışımı hazırlayın. Diğer anestezikler kullanılabilir. </li></ul> 2. Sadece utero retina electroporations için <ul><li> Isıtma yastığı açın ve bir bebek bezi ped ile örtün. </li><li> Fosfat tamponu salin (PBS) ve ısıtma yastığı sıcak antibiyotik antimikotik çözüm (1:100) hazırlayın. Her baraj ~ 2 ml hazırlayın. </li><li> Sıcak su banyosu steril filtrelenmiş PBS yerleştirin. </li></ul> 3. Sadece ex vivo retina electroporations <ul><li> Kabarcık DMEM/F12 25 ml% 95 oksijen / ≥ 2 saat için% 5 karbon dioksit: retina inkübasyon için oksijenli serum serbest orta (SFM) hazırlayın. 25 ml oksijenli ortamda, 0.25 g sığır serum albumini (BSA), 250 ul ITS ek ve 50 ul Penisilin-streptomisin çözüm ekleyin. Steril filtre, sonra çözüm BSA çözmek için çözüm karıştırın. Bu çözüm, her bir elektroporasyon deney için taze olarak yapılmalıdır. </li><li> Otoklav bir heyecan mıknatıs ile 150 ml şişe metilselüloz 0.20 g: retina eksplant inkübasyon için SFM +% 0.4 metilselüloz orta hazırlayın. SFM (yukarıdaki gibi, köpüren olmadan) 50 ml hazırlayın ve otoklavlanmış metilselüloz şişe ekleyin. 4 ° C gecede bu çözüm karıştırın. Steril filtre bu çözüm ertesi gün, 4 ve mağaza ° C olan bu çözüm, yaklaşık 1 ay muhafaza edilebilir. </li><li> Retina eksplant hasat (Bölüm 5) günü, retina eksplant kaplama için yemekler hazırlamak: Kat cam alt kültür kaplarına poli-L-ornitin 250 ul ≥ 2 saat boyunca 37 ° C. (Alternatif olarak, önceki gün yemekleri poli-L-ornitin ile kaplı olabilir ve 4 ° C&#39;de bir gece inkübe) PBS, 10 mikrogram / ml laminin için DMEM/F12 200 ul kat yemekleri ile birkaç kez yıkayın yemekleri ≥ 2 saat 37 ° ° C. 37 bulaşık PBS ile birkaç kez yıkayın ° C ve eksplantlar kaplama için hazır olana kadar PBS bırakın. </li><li> Sınır testlerde, poli-ornitin kat yemekleri, yukarıdaki gibi, sonra bir floresan işaretleyici ile birlikte protein ile faiz çanağı kat yarısı 2 saat için sınır (BSA, 1:800 konjuge Alexa Fluor 555) görselleştirmek için 37 ° C PBS ile yıkayın, daha sonra yukarıda açıklandığı gibi laminin ekleyin. </li></ul> Bölüm 2A: utero retina elektroporasyon in vivo E14.5 fare retinae içine DNA enjekte ve electroporating <ol><li> E13.5-E14.5 aşamada baraj içine 0.15 ml anestezik karışımı intraperitoneal (ip) enjekte edilir. Anne bir cerrahi anestezi düzlemine ulaşıncaya kadar 3-7 dakika sürer. Tam anestezi fare hindpaw sıkıştığı cevap olmamalıdır. </li><li> Bu süre zarfında, pipetlemeyin parafilm ve küçük bir parça kesip ~ parafilm üzerine DNA çözüm 5 ul. 90 ° derecelik bir açıyla (metal tel) bir dalgıç bükün ve çekti micropippette takın. Pistonu kullanarak, mikropipet (diseksiyon mikroskobu kullanılarak bu işlem yardımcı olabilir.) DNA çözüm aspirat. </li><li> Anne anestezi cerrahi düzlemine ulaştığında, daha sonra ısıtma yastığı onun dorsal yüzü aşağı, annenin karın ~ 2 inç bölge tıraş, elektrikli tıraş makinesi kullanın. Hazırlık alkol ped ile silerek traş alanı en az iki kez bir iyot ped izledi. Oftalmik Veteriner merhem annesi genel anestezi altında iken, gözlerde korneal ülserasyon önlemek için her gözün üzerine bir damla yerleştirin. <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig1.jpg" alt="Şekil 1" /></li><li> Forseps, cilt kavramak ve periton açığa, karın kas ve deri yoluyla (yaklaşık 1 inç uzunluğunda) orta hat boyunca dikey bir kesi yapmak için makas kullanın. Forseps ile kaldırın ve periton karın boşluğunda (Şekil 1) ortaya çıkarmak için bu zarından benzer bir düşey kesi yapmak. Sonra iletişim kurmanızı ve saç ile kontamine olan karın içeriğini önlemek için gazlı bez ile cerrahi alanında asmakhayvan. </li><li> Forseps ile deri ve periton geri çekin ve kesiden bir embriyo (en erişilebilir embriyo seçin) ayıklamak için diseksiyon spatula kullanın. 2 embriyolar arasında spatula yerleştirin ve karın boşluğuna doğru hafifçe dışarı embriyonik zincir çekin. Parmaklarınızla embriyonik zincir çekin. * Bu noktadan itibaren, embriyoların steril PBS ile sulu tutmak * </li><li> Diseksiyon mikroskobu ve masaj retina yukarı bakacak şekilde bir embriyo altında onun yerine anne tutun, ısıtma yastığı. Daha kolay olan embriyolar electroporated takip etmek, ya da en medial veya lateral embriyo ile başlamanızı öneririz. </li><li> Mikropipet baskın el atın ve diğer elinizle embriyo stabilize. Mikropipet ile delmek rahim duvarına ve amniyon kesesi yoluyla retina. Mikropipet keskinliğini bağlı olarak, adil bir miktarda rahim duvarına nüfuz baskı alabilir, ancak bir kez aracılığıyla mikropipet embriyo ve ideal retina girecek. Bu, embriyo girerken mikropipet derinliğini kontrol ve ölçmek için zor olabilir. Amniyotik sıvı kaçak ve embriyo ölümü ile sonuçlanan, giriş deliği genişleterek önlemek için zarı delinir sonra mikropipet hareket miktarını en aza indirin. Bu kanama ve embriyo ölümüne neden olacağı için, rahim duvarının delici kan damarlarının kaçının. </li><li> Mikropipet retina girdiğini eminiz, retina içine DNA çözüm sınırdışı etmeye hazırız. Pistonu yavaşça bastırın ve aynı anda bu DNA mikropipet yol boyunca enjekte edilir mikropipet genellikle retinanın derin nüfuz olarak sağlanması, mikropipet geri. Retina iseniz, dış retina tabakası ve retina pigment epitel (RPE) arasında extraretinal uzaya 0.5 ul sınırdışı (mikropipet 1 ul onay işaretleri ile ölçülen). Amniyotik sıvı (Şekil 1) içine retina ve sızıntıları doldurarak yeşil boya dikkat etmelisiniz. </li><li> Elektroporasyon kürekler ameliyat sırasında PBS-dolu bir Petri kabındaki tutulmalıdır. Yavaşça enjekte göz olarak aynı tarafta pozitif (+) kürek ile embriyonun baş tarafta kürekler. Bu embriyo ölüm amniyotik kese ve sonuç çıkacaktır, ılımlı bir miktar kafa stabilize etmek için basınç uygulayın, ancak çok sert basmayın. Elektrotlar yerine, 60 Hz frekansında 5 40 V, 50 ms kare bakliyat sunar. Anne mevcut deri ve kaslar için kaçan nedeniyle seğirme için alışılmadık bir durum değildir. </li><li> Tekrar enjekte electroporated her bir embriyo için 7-9 adımları. Ben genellikle 4-8 DNA miktarına bağlı anne ortalama embriyolar, embriyo sayısı, anne durumu ve anestezi altında süreyi electroporate. Alternatif olarak, birden fazla embriyoların enjekte edilir ve sonra electroporated enjekte ve ayrı ayrı her bir embriyo electroporating karşı. </li><li> Embriyoların electroporating sonra, karın boşluğuna geri embriyonik zinciri yerine forseps ve spatula kullanın. Karın boşluğuna ~ 2 ml antibiyotik antimikotik çözüm dökün. </li><li> Hemostat ve forseps kesi ön kısmında bir çift düğüm ile başlayan, periton sütür ve kesi arka kısmına basit sürekli dikiş deseni ile devam etmek için kullanın. Sütür ve trim fazla dikiş bağlamak için son döngü kullanın. </li><li> Kesi kapalı zımba, periton cilt ayırmak için dikkatli olmak, künt forseps ile kesi ön kısmı deri kaldırın. Cildin etrafında, zımba, dişlerin zımba yerleştirin ve bastırın. Kesi genellikle 5-7 zımba gerektirir arka sonu, kapalı zımbalama devam edin. Zımba etrafında yara alkol ped ile silin. </li><li> Anne ısıtma yastığı (genellikle onu uyandırmak için 15-90 dakika arasında sürer) kurtarmak ve onun üzerinde rulo başladığında, yeni bir kafes karın tarafında onun yerine. </li><li> Rahatsızlık devam ederse ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için, anne az sonra zaman noktalarında uyanış üzerine buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg, sc) alırsınız ve. Dehidratasyonu önlemek için, anne ile 1,0 ml serum fizyolojik subkutan (sc), akşam ve ertesi gün gerekirse ~-cerrahi sonrası 2-4 saat, ve tekrar enjekte edilir. Ameliyat sonrası 24 saat, annenin normal davranış yeniden ve içme ve düzenli yemek. </li></ol> Parça 2B: utero electroporated retinanın retina elektroporasyon Alma yılında E18.5 <ol><li> Embriyo başına ~ 5 ml PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) hazırlayın. Perfüzyonları yerçekimine dayalı bir infüzyon sistemi veya bir şırınga pompası ile yapılabilir. (Alternatif olarak, E18.5 başkanları sadece bir gecede% 4 PFA dalmış olabilir.) </li><li> Ile anne enjekte edilir.0.2 ml anestezik ip karıştırın ve o anestezi altında tam olduğundan emin olun. Zımba altındaki deri ve periton karın boşluğu ve rahim boynuzları maruz kesmek için bir makas kullanın. </li><li> Electroporated embriyo çıkarın ve ventral tarafta pin up. Kalp, göğüs kafesi ve karın cilt, periton, diyafram ve lateral kısımları üzerinden maruz kesin. Pierce perfüzyon kurulum bağlı kelebek iğne ile sol ventrikül ve sağ atrium bir microscissors kesmek. Perfüzyon başlatın ve PFA ~ 60 saniye boyunca akmasına izin; kan sağ atriyuma çıkmalısınız ve perfüzyon başarılı olursa embriyo soluk haline gelmelidir. Embriyonun başını kesmek ve 15 ml konik flakon% 4 PFA baş toplamak. Electroporated embriyolar için bu yordamı tekrarlayın. Birkaç gün sonra PBS içinde yıkayın 4 geceleme% 4 PFA ° C başkanları tutun ve. Tüm embriyolar toplanan servikal dislokasyon ile anne Euthanize. </li></ol> Retinanın çıkarma <ol start="=4"><li> PBS yıkar sonra, baş yukarı bakacak şekilde retina ile diseksiyon çanak pin ve PBS içinde batırmayın. RPE ortaya çıkarmak için retinanın tüm çevresindeki deri çıkarın. 26G1 / 2 iğne kullanarak, delinme lens RPE kavşakta ventral retina. Bu deliğin içine yerleştirin ve bir kenarı bir microscissors optik disk ventral retina ile dikey bir kesi yapmak. Bunu kaldırmak Bu yönlendirmek için retina sağlayacaktır. </li><li> Ince nokta forseps ile RPE çıkarın. RPE bir forseps ile ventral kesi alın ve RPE sıkıca tutturulmuş RPE lens kavşak, özellikle retinanın RPE kabuğu diğer forseps kullanabilir. RPE çıkardıktan sonra, ince forseps ile objektif kavramak ve lens çıkarmak için yukarı ve dışarı çekin. Retina, optik sinir başı çevresinde forseps koyarak çıkarın ve retina çimdik. Için retinanın transfer PBS dolu, iyi retinae geldi parça hangi tutarak hangi başları. </li><li> Kontralateral retinanın için 4-5 adımları tekrarlayın ve diğer tüm electroporated embriyolar. Olmayan enjekte retina immün için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. </li><li> GFP + hücreler (yeşil retinae) için tüm retinae tarama floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Tüm GFP + retinae için elektroporasyon bu embriyo başarılı oldu ve bu retinae ve buna karşılık gelen bir beyin (görsel sistem bozulmamış) daha fazla analizi (yani kesit ve immün) (Şekil 1) işlenebilir . </li></ol> Bölüm 3a, ex vivo retina elektroporasyon enjekte ve in vitro E14.5 fare retinae içine DNA electroporating <ol><li> 0.2 ml anestezik karışımı ile E13.5-E14.5 aşamada anne anestezisi ve o anestezi altında tam olduğundan emin olun. Deri ve karın boşluğunda embriyolar maruz kesmek için makas kullanın. Forseps ile embriyonik zinciri yukarı kaldırın ve bağ dokusu tamamen anneden tüm embriyonik zinciri kaldırmak için kesti. DMEM/F12 ile buz üzerinde bir Petri kabındaki embriyonik zinciri yerleştirin. Servikal dislokasyon ile anne Euthanize. </li><li> Bir microscissors ile tüm rahim duvarından geçerek kesin. Sonra her bir embriyo, plasenta kapalı, amniyon kesesi ve tutam çıkarmak için forseps kullanabilir. Her embriyo başını kesmek ve buz üzerinde DMEM/F12 başka bir Petri kabındaki başkanları toplamak. </li><li> (Bkz. Bölüm 1), ağız pipetlemeyin veya piston pipetlemeyin kullanarak, istenilen miktarda DNA çözüm mikropipet doldurun. </li><li> Bu protokolde, DNA, periferik dorsal retina içine enjekte edilecektir. Bir DNA enjeksiyon yeri ve elektrot kürekler konumlandırma ayarlayarak diğer retina bölgelerinde hedefleyebilir. </li><li> PBS ile diseksiyon çanak bir kafa transferi ve baş sırt tarafında pin up. Retina üzerinde cilt kaldırmak için forseps kullanın. </li><li> Holding mikropipet ~ 10 ° yatay konumda (dorsal retinanın eğrilik aslında paralel), bu yüzden, ucu RPE ve dış retina tabakasının arasında olduğunu RPE ile mikropipet itin. Bu uzaya ~ 0.1-0.4 ul DNA çözüm sınırdışı tüm alan yeşil sıvı dolum ve RPE de delikten dışarı sızdıran izlenebilir olmalıdır. Kontralateral retina enjeksiyon tekrarlayın. </li><li> Dikkatlice ama hızlı bir şekilde başın ventral tarafta pozitif (+) kürek, pimleri kaldırmak ve başının etrafında (PBS dalmış tutmak baş) elektrot kürekler. 4 40-V, 60 Hz 50 ms darbe, sonra buz (Şekil 2) DMEM/F12 ile bir çanak içine başın arka tarafında yerde sunun. <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig2.jpg" alt="Şekil 2" /></li><li> Tüm başkanları ve tüm DNA çözümleri için 5-7 adımları tekrarlayın. (Enjekte her biri farklı DNA çözümü için iyi bir) tamamladıktan electroporations sonra, 4-iyi bir çanak oksijenli SFM çözüm ~ 1.5 ml ekleyin ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Bir retina yukarı bakacak şekilde, bir baş DMEM/F12 ile bir diseksiyon çanak aktarın. (Ya da yan ters hedef bölge), ventral retina tutam ince forsepsve RPE bir delik gözyaşı. Özellikle lens retina kavşakta, retinanın RPE kabuğu forseps bir ucunu bu delikten. Bu inkübasyon sırasında kendi üzerine çökmeye retina neden olacaktır, çünkü retina kesmek ya da zarar vermeyin. (Lens dokunmadığınızdan), retina üssünde kıstırma, optik sinir retina pop RPE çıkardıktan sonra, forseps kullanabilir. Oksijenli SFM retinae aktarın. Başının üzerinde Flip ve kontralateral göz için tekrarlayın. </li><li> Tüm electroporated başkanları için adım 9 tamamlayın. 40-48 saat 37 ° C&#39;de oksijenli SFM retina inkübe edin. </li></ol> Bölüm 3b: ex vivo retina elektroporasyon Hasat ve GFP, kaplama + retina eksplantlar (2 gün sonrası elektroporasyon) <ol><li> DMEM/F12 bir Petri kabı kapağının içine iyi bir oksijenli SFM tüm retinae aktarın. Bir retina seçin ve retinanın GFP + (yeşil) bölümü görselleştirmek için floresan diseksiyon kapsamı kullanmak. </li><li> Microscalpel ve forseps kullanma, incelemek ve sadece bir GFP + yığın retinanın kalır böylece retinanın olmayan GFP + kısmını atmak. GFP + retinanın özellikle seçmek için diseksiyon boyunca sürekli floresan ve düzenli ışık arasında geçiş yapmak için yararlı olur. DMEM/F12 ile iyi GFP + retina aktarın. </li><li> Iyi bir tüm retinanın için 2. adımı tekrarlayın. Her bir DNA durumu (her biri farklı bir yanı), yeni bir Petri kabı ve DMEM/F12 orta kullanın. </li><li> Bu GFP + retinae kaplama için küçük retina eksplantlar içine disseke olmalıdır. Diseksiyon kapsamında microscalpel küçük eksplantlar GFP + retinanın büyük bir parça kesti. Eksplantlarındaki dikdörtgen olmalı, uzunluk ve genişlik ~ 200-300 mikron. DMEM/F12 ile iyi bir bütün eksplantlar toplayın. Bir GFP + yığın retina ~ 4-10 GFP + doku büyüklüğüne bağlı retina eksplantlar üretmek gerekir. Tüm GFP + toplandı retina bölgelerinde için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Tüm GFP + retina eksplantlar hazırladıktan sonra, SFM 250 ul +% 0.4 metilselüloz kültür yemekleri laminin kaplı (bkz. Bölüm 1) (4 ° C&#39;de muhafaza) Transferi 4-8 GFP + kültür çanak ve hafifçe yarım çanağı merkezi ve kenar arasında yer eksplantlar bir çokgen, eksplantlar düzenlemek için forseps kullanabilir eksplantlarında. </li><li> RGC katman eksplant hangi tarafta belirleyin. Bazen RPE kristalleri karşı tarafa RGC katmanı olduğunu belirterek, dış retina tabakasının bağlı kalır. Buna ek olarak, RGC bir tarafı genellikle uygun eksplant yönde yardımcı olabilecek bazı hücresel enkaz vardır. </li><li> RGC aşağı tabakası ile forseps, cam lamel uyacaktır böylece eksplant merkezinde sıkıca bastırmak için kullanın. Forseps eksplant bir girinti görülebilir, bu normaldir. </li><li> Bir kültür çanak tüm eksplantlarında kaplama sonra, 37 transfer ° C inkübatör. Retina aksonlar kaplama sonrası ilk 4-6 saat gözlenir ve eksplantlar birkaç gün boyunca sağlıklı kalır, ama önemli üremesine yol 24 saat sonra ortaya çıkabilir. Eksplantlarındaki 30 dakika ile immunohistokimyasal (Şekil 2) için% 4 PFA ile sabit, çok sayıda in vitro tayinlerde için kullanılabilir. </li></ol> Sınır Testi <ol start="8"><li> Alternatif olarak, (bkz. Bölüm 1) sınır tayini için hazırlanmış olup, bir çanak 4 GFP + eksplantlar aktarın. Sınırın yerini yakın, çanak merkezi bir dikey çizgi eksplantlar düzenleyin. </li><li> Floresan diseksiyon mikroskobu, plaka altında eksplantlar floresan sınır ~ 50-150 mm böylece. RGC aksonlar için yeterli zaman sağlayan, sınır substrat ulaşmak için 24 saat 37 ° C&#39;de yemekleri inkübe edin. Eksplantlarındaki immün (Şekil 2) takip 30 dakika boyunca% 4 PFA sabit olabilir. </li></ol> Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1333/1333_v2fig3.jpg" alt="Şekil 3" />

<ol>
	<li>Chalupa, L. M., Williams, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse. , (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li><li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection.">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li></ol>

Bu video, embriyonik fare RGCs içine utero ve ex vivo gen teslimat için elektroporasyon teknikleri, göstermiştir. Utero retina elektroporasyon RGCs gen ekspresyonu işlemek için bir mekanizma sağlar ve in vivo olarak akson projeksiyonları görselleştirmek. Embriyoların hayatta kalmak için izin vermek postnatal hedef bu GFP + RGC projeksiyonları muayene izin verir, lateral genikulat çekirdeği (LGN) ex vivo, in vitro tayinlerde ile kullanmak için özel bir retina bölgeleri hedef retina elektroporasyon daha kontrollü bir yeteneği sağlar. In vivo ve in vitro analizler bu teknikleri türetilmiştir birleştiren, normal bir arka planda bir alt kümesi RGCs RGC gelişim ve akson projeksiyonları kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Bizim gösteri utero ve ex vivo gen ekspresyonu etkisi RGC farklılaşma, dendritik morfoloji, elektrofizyolojik özellikleri, sinaps oluşumu ve düzgün tedirginlikler Böyle bir fesih bölgeleri hedefleyen eğitim retina electroporations için yararlı olabilir, hem optik kiazma RGC akson rehberlik odaklanırken LGN ve üstün colliculus.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (with foot paddle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Round tweezer electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nepa Gene</td>
<td>CUY650-5 or CUY650-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silk Sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>101-2636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass micropipettes with plungers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>5-000-1001-X10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibiototic-antimycotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM/F12 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11330057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8806-5G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-1884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M0512</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corporation</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-ornithine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells

Retina ve tek çıkış nöron, retina ganglion hücre (RGC), hücre farklılaşması, akson rehberlik, retinotopic organizasyon ve sinaps oluşumu [1] gibi biyolojik soruları incelemek için mükemmel bir model oluşturmaktadır. Bir dezavantajı, verimli ve güvenilir aksi erişilebilir fare görme yolları, özellikle, in vivo RGCs gen ekspresyonu işlemek için yeteneksizliği. Transgenik farelerin gen ekspresyonu işlemek için kullanılan, ancak bu yaklaşım, genellikle zaman alıcı pahalı ve istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Civciv, ovo elektroporasyon, retina ve RGC kalkınma incelenmesi için RGCs gen ekspresyonu işlemek için kullanılır. Benzer elektroporasyon teknikleri yenidoğan fare Yavrularda geliştirilmiş olmasına rağmen, [2], yetişkin sıçanlarda [3], ve embriyonik fare retinae in vitro [4], in vivo RGC geliştirme ve akson projeksiyonları bu stratejilerin hiçbiri tam karakterizasyonu izin verir. Bu amaçla, özellikle embriyonik fare RGCs [5, 6], hedef elektroporasyon, utero ve diğer ex vivo bir iki uygulama geliştirdik . Utero retina elektroporasyon ile misexpress veya downregülasyon RGCs belirli genlerin ve rehberlik kararları, ara hedefler, bu optik kiazma ya da hedef bölgelerde, örneğin incelenmesi sağlayan, in vivo olarak görme yolları yoluyla akson projeksiyonları izleyin Lateral genikulat çekirdeği. RGCs bir başka vahşi-tip arka planda bir alt kümesi gen ekspresyonu rahatsızlık vermesini retina yol boyunca gen fonksiyon bir anlayış kolaylaştırır. Ayrıca, in vitro RGC akson büyüme analiz için bir arkadaşı tekniği geliştirdik. Biz, embriyonik kafaları ex vivo electroporate toplamak ve tüm retinanın inkübe, bu retinae birkaç gün sonra eksplantlar hazırlamak. Retina eksplantlar rehberlik ipuçları veya diğer faktörler electroporated RGC akson yanıt incelemek amacıyla bir dizi in vitro tayinlerde kullanılabilir. Özetle, bu teknikler genler RGCs misexpress veya downregülasyon ve RGC geliştirme ve akson projeksiyonları inceleyerek çalışmalar büyük ölçüde yardımcı olmalıdır yeteneğimizi arttırır.

Watch this Scientific Journal Video about In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells at JoVE.com

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik mevcut<em&gt; In utero</em&gt; Ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elektroporasyon. Bu teknikler bir gen ifadesinde değişiklikleri, RGC geliştirme, akson rehberlik ve fonksiyonel özellikleri nasıl etkilediğini incelemek için olanak sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

18.7K Görüntüleme.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik mevcut In utero Ve Ex vivo Elektroporasyon. Bu teknikler bir gen ifadesinde değişiklikleri, RGC geliştirme, akson rehberlik ve fonksiyonel özellikleri nasıl etkilediğini incelemek için olanak sağlar.

Video: In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol, we outline the experimental methodology for preparing rats for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E15-E21 rats, however it is most commonly performed at E16 as shown in this video.

E16 Rat Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Biyoloji

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.