Yazarlar akciğer perfüzyon tekniği onun tavsiye için Dr Lubor Borsig (Fizyoloji Enstitüsü, Zürih Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Kanton Zürih Krebsliga, Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, Lydia Hochstrasser Vakfı, Zürih, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, SNF, İsviçre, Schweizerischer Verein Balgrist ve Üniversitesi bağışları ile desteklenmiştir Zürih.

1. In-situ Akciğer Perfüzyon ve Fiksasyon <ol><li> ~ 150 ul fosfat IP enjeksiyonu ile farelerin anestetize salin (PBS) ile 112.5 mg / kg (vücut ağırlığı) ketamin, 16.5 mg / kg ksilazin, ve 15 mg / kg &#39;ye asepromazin (veya uygun bir ağrı kesici içeren başka bir anestezi ile). Içeren tamponlu </li><li> Fare refleksleri artık gözlenen olduğunda, geri aşağı ameliyat masasında düzeltmek ve aşağı kaygan kıllar% 70 Etanol ile kürk ıslak. </li><li> Boynuna karın cilt kadar açın ve yanlara çekin veya kaldırın. </li><li> Geniş bir boyuta periton ve toraks açın. Sonraki perfüzyon azalmış etkinlik kaçınmak için büyük gemilerin rüptürü (örn. vena jugularis) önleyin. </li><li> Karaciğer altında vena kava caudalis kesin. </li><li> Akciğer tamamen beyaz ve kadar dayak kalbin sağ ventrikül içine yavaşça 10-15 ml PBS enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 20 ml şırınga kullanınkalp (asistoli) yenerek durur. </li><li> Vasküler klemp ile karaciğer ve diyafram yukarısında kan damarlarından sıkıştırın. </li><li> Sağ ventrikül içine PBS içinde% 3 paraformaldehid ~ 2 ml (PFA) enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 10 ml şırınga kullanın. </li><li> Toraks dışında trakea ortaya çıkarın. Akciğer şişirilmiş kadar trakea içine PBS kranyal (toraks dışında) 3% PFA ~ 3 ml enjekte aynı şırınga kullanın. Hemen iğne çıkarıldıktan sonra, vasküler klemp ile ponksiyon trakea kaudal çimdiklemek ve fiksasyonu sağlamak için 10 dakika bekleyin. </li><li> Vasküler klemp üzerinde kan damarları transeksiyonu, kelepçe kaldırmak ve aşırı PFA kaldırmak için sağ ventriküle ~ 2 ml PBS enjekte. </li><li> Delinme bir iğne ile tüm akciğer lobu alt kısımları, trakea vasküler klemp kaldırmak ve de PFA kadar ilk ponksiyon trakea kaudal içine orta / PBS 01:01 gömme PolyFreeze bir çözüm 3-5 ml enjekte akciğerloblar çözümü ile değiştirilir. </li><li> Bir forseps ile kalp çekerek ve bağ dokusu bağ, kan damarları ve trakea transecting tarafından dikkatle akciğer çıkarın. Akciğere bağlı kalp tutun. </li><li> Akciğer doku analizi ile devam etmek nasıl bağlı bölümlerde 2 veya 3&#39;te protokolleri ile devam edin. Her iki analiz yapmak istiyorsanız, bir akciğer lobunun kaldırmak ve 3 altında açıklandığı gibi devam edin. 2 altında tarif edildiği gibi kalp bağlı kalan loblar işlemden geçirin. </li></ol> 2. Tüm Akciğer lobları içinde lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme <ol><li> Sıkı bir kapatma kapağının ile plastik bir kap içinde akciğer yerleştirin ve 30-60 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 2 formaldehit ile sabitleyin. </li><li> Fiksasyon çözüm çıkarın ve PBS ile iyice 3 kez yıkayın. </li><li> Taze 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal) boyama çözeltisi (X-Gal stok çözeltisi [40 mg / ml &#39;de hazırlanmış en az 10 mLDimetilformamid] 01:40 Temel Boyama Çözüm seyreltilerek, pH 7.1 (Tablo 1); ışıktan korumak). </li><li> Çözelti içinde tamamen tutmak ve hava değişimini sağlamak için kap üzerinde sadece gevşek kapak yerleştirmek için yüzme akciğer üstünde bir gazlı bezi koyun. </li><li> Işıktan korunmuş 3-5 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> X-Gal çözüm çıkarın, rezidüel X-Gal çözümü (isteğe bağlı) çıkarın ve% 4 PFA eklemek için bir kez PBS ile yıkayın. </li></ol> 3. Akciğer Cryosections yılında lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme <ol><li> Seyreltilmemiş PolyFreeze gömme orta 1/3 önceden doldur etiketli gömme kalıp. Üst lobun koyun ve lob tamamen kaplıdır kadar orta gömme ile doldurmak. Kabarcıkları önlemek için deneyin. </li><li> 20 dk için 4 ° C sıcaklıkta gömülü akciğer inkübe edin. </li><li> Daha sonra -80 ° C de yavaş yavaş kuru buz ve izopentan ve depo karışımı içinde gömülü akciğer donma </li><li> 7-10 mikron kriyo CutKriyostaz bölümleri ve SuperFrostPlus mikroskop slaytlar takar. </li><li> Nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat için 37 ° C de X-Gal boyama solüsyonu ile hemen bölümleri inkübe edin. </li><li> Distile su içinde kısa bir süre sonra 5 dk PBS 2 kez slaytları durulayın. </li><li> , 10-30 sn nükleer hızlı kırmızı ile Counter-leke distile su ile durulayın ve İmmünoreaktif-Dağı ile slaytlar monte. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Asai ark. Yüksek metastatik LM8 alt hücre hattı elde edilenler farklı ebeveyn Dunn hücrelerinden türetildiği sc primer tümörleri, kendiliğinden saptanabilir akciğer metastazları kurmazlar ki Dunn-türetilmiş LM8 OS fare modeli üzerinde özgün makale bildirilmiştir singenik C3H farelerin 14. Burada bildirilen teknikleri ile, Dunn/LM8 fare OS modellerinde metastaz oluşumu yeniden incelenmiştir. Biz istikrarlı lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücre yararlandıs ve farelerde in-situ akciğer perfüzyon ve fiksasyon için bir protokol. Deri altından enjekte edilmiş farelerin perfüze ve non-perfüze akciğer Örnek görüntüleri lacZ-transdük ve kontrol Dunn ve LM8 hücre Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir olmayan transdük. Kontrolü Dunn hücreleri enjekte farelerde, makroskopik ve mikroskopik metastaz olmayan perfüze ve perfüze akciğer (Şekil 1A, i-iv) algılanamayan kalmıştır. Ancak ilginç bir şekilde, Dunn-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde, X-gal boyaması olmayan akciğer perfüze (Şekil 1A, vi) yüzeyi üzerinde tek bir hücre ya da hücre kümeleri küçük (&lt;0.1 mm) mavi mikrometastazların odak görüldü. Içinde, Akciğerlerin situ perfüzyon ve fiksasyon daha Dunn-lacZ mikrometastaz (Şekil 1A, viii) ve görülebilirliği artırıldı. Ancak, makroskopik odakları için akıbet (Şekil 1A, v, vii) gözlenmemiştir. &lt;/ P&gt; Saydam kumanda LM8 hücreleri, zor tespit macrometastatic odakları ile enjekte farelerde çapı 0.1 mm&#39;den büyük olmayan perfüze akciğer (Şekil 1B, i) kabul edildi. Akciğer Perfüzyon (Şekil 1B, iii) odaklarının tespiti düzelmedi. Bununla birlikte, farelerde çoklu LM8-lacZ hücreleri ile enjekte X-Gal mavi lekeli makro-(Şekil 1B, D) ve mikrometastazların (Şekil 1B, vi) non-perfüze organ yüzeyine tespit edilmiştir. Ayrıca, akciğer perfüzyon daha tanımlanabilirliğini makro ve mikro metastaz (- viii Şekil 1B, vii) düzeldi. Sonuç olarak, mikro-macrometastases ve esas olarak, organ yüzeyin altında odaklar görünür hale geldiği perfüze doku geçirgenliği için, daha yüksek yoğunluk ve daha büyük bir sayıda görünür hale gelmiştir. İlave bir saatAkciğer dokusunda cryosections kullanarak istological analizi lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücreler enjekte edilmiş farelere akciğer metastazı gelişmiş tanımlanabilirliğini doğruladı. Dunn-lacZ veya LM8-lacZ hücrelerinden türetildiği primer tümörlü farelerde, ilgili kontrol hücreleri, mikrometastaz hatta tek hücre odakları primer tümörleri olan farelerin aksine akciğer bölümler (Şekil 2) kabul edildi. Ayrıca, macrometastases da kontrol LM8 hücreleri (Şekil 2C ve D) ile enjekte edilen hayvanlarda daha LM8-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde daha açık bir şekilde görünür olmuştur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Şekil 1., Spontan metastazlarının tespiti olmayan, transdüksiyon, (i-iv) ve lacZ-transdüksiyon ile (V-VIII) Dunn (A) ve LM8 (B) non-perfüze (I, II, V, VI) ile perfüze hücreleri C3H farelerde (iii, iv, vii, viii) akciğerler. Temsili X-Gal-sta Metastazlariined bütün akciğerler (v, A ve B vii) ve ilgili yakın çekimler (vi, viii A ve B) mavi görünür. Etiketli olmayan LM8 hücreleri (B i-iv) ile enjekte edilen farelerin organlarında Macrometastatic odak (&gt; 0,1 mm) yıldız işareti ile gösterilir. Yakın çekimler gösterildiği Alanları genelinde akciğerler için temsilidir. Ölçek çubukları tüm akciğer görüntüleri 1 mm ve yakın-up 0,1 mm göstermektedir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Şekil 2. Dunn ve akciğer cryosections içinde LM8 mikrometastaz saptanması. Ekim gömülü akciğer doku kesitlerinde nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de X-gal boyaması çözelti içinde inkübe edildi ve daha sonra nükleer hızlı kırmızı ile zıt edildi. Oklar Dunn-lacZ (B) veya LM8-lacZ hücreleri (D) ile enjekte farelerin akciğer bölümlerinde tanınan mikrometastatik odakları işaret. Micrometastases olmayan transdük Dunn (A) ya da LM8 hücreleri (C) ile enjekte edilen farelerde akciğer bölümlerinde saptanamaz kalmıştır. Ölçek çubukları 0.1 mm göstermektedir.

<ol>
	<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li><li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+inhibitors+and+cancer:+trials+and+tribulations.">Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations.</a> Science (New York, N.Y.). 295, 2387-2392 (2002).</li><li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+cancer:+a+review.">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li><li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals.">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538 (2011).</li><li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models.">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li><li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry.">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical &#38; experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li><li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li><li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+lacZ+gene:+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies.">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li><li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model.">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment.">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li><li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity.">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li><li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin+and+cancer+revisited:+mechanistic+connections+involving+platelets,+P-selectin,+carcinoma+mucins,+and+tumor+metastasis.">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn/LM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis.">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li><li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+(LM8)+with+high+metastatic+potential+to+the+lung.">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li><li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity.">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li><li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma.">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dunn/LM8 fare modelinde OS burada sunulan sonuçlar, in-situ perfüzyon / akciğer dokusunda tespit lacZ ile etiketlenmiş tümör hücreleri X-gal boyaması birleştiren yeni kurulan yöntem gücünü göstermektedir. İki tekniğin bu kombinasyonu tek bir hücre düzeyinde mikrometastazların lezyonların yüksek duyarlılık tespit aşağı izin verir ve aynı zamanda akciğer yüzey (Şekil 1) hem de akciğer bölümler halinde (Şekil 2) üzerindeki macrometastases bir görüntüleme artırır. X-Gal boyama da çünkü doğal kan ve doku ile ilgili renk diğer organları, in-situ perfüzyon / fiksasyonu (mikro) metastaz tespiti sadece biraz akciğer dışındaki dokularda metastatik odaklar tanımlanabilirliğini geliştirir sağlarken Bu organların 13. Başka bir organ perfüzyon yönlendirilir bile, karaciğer, örneğin, kan kaldırılması sadece kısmen kontrast bahsi artıracakween X-Gal boyama ve organ doğal rengi. Bununla birlikte, yöntem lacZ-etiketli tümör hücrelerinin her türü için geçerli olduğu, önemli ölçüde hareketsiz tek hücreli mikrometastazların seviyesine akciğer metastazı tanımlanabilirliğini arttırmak aşağı ve makro ve mikrometastazların bir miktarı kolay ve güvenilir bir miktar sağlar olacaktır. Bu yöntem ve lusiferaz ve floresan proteinleri içeren muhabiri genleri, dayalı tüm diğer tekniklerin bir sınırlama transgen ifade istikrardır. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, macrometastatic odakları içindeki tüm tümör hücreleri beta-galaktosidaz aktivitesi eksikliği gösteren mavi lekeli. Bu nekroz ile ilgili olabilir, ama daha büyük olasılıkla transgen ekspresyonu kaybı nedeniyle. Biz Dunn ve LM8 hücreleri ifade için bile sürekli seçilim altında lacZ ve diğer transgenlerin down-regülasyonu çok etkili olduğu görülmektedir. Bu nedenle fare K12 için son yıllarda yapılan çalışmalarda açıkve K7M2 ve bütün in vitro hem de yukarı saat boyunca% 100 in vivo kararlı lacZ ekspresyonu yapılmaktadır HOS insan, 143b ve Saos-2 osteosarkoma hücre hattı. LacZ ifade kez kararlı garantilidir, bu tekniğin mekanistik doku kolonizasyonu 13 gibi metastatik lezyonlar 15 eradikasyonu hedefleyen yeni tedavilerin geliştirilmesi ve test sürecini araştırmak için örneğin gen-manipüle tümör hücreleri ile çalışmalarda uygulanabilir , 16. Ayrıca, metastatik lezyonların erken tanısında kullanılan PET, (mikro) BT ve MRG gibi güncel radyolojik görüntüleme teknikleri, iyileştirilmesi için bir kriter olarak hizmet verebilir. Farklı izleyiciler ile yeni PET çalışmasında (yayımlanmamış) biz in vivo tespit akciğer açıklanan protokol ile sonradan ex vivo metastazları doğrulanmadı. Yeni bir küçük hayvan mikro-BT ile devam eden bir çalışmada (SkyScan) biz bugüne kadar ab vardırle 0,5 mm ve ex vivo aşağı 0,3 mm bir boyuta in vivo akciğer metastazları aşağı algılamak için, ama biz 0.1 mm çözünürlükte hedefliyoruz. İlginçtir, bu biz in-situ perfüzyon ve X-Gal boyama kombine yöntemi ile mikrometastaz makro-ayırt etmek ayarladığınız boyut sınırıdır. Bu da yine bu kolay ve maliyet-etkili bir tekniğin duyarlılık ve kullanışlılığı altını çiziyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamin) </td><td> Vetoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml solüsyon </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml çözelti </td></tr><tr><td> Prequilan (Acepromazine) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml çözelti </td></tr><tr><td> Bulldog Tipi vasküler klemp Serrefine </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18051-35 </td><td> kavisli, 35 mm </td></tr><tr><td> Kapaklı plastik bardak </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> Kapaklı 25 ml bardak </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal); toz </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> depo, N-Di-methylformamide 40 mg / ml &#39;ye, N-korumalı çözülür ışık -20 ° C&#39; de </td></tr><tr><td> Maksimum ışık-korumalı 4 ° C&#39;de saklanır pH 7.1 &#39;e kadar dengelenmiş temel boyama çözeltisi,,. 1 ay </td><td> kendi kendini yetiştirmiş </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1.64 g / L K3Fe (CN) 6, 2.1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 mL / L 1 M MgCl2, 2 ml / L, 10% NP40, 1 ml / L, 10% sodyum-deoksikolatın </td></tr><tr><td> PolyFreeze Katıştırma Orta </td><td> Polysciences; swiss distribütörü: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kalıp Katıştırma </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 kriyostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost slaytlar </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nükleer-Hızlı Kırmızı - Alüminyum sülfat çözeltisi </td><td> Lig Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> İmmünoreaktif Montaj </td><td> Thermo Electron, swiss distribütörü: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler ve Ekipmanları.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metastaz kanser türlerinin çoğunda başlıca ölüm nedeni ve kanser araştırma, dolayısıyla bir ana odak noktasıdır. Ancak, radyolojik görüntüleme ve tedavi eradikasyon başarısı ile mikrometastaz tespit sınırlı kalır. Hayvan modellerinde kanser araştırma 1 için çok değerli araçlar olduğu kanıtlanmış olsa da, izleme / mikrometastazlar görselleştirme preklinik çalışmalarda bir meydan okuma ve metastatik yayılım eksik değerlendirilmesi potansiyel klinik çalışmalarda 2 hayal kırıklığı yaratan sonuçlar yol açar kalır. Sonuç olarak, nihayet normal dokuda tek hücre düzeyinde metastaz tekrarlanabilir ve güvenilir algılama sağlamak için metodlarla rafine büyük ilgi var. Ana odak nedenle mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), pozitron emisyon tomografisi (PET), biyolüminesans veya floresan görüntüleme gibi in vivo tümör hücrelerinin algılanmasına izin teknikleri üzerinde &lt;&gt; 3,4 sup. Biz şu anda farklı osteosarkom modelleri primer tümör büyümesi ve metastaz vivo izlenmesi için bu teknikleri optimize edilmiştir. Bu tekniklerin bazıları qPCR 5, 6 ya da FACS histolojik boyama farklı türleri gibi klasik yöntemlerin yanında metastaz ex vivo analiz için de kullanılabilir. Bir kriter olarak, kararlı transfeksiyon veya lacZ geni ile tümör hücrelerinin transdüksiyonu bakteriyel bir enzim kromojenik substrat 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D metabolize β-galaktosidaz kodlayan bu çalışmada kurduk çözülmeyen bir indigo mavisi 7 ve burada gösterildiği gibi tek hücre düzeyinde fare doku ex vivo olarak tümör hücrelerinin son derece hassas ve seçici histokimyasal mavisi boyama aşağı izin verir-galactopyranoside (X-Gal). Bu çalışmalarda metastaz 8 hassas doğrulama bir yeni değerlendirmede olanak sağlayan düşük maliyetli ve ekipman yoğun değil araçtırticancer tedaviler 9-11. X-gal boyası bir sınırlayıcı faktör de vaskülarize dokuların kan ile ilgili kırmızı boyama, örneğin düşük kontrast olduğunu. Akciğer dokusunda bu sorunu yerinde akciğer perfüzyon, son zamanlarda Borsig ark. 12. Kan bunları temizlemek için ve altında in-situ bunları düzeltmek ve gömmek için anestezi altında farelerin akciğerlerinde perfüze tarafından kurulmuş bir teknik ile çözülebilir trakea yoluyla enflasyon. Bu yöntem aynı zamanda akciğer çökmesi önler ve böylece histolojik analiz için doku kalitesini geliştirmektedir fonksiyonel akciğer alveol, morfolojisini muhafaza eder. Bu çalışmada, biz lacZ eksprese tümör hücrelerinin X-gal boyası bir arada yararlanır ve in-situ perfüzyon ve akciğer doku fiksasyonu., Yeni bir protokol, tarif Bu rafine protokol akciğerde tek metastatik hücrelerinin yüksek hassasiyet algılama sağlar ve d yeni bir çalışmada bize etkinBaşlangıçta 14 sigara metastatik olduğu açıklanan bir fare modeli 13 yılında &quot;atıl&quot; akciğer mikrometastazlar etect.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tum

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama sağlar<em&gt; In-situ</em&gt; Akciğer perfüzyon ve fiksasyon ve X-Gal boyama<em&gt; LacZ</emTümör hücreleri&gt; etiketli.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K Görüntüleme.  Balgrist University Hospital, Zurich. Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama sağlar In-situ Akciğer perfüzyon ve fiksasyon ve X-Gal boyama LacZ etiketli.

Video: Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

İzole Yöntemi<em&gt; Ex vivo</emBir Rat Modelinde&gt; Akciğer Perfüzyon: Sıçan EVLP Programı Geliştirme Öğrenilmiş Dersler

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Tıp

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Akut Akciğer Hasarı Açık Trakeostomi Gastrik Asit Aspirasyon Fare Modeli Maksimal Akut Ölümcül olmayan Akciğer Hasarı Sonuçlar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Kantitatif analiz düz kas hücre soy izleme farelerin gelişmiş aterosklerotik lezyonları içinde hücresel kompozisyon

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Doğrudan Intratracheal Lipopolysaccharide Instilasyon ile farelerde akut akciğer hasarının İndükleme

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Norannemik Negatif Basınçlı Ventilasyon Ex Situ Akciğer Perfüzyonu: Akciğer Fonksiyonlarının ve Metabolizmasının Değerlendirilmesi

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

Dolaşım Ölümü Sonrası Kontrollü Donasyonda Abdominal Normothermik Rejyonel Perfüzyon ile Kombine Akciğer Hızlı İyileşme Tedariği

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

Agaroz gömülü vibratom bölümleri kullanılarak yenilikçi akciğer görüntüleme

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

Yazar Spotlight: Agaroz Gömülü Akciğer Dokusu Bölümlerini Kullanarak Uzamsal Protein Ekspresyonunun İncelenmesi 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

Multipleks Floresan Görüntüleme için Agaroz Gömülü Akciğer Dokusunun Otomatik Vibratom Kesiti

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...