Bu protokol, sferoidlerin üç boyutlu tümörlerini oluşturmak için standartlaştırılmış bir yöntem gösterdi. Ve bu metodoloji, 3D tümör yapılarının yüksek devre ve yüksek içerik analizini sağladı. Standart bir tümörlü sferoid yapı yöntemi ve yüksek verimli bir görüntüleme ve analiz sistemi kullanılarak, üç boyutlu sferoidler üzerinde oluşturulan ilaç testlerinin etkinliği ve doğruluğu önemli ölçüde artırılabilir.
Bu protokolde, NCI-H23 sferoidini örnek olarak tedavi etmek için AMG510'u kullandık. Deneyden, kanserli hedefli ilacın tümör sferoidleri üzerinde önemli bir etkisini gözlemleyebildik. Başlamak için, U şeklinde bir kuyu tabanına sahip 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre yapışma önleyici reaktif pipet edin ve 10 dakika bekletin.
10 dakika sonra, kaplama reaktifini aspire edin ve sterilize PBS ile iki kez yıkayın. Kültür plakasını, kullanıma kadar% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin.
Daha sonra, kültür ortamını çıkarmak için bir T25 şişesinde kültürlenmiş hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve genişlemiş hücreleri bir mililitre% 0.25 tripsin EDTA ile 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte bir inkübatörde bir ila iki dakika boyunca tedavi edin. Mikroskop altında hücre şeklini onaylayın. Daha sonra T25 şişesinde kullanılan tripsin EDTA süspansiyonunu aspire ederek ve hücreleri dört mililitre taze ortam ile yıkayarak tripsin tedavisini durdurun.
Tüm süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve artık hücreleri yıkamak ve tüpe eklemek için bir mililitre taze ortam kullanın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 186.48 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücre peletine 10 mililitre taze ortam ekleyin ve hücreler homojen bir süspansiyona girene kadar hafifçe pipet yapın.
0.1 mililitre hücre süspansiyonunu yeni bir santrifüj tüpüne aspire edin. 0,9 mililitre taze ortam ekleyin ve ardından süspansiyonu iyice pipetin. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini çıkarın.
Bu işlemi bir veya iki kez tekrarlayın ve ortalama bir değer alın. Mililitre başına 50.000 hücrelik nihai tohumlama yoğunluğuna ulaşmak için süspansiyonu seyreltin. Daha sonra, 48 kuyucuklu bir U-taban plakasının her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Sızdırmazlık filmini plakanın etrafına sarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 119.35 G'de santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, koruyucu filmi çıkarın ve kuyucukları çevreleyen su kanalına beş ila sekiz mililitre sterilize su ekleyin. Plakayı beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bu süre zarfında su kanalına herhangi bir su değiştirmeyin veya takviye etmeyin ve takip eden beş gün boyunca hücre agregasyonunu gözlemleyin. Jel gömme için, dondurulmuş jeli eksi 20 santigrat derece buzdolabından çıkardıktan sonra, deney sırasında tüm süre boyunca bir buz kutusuna yerleştirin. Hücre sferoidlerini mikroskop altında gözlemleyin.
Jel gömme başlamadan önce, sferoidlerin durumu tekrar kontrol edilmelidir. Ortamın 150 mikrolitresini dikkatlice çıkarın ve önceden soğutulmuş pipet ucunu kuyunun etrafında ve içinde hareket ettirirken sıvı jeli kuyunun duvar tarafından yavaşça ekleyerek her bir sferoidi jelin içine yerleştirin. Beş dakika bekleyin ve jel eşit şekilde yayılmazsa, jeli 10 mikrolitrelik bir pipet ucuyla hafifçe pipetin.
Her kuyucuk bir tümör sferoidi, mililitre jel başına 25 mikrolitre 3.5 miligram ve 50 mikrolitre tam kültür ortamı içerir. Kontrollere 75 mikrolitre ortam da ekleyin. Hidrojelasyon tamamen tamamlanana kadar plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.
Jelasyon durumunu mikroskop altında onaylayın. Her numuneye 125 mikrolitre taze ortam yerleştirin ve sferoidleri 7 ila 10 gün daha kültürleyin. Her biri dört ila altı kuyucuklu sferoid grupları hazırlayın ve analiz için bunlardan en az üçünü seçin.
İlacı üreticinin talimatlarına göre çözün ve DMSO ile 100 kat çalışma çözeltisi hazırlayın. Pozitif bir kontrol olarak% 0.1 DMSO kullanın ve her bir kuyucuğa 125 mikrolitre ilaçla tedavi edilmiş ortam ekleyin. Plakayı,% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin.
Bu aşamada, her kuyucuk bir tümör sferoidi, mililitre jel başına 25 mikrolitre 3.5 miligram ve 175 mikrolitre ortam içerir. Kontroller 200 mikrolitre ortam içerir. Üreticinin yönergelerine göre bir alamarBlue tahlil kiti kullanarak küresel canlılığı ölçün.
Her bir kuyucuktan 100 mikrolitre süpernatant ortamı yeni bir test plakasına aspire edin. Ardından, bir mikroplaka fotometre kullanarak canlılığı ölçün. Sferoidleri jele gömdükten sonra birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçün.
Kültür plakasının her bir kuyucuğuna 80 mikrolitre taze ortam ekleyin. Ardından, ilaçla tedavi edilen ortamın başka bir 100 mikrolitresini değiştirin. Kuyuda alamarBlue kalıntısı olmadığından emin olun.
Görüntülemeden önce ortamın 100 mikrolitresini aspire edin ve plakayı sahneye yerleştirin. On kat hedefe sahip otomatik bir mikroskop kullanarak sferoidlerin dijital görüntülerini elde edin. Mikroskop bu küreleri otomatik olarak odaklayabilir ve merkezileştirebilir.
Otomatik görüntülemeyi bekleyin. Her küre için dört görüntü elde edilir. Yüksek içerikli görüntüleme sistemine bağlı yazılım ile entegre bir görüntü oluşturulur ve işlenir.
Görüntü yama işlemi düğmesine tıklayın ve yazılımdaki entegre görüntüleri seçin. U net modeli'ni seçin ve dönüşüm oranını yazın. Görüntü işlemeyi başlatmak için ekranın altına tıklayın.
Çap, çevre ve pürüzlülük verilerini elektronik tablo yazılımına kaydedin. Son olarak, ilaçla birlikte 100 mikrolitre taze ortam ekleyin ve plakayı% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin. Farklı konsantrasyonlarda AMG510 ile muamele edilen ve yüksek içerikli bir mikroskop tarafından otomatik olarak yakalanan NCI-H23 hücre sferoidlerinin parlak alan görüntüleri bu şekilde gösterilmiştir.
Sütunlar farklı günleri, satırlar ise farklı ilaç konsantrasyonlarını temsil eder. Sonuçlar, her koşul için üç sferoid içerir. AMG510 ile tedavi edilen örnek gruplarının tümör sferoid canlılığı birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçüldü.
Konsantrasyon gradyanlarına sahip numunelerin terminal hücre canlılığı bu şekilde gösterilmiştir. Tümör sferoid çapları birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçüldü. Küresel büyüme oranı, orijinal hacme göre terminal hacmi olarak tanımlandı ve küresel çaplar kullanılarak hesaplandı.
Sferoid büyüme inhibisyon oranı hacme göre tanımlandı ve sferoid çaplar kullanılarak hesaplandı. Tümör pürüzlülüğü, yazılım tarafından birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçüldü ve tümör sferoidlerinin invazivliğini gösterdi. Sferoidin çevresi, derin öğrenme algoritmaları kullanılarak yazılım tarafından bulundu ve çizildi.
Odak düzlemindeki küresel alanlar daha sonra J görüntüsü ile ölçüldü ve bu verilere dayanarak fazla bir çevre indeksi hesaplandı. Bu mesajın takip edilmesi kolay olsa da, örneklerin yine de dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.
