Kültürlü drosophila beyin eksplantlarında sessiz nöral kök hücreleri yeniden aktive etmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, kültür ortamına eksojen faktörler sağlayabilir ve nöroblast reaktivasyonunu test edebilir. Daha iyi kök hücre tedavileri, sessiz kök hücrelerin dışsal ipuçlarına nasıl tepki verdiğini ve hücre döngüsüne nasıl girdiğini daha iyi anlayarak geliştirilebilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma bilimcisi olan Susan Doyle olacak. Başlamak için, diseksiyon mikroskobu altında üzüm agar plakasından yaklaşık 20 ila 25 taze yumurtadan çıkmış larvayı dikkatlice seçin. Bir Petri kabını yaklaşık iki mililitre PBS ile doldurun ve aletin larva içeren ucunu PBS'ye iki dakika batırın.
İki dakika sonra, sıvıyı altta toplamak için çanağı bir açıyla bahşişleyin ve küçük bir boya fırçası kullanarak larvaları Petri kabının dibindeki sıvıdan fırçalayın. Tüm larvaları boya fırçası üzerinde toplayın ve larvaları PBS içeren Petri kabına geri aktarmadan önce% 70 etanol içinde kısaca durulayın. Çalışma alanına, diseksiyon aletlerine, forsepslere ve iki cam saat kabına% 70 etanol püskürtün ve tezgahta kurumasını bekleyin.
Takviyeli Schneider'in kültür ortamını veya SSM'sini yapın ve buzun üzerine yerleştirin. Her cam saat kabının içine bir mililitre ortam pipetin. Steril uçlu bir mikropipet kullanarak, taze yumurtadan çıkmış larvaları PBS plakasından ilk cam saat kabındaki SSM'ye aktarın.
SSM ile ikinci cam saat kabına yerleştirilen larvaların beyinlerini, diseksiyon mikroskobu altında forseps kullanarak ve büyütmeyi gerektiği gibi ayarlayarak parçalara ayırın. Ağız kancalarını tutmak için bir forseps kullanın ve diğeriyle birlikte, vücudu yavaşça yarıya kadar tutun ve larvaları iki parçaya bölmek için ters yönde çekin. 15 ila 20 beyni diseke ettikten sonra, steril 24 delikli bir kültür tepsisinin bir kuyucuğuna bir mililitre SSM ekleyin.
Bir mikropipet ve steril bir uç kullanarak, taze disseke edilmiş beyinleri SSM'ye aktarın, ardından medyanın 25 santigrat derecede 24 saat boyunca beyinlerle inkübasyonu. Pipet, 10 milimolar 5-etinil-2'deoksiüridin veya EDU stoğunun 10 mikrolitresini, 990 mikrolitre SSM ile steril bir mikrosantrifüj tüpüne karıştırın, ardından bir mililitre EDU SSM'yi steril 12 delikli kültür tepsisinin bir kuyucuğuna pipetleyin. SSM içeren kuyudan EDU SSM çözeltisini içeren yeni kuyuya steril uçlu bir mikropipet kullanarak beyinleri aktarın ve 25 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra, EDU etiketli beyinleri, bir mililitre fiksatif içeren aynı kültür tepsisindeki başka bir kuyuya aktarın ve beyinlerin 20 dakika boyunca sabitlenmesine izin verin. Fiksasyondan sonra, bir mikropipet kullanarak beyinleri hızlı bir şekilde 72 delikli bir mini tepsi kuyucuğuna aktarın. Beyinleri 10 mikrolitre PBT'de üç kez durulayın ve her biri 10 dakika boyunca üç yıkamayı tekrarlayın, böylece beyinlerin her zaman bir miktar sıvı ile kaplanmasını sağlayın.
Pipet beyinlerin üzerine 10 mikrolitre blokaj çözeltisi verir. Tepsiyi örtün ve kenarından bir parafilm şeridi ile kapatın. Şekil, SSM'de insülin ve boyama ile 24 saat kültürlendikten sonra büyük boyutlu EDU pozitif ve deadpan-pozitif nöroblast hücrelerini göstermektedir.
İnsülinsiz Schneider'in medyasında 24 saat çalıştıktan sonra, yeni yumurtadan çıkmış Oregon R vahşi tip beyinlerin, dört mantar gövdeli nöroblast hücresi ve bir ventrolateral nöroblast hücresi dışında, büyük boyutlu EDU-pozitif ve deadpan-pozitif nöroblast hücreleri yoktu. Konfokal görüntüleme sırasında, ekilen beyin dokusundaki küçük ila büyük boyutlu delikler gibi hasarlı bazı beyin yarımküreleri zaman zaman gözlenmiştir. Delikli beyinler analiz için kullanılmadı.
Herhangi bir doku hasarını önlemek için dokuları dikkatlice disseke edin ve nazikçe pipet yapın. Ayrıca mümkün olduğunca steril olmaya çalışın ve kültürlerinizi kirletmeyin. Kültür medyası farklı faktörler eklenerek kolayca manipüle edilebildiğinden, Bu teknik, dışsal sinyalleme ve nöroblast sessizlik giriş ve çıkışı ile ilgili gelecekteki hipotezleri ele almak için kullanılabilir.
