Bu çalışma, Rita Allen Vakfı hibe Seena Ajit fon tarafından desteklenmiştir. Yazarlar alet kullanımı, bilimsel ve teknik yardım için Güney Carolina Elektron Mikroskopi Merkezi Üniversitesi&#39;nden Erika Balogh ve Dr Soumitra Ghoshroy kabul etmek istiyorum.

Insan ve kemirgenler kan örnekleri kullanan tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak idam edildi. İnsan konular Tıp Kurumsal Değerlendirme Kurulu Drexel University College ve hayvanlar kullanıldı çalışmaları için tüm prosedürleri Drexel en Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Kullanım Kurulu edildi onayladığı bilgilendirilmiş onam verdikten sonra alındı. 1. Blood Exosome saflaştırma (~ 5.5 saat) İPUÇLARI <ul><li class="jove_content"> Biz Mirvana miRNA izolasyon kiti 300 ul RNA lizis tamponu kan bir tüp (~ 10 ml insan kanı ve ~ 2 ml fare kan) den exosomes tekrar süspansiyon. </li><li class="jove_content"> Hücre kültürü ortamından exosomes arındırmak için, ortam hücreleri çıkarmak için 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de bükülmüş ve 12,000 x g&#39;de santrifüj işleminden sonra 0.22 um bir filtre ile filtre edilir. Hücre kültürü ortamından saflaştırılması exosomePBS, PBS yıkama veya ikinci ultrasantrifugasyon adımda bir seyreltme gerektirmez. </li><li class="jove_content"> Saflaştırılmış exosomes ultrasantrifugasyon aşamasından sonra bir sükroz gradyent santrifügasyonu adım ekleyerek, proteomik çalışmaları için kullanılacak ise protein agregatlarının ve kirletici 15 miktarını azaltacaktır. </li><li class="jove_content"> Exosomes gözlenen morfolojisi, kaynak ve TEM için işlem adımları iki bağlı olarak farklılık gösterebilir. Daha önce numune işleme 9,15 farklılıkları isnat edilmiştir exosomes için fincan şeklinde morfolojisi gözlenmedi. Immunogold etiketleme dahil olmak üzere TEM görüntüleri exosomes 9,16,17 edilen safra ve kortikal kültür kan, dahil olmak üzere farklı kaynaklardan önceki raporlar benzer. </li></ul><ol><li> 10-60 dakika oda sıcaklığında dik 5x ve yer kan içeren EDTA kaplı tüp ters. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüje </li&gt; <li> 15 ml tüpler üst tabaka, plazma, toplayın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> PBS eşit bir hacmi ile akışkan seyreltin. 4 az 2,000 x g&#39;de 30 dakika santrifüje ° C </li><li> 4 ° C de, santrifüj tüpleri 24 ml toplam hacmi için 1X PBS ekleyin ve 12,000 x g hızında 45 dakika santrifüj transfer </li><li> 4 ° C&#39;de tüpler ultrasantrifüjdeki ve 110.000 xg 2 saat santrifüj transfer </li><li> PBS içinde yeniden süspanse pelet ve 4 ° C&#39;de 100,000 xg&#39;de 1 saat santrifüj </li><li> Uygun bir tampon içinde süspanse pelet (RNA lizis tamponu). </li><li> Elektron mikroskopisi ve Western blot analizi için sırasıyla PBS veya RIPA tampon içerisinde yeniden süspanse edin. </li></ol> 2. Bir Modifiye Mirvana miRNA İzolasyon Kiti (~ 1 saat) kullanarak RNA Arıtma İPUÇLARI <ul><li class="jove_content"> , Kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; satıcıdan protokol sadece miRNA arıtma seçeneği verir de, her zaman ikimiz de aynı örnekten çalışma böylece mRNA olmak üzere toplam RNA izole ve miRNA. </li><li class="jove_content"> Bir on-sütunu DNase işleme aşamasına eklenmesi mevcut olabilir DNA izlerini ortadan kaldırır. Exosomes kaynağına bağlı olarak, DNA fare ve insan mast hücresi çizgileri 8 aynı kromozomal DNA dizilerinin kültür kardiyomiyositlerde 18. ortamdan saflaştırılmıştır exosomes tespit edilmiştir dahil olmak üzere bazı kaynaklardan saflaştırılmış exosomes katılmamış olduğu bildirilmiştir. </li><li class="jove_content"> Satıcı sadece yeterli bir 700 ul eklenmesi için çözüm 1 yıkayın sağlar çünkü yıkama solüsyonu 1-350 ul (aşağıda Adım 2.4) hacmi azalır. Hacmi azalır değilse tüm kit içeriğini kullanarak için sol yeterli çözüm değildir. Kalan adımları üretici tavsiyelerine göre yapıldı. </li></ul><ol><li> 1/10 vo ekleme10 dakika boyunca buz üzerinde MiRNA homojeni katkı maddesi (30 ul) ve inkübe lume. </li><li> Asit-fenol hacmi ile ektraktlayınız: başlangıç ​​lizat hacmi eşit kloroform yer alır. Santrifüj ve yeni bir tüp içinde üst faz kurtarmak. </li><li> 1.25 hacimleri% 100 etanol (375 ul) ekleyin. Vortex. Kartuş filtre ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj için geçerlidir. </li><li> Tavsiye hacmi miRNA Yıkama Çözeltisi 1 (350 ul) yarısı ekleyin ve 10.000 x g az 15 saniye santrifüj. </li><li> Her bir numune için 10 ml DNase 1-70 ul tampon RDD (Qiagen) ekleyin. Sütun 80 ul ekle ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Çözüm 1 yıkayın (350 ul) ve 10,000 x g&#39;de 15 saniye santrifüj ekleyin. </li><li> Yıkama Çözeltisi ekleme 2/3 (500 ul) ve 10,000 x g&#39;de 15 saniye santrifüj. TEKRAR. </li><li> 40 ul 95 ile Zehir ° C nükleaz içermeyen H 2 O </li><li> RNA konsantrasyonu belirlemek ve 100 ng / ul RNA seyreltin. </li></ol> 3. Bloo gelen Exosomes bir miRNA Profild Taqman Düşük Yoğunluklu Array (TLDA) Kartlar (~ 6.5 saat) kullanarak İPUÇLARI <ul><li class="jove_content"> , KKD giyerek RNA izole RNaz Zap ile yüzeyleri ve pipetler silme ve steril filtre ipuçları ve borulu için zemin hazırlayın. </li><li class="jove_content"> Ön amplifikasyon (pre-amp) adım 1-350 ng RNA (350-1,000 ng örnekleri cDNA sentezi sonra pre-amp adım gerektirmeyen) için önerilir. Bu eşit koşullar altında tüm örnekler tedavi gerekir çünkü pre-amp da örnek için gerekli olup olmadığını belirlemek için önemlidir. Pre-amp adım maliyet ekler ve Ct değerleri daha düşük kabul edilebilir bir kesim kapalı (32 yerine 40) var. </li><li class="jove_content"> Bu, tek bir gün içinde çalıştırılabilir kart sayısı ile ilgili olarak bir levhası yerine şerit tüpler içinde cDNA reaksiyon hazırlamak için yararlıdır. Bu, aynı gün işleme olmayacak edilen cDNA örnekleri arasında donma-çözülme en aza indirecektir. </li><li class="jove_content"> Farklı kaynaklardan toplanan Exosomes yönün varRNA miktarda kira. Bu protokol, cDNA sentezi için reaksiyon için 3 ul RNA şablonu azami izin verir. Kaynağına bağlı olarak, izole edilebilir exosomal RNA miktarı belki de sınırlıdır. Tipik bir doku cDNA, 3 ul hacim içinde 100 ng RNA, insan kanı ya da hücre kültür ortamından exosomes yapılmış olacağı kadar RNA verim olur ise genellikle daha az RNA içeren ve cDNA daha az başlangıç ​​malzemesinden yapılmış olmalıdır. Fare kan exosomes RNA yüksek seviyelerde içeren ve 3 ul içinde, en az 100 ng elde edilebilir. </li></ul><ol><li> Megaplex Havuzları kullanarak RNA saflaştırılmış cDNA hazırlamak için transkriptaz primer (A Grubu ve B Grubu mikroakışkan kartlarında miRNA&#39;lar için astar içeren Dizi A ve B) tersine, buz üzerinde reaksiyon bileşenleri çözülme. </li><li> Etiket RT A Grubu astar veya B Grubu astar ile reaksiyona ve grafik için bileşenleri eklemek için iki RNaz ücretsiz 1.5 ml tüpler. 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme veya t tarafından önerilen bir ana karışımı yapmako satıcı. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT reaksiyon Bileşen </td><td> Bileşen Konsantrasyon </td><td> 1 adet numune için hacmi (toplam V / örnek = 4.5 ul) </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td></td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT tamponu (10x) </td><td> 1X </td><td> 0.80 ul </td></tr><tr><td> dNTP (100 mM) </td><td> 4.4 mM </td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mm) </td><td> 5 mM </td><td> 0.90 ul </td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0.10 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT Astarlar A veya B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0.80 ul </td></tr><tr><td> Ters Transkriptaz MultiScribe </td><td> 75 U </td><td> 1.50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Tüpler invert 6 kez ve yüzdekısaca rifuge. Daha sonra, pipet 4,5 MicroAmp içine ul RT reaksiyon karışımı 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plakası. </li><li> RNA 100 ng ekleyin ve DEPC arıtılmış su ile 3 ul ses seviyesini ayarlamak ya da 3 ul toplam RNA ekleyin, pipet ucu ile karıştırın ve tüpler veya plaka mühür. Kısaca Spin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> PCR makineye reaksiyon yükleyin ve (gibi Applied Biosystems Megaplex Havuzları protokolü tarafından önerilir) aşağıdaki koşullar altında çalıştırın: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne </td><td> Sıcaklık </td><td> Zaman </td></tr><tr><td> Çevrim (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 sn </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 85 ° C </td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> -20 ° C&#39;de (en az bir hafta için iyi) cDNA depolamak ya da bir hafta boyunca muhafaza edilebilir ön-ampi adıma devam eder. </li><li> Buz üzerinde A Grubu ve B Grubu için Preamp astar çözülme ve karıştırmak için ters. Girdap Taqman Pre-Amp ana karıştırın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> 2 veya daha fazla reaksiyon için bileşenlerin en az bir ekstra hacim ekleme şeması takip veya satıcı tarafından önerilen ana karışımı yapmak. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Pre-Amp Reaksiyon Bileşen </td><td> 1 örnek için ses </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 7.5 ul </td></tr><tr><td> Taqman Preamp Master Mix (2X) </td><td> 12.5 ul </td></tr><tr><td> Megaplex Preamp Astarlar A veya B (10X) </td><td> 2.5 ul </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipet 2.5 ul RT süredenct MicroAmp içine 8-tüp Şeritler veya 96-MicroAmp optik reaksiyon plaka ve her kuyuya 22.5 ul Preamp reaksiyon karışımı dağıtmak. </li><li> Buz 5 dk inkübe plaka, mühür ve daha sonra PCR makineye örnek yükleyin. Aşağıdaki koşullar altında çalıştırın. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne </td><td> Sıcaklık </td><td> Zaman </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 95 ° C </td><td> 10 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 55 ° C </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 72 ° C </td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td> Çevrim (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 sn </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 dk </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 99.9 ° C </td><td> 10 dakika </td></tr><tr><td> Tutmak </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Preamp reaksiyon tamamlandıktan sonra, kısa bir süre tüpler veya plaka santrifüj ve sonra her iyi ya da tüp 75 ul 0.1x TE pH 8.0 ekleyin. </li><li> Seal ve karıştırın ve kısaca döndürün. -20 ° C&#39;de bir hafta seyreltilmiş ürün saklayın veya plaka yüklemek için devam. </li><li> Buz üzerinde bir RNaz içermeyen 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde, aşağıdaki birleştirin. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 1 kart için ses </td></tr><tr><td> Taqman Evrensel PCR Master Mix, yok AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> Seyreltilmiş preamp ürün </td><td> 9 ul </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 441 ul </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Karıştırın ve kısaca santrifüj için tüp ters. Taqman MicroRNA Dizi kart her portuna 100 ul PCR karışımı koyun. </li><li> 1 dakika boyunca kartı 2 x 1.000 x g&#39;da santrifüj. Kart mühür ve Uygulamalı Biyosistem manuel ve 384 Taqman Düşük Yoğunluklu Array ayarlarında astar birlikte verilen şablonu kullanarak çalıştırın. Biz Uygulamalı Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR sistemi kullanın. </li></ol> 4. Taqman (~ 1.5 saat) ile analiz mRNA <ol><li> QPCR reaksiyon hazırlamak için, grafik sırayla reaksiyon bileşenleri karıştırın. Tüm numuneler normalleştirici gen olarak faiz hem de 18S rRNA geni için astar probları ile analiz edilecektir. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Taqman Reaksiyon Bileşen </td><td> 1 örnek için ses </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 7 ul (bireysel örnek göre ayarlayın) </td></tr><tr><td> Taqman Hızlı Master Mix (2X) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Taqman Primer sondalar (20x) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 100 ng RNA, cDNA </td><td> 2 ve mu, L (tek tek örnek göre ayarlayın) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Üreticisi (Biyosistem 7900HT Hızlı Real-Time PCR Sistemi Uygulamalı) tarafından tavsiye edilen hızlı 96-blok kullanarak 96 plaka çalıştırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+target+recognition+and+regulatory+functions.">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li><li>Mendell, J. T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+stress+signaling+and+human+disease.">MicroRNAs in stress signaling and human disease.</a> Cell. 148, 1172-1187 (2012).</li><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+human+disease.">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell research. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PloS one. 3, e3148 (2008).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature. 2, 282 (2011).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Ramachandran, S., Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+RNAs:+exosomes+as+mediators+of+intercellular+communication.">Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication.</a> Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).</li><li>Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+intercellular+signalosomes+and+pharmacological+effectors.">Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors.</a> Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).</li><li>Ludwig, A. K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+small+vesicles+participating+in+intercellular+communication.">Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 44, 11-15 (2012).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).</li><li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+exosomes+influence+cholangiocyte+regulatory+mechanisms+and+proliferation+through+interaction+with+primary+cilia.">Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).</li><li>Faur&#233;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+are+released+by+cultured+cortical+neurones.">Exosomes are released by cultured cortical neurones.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).</li><li>Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+microvesicles+contain+DNA/RNA+and+convey+biological+messages+to+target+cells.">Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells.</a> PloS one. 7, e34653 (2012).</li><li>Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+proteomic+insights+and+diagnostic+potential.">Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential.</a> Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>El-Andaloussi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+delivery+of+siRNA+in+vitro+and+in+vivo.">Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.</a> Nature. 7, 2112-2126 (2012).</li><li>Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+isolated+from+mycobacteria-infected+mice+or+cultured+macrophages+can+recruit+and+activate+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 189, 777-785 (2012).</li><li>Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+microRNA:+A+new+source+of+biomarkers.">Extracellular microRNA: A new source of biomarkers.</a> Mutat. Res. , (2011).</li><li>Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+LNA+in+microRNA-based+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics.</a> Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).</li><li>Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExoCarta+2012:+database+of+exosomal+proteins,+RNA+and+lipids.">ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids.</a> Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, kan ve kültür ortamından diferansiyel santrifüj saflaştırılmış exosomes gelen miRNA&#39;lar ve mRNA miktarının gösterir. Exosomes kökenlerine bağlı çeşitli bileşenleri ve immün yanıt, antijen sunumu, hücre içi iletişim ve RNA ve protein 9,11,12,19,20 devri de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, bir dizi olarak katılıyor. Büyüklüğü ve şekli exosome saflık belirleyici iken EM exosomes veri gösteren bir dizi çalışma, bu veziküller da tespit için kullan?...

Kısa noncoding miRNA&#39;lar hedef mRNA bağlanarak gen modüle. ~ 7 baz çifti tamamlayıcılığı tohum sırası çevirinin engellenmesi ya da hedef proteinin 1 azalmış ekspresyonu neden olabilir, her ikisi de mRNA, kararlılığını azalma ile sonuçlanan hedef mRNA bağlamak için MiRNA sağlar. Son on yılda Araştırma tümden hücresel fonksiyonları aracılık miRNA&#39;lar için temel bir rol kanıtlamıştır. Ayrıca çeşitli hastalıklar 2,3 altında yatan miRNA aracılı moleküler değişiklikler diseksiyon yönelik önemli çaba olmuştur. Ayrıca, vücut sıvıları 4-6 istikrarlı miRNA&#39;lar son belirlenmesi klinik tanı için uygun yeni biyolojik olarak kendi kullanımı için yolu açtı. Vücut sıvıları içinde miRNA ulaşım bir mod sistemik kan dolaşımdaki ile alıcı hücrelere exosomes, mRNA taşıyan küçük kesecikler, protein, lipid arabulucular ve miRNA&#39;lar üzerinden gerçekleştiriliriyon 7-14. Alıcı hücrelerde gen ifadesinin modülasyonunda ve bu sonuçlar hücresel iletişim için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Örneğin, hücre büyüme faktörü-β5 (TGFβ5) dönüşüm, salgılayan ve / veya interlökin-1β (IL1β), tümör nekroz faktörü-α (TNF) gibi inflamasyon dahil biyomoleküllerin içeren emici exosomes tarafından immün-düzenleyici işlemleri modüle ve olabilir Bu genlerin 13 düzenleyen miRNA&#39;lar. Anormal miRNA ifade insan hastalıklarının çeşitli ortak bir özelliktir gibi, bu moleküller yeni tedavi hedefleri 2 keşif ve doğrulama için heyecan verici yeni fırsatlar sunmaktadır. Dolaşım miRNA&#39;ların tüm vücut sıvılarında mevcut olan ve exosomes kompozisyonu, serbest bırakıldıktan hangi kaynak hücrelere göre farklı olduğu bilinmektedir. Böylece, hücrelerin fizyolojik durumunu incelemek için bir yol sunar ve nasıl hücrelerde bile sinyal değişiklik gösterecektirhastalıklar da dahil olmak üzere strese yanıt olarak ts. Exosome kompozisyon değişiklikler okuyan sinyal iletimi ilişkin bilgi sağlar ve biyolojik ya da terapötik müdahale yolları olarak potansiyellerini programını araştırabilirsiniz. Burada yayınlanan protokollere dayalı birden fazla kaynaktan exosomes en arıtma gösterecektir. Bu exosomes exosomes mevcut miRNAs seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için QPCR ardından RNA izolasyonu için kullanılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (10 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366643</td>
 <td>For exosome purification from human blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA coated vacutainer (2 ml tubes)</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367841</td>
 <td>For exosome purification from mouse blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAXgene Blood RNA Tube</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>762165</td>
 <td>For miRNA isolation from total blood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>miRVana microRNA isolation kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1561</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acid-Phenol: CHCl3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>9721G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase 1</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>79254</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4326614</td>
 <td>For TLDA cards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT rodent Pool Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444746</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex preamp rodent Pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444747</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444909</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444745</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Megaplex Preamp human pool set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444748</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4444913</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman MicroRNA RT kit</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366596</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taqman fast universal PCR master mix </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4366072</td>
 <td>For mRNA qRT-PCR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tumor necrosis factor (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs01113624_g1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vascular endothelial growth factor A (primer probe)</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Hs00900055_m1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>K1642</td>
 <td>For mRNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HSP70 antibody</td>
 <td>Abcam</td>
 <td>ab94368 </td>
 <td>For western blot</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rabbit IgG-Gold</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G7402</td>
 <td>For electron microscopy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit-anti CD81</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>SAB3500454</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nickel 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Ni</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 300 mesh carbon formvar grids</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>FCF300-Cu</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1. Table of specific reagents.</td>
</tr>
 </tbody>
 </table>

purification and microrna profiling of exosomes derived from blood and culture media

Kararlı miRNA&#39;lar tüm vücut sıvılarında bulunan ve bazı dolaşan miRNA&#39;lar exosomes adı verilen küçük kesecikler içinde haciz tarafından bozulması korunur. Exosomes hedef hücre RNA ve protein aktarımı ile sonuçlanan plazma zarı ile birleştirebilirler. Onların biyolojik fonksiyonları immün yanıt, antijen sunumu, ve hücre içi iletişim içerir. Kan yoluyla alıcı hücrelerde gen ifadesini düzenler miRNA&#39;lar teslimi hedef müdahale için yeni yollar açtı. Ilaç veya RNA terapötik ajanların teslimat için bir strateji sunan ek olarak, exosomal içeriği tedavi seçenekleri ve prognoz belirlenmesinde, tanıda yardımcı olabilir biyolojik olarak hizmet verebilir. Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA&#39;lar ve haberci RNA&#39;lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes exos için western blot analizi ile karakterize olacakilgi mRNA için OMAL işaretleri ve PCR. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir. Bu protokoller, farmakolojik müdahale öncesi ve sonrasında, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı içinde exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri v gösteriyormiRNA&#39;lar içinde ariations fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut. Burada kantitatif kan ve hücre kültür ortamı içinde salgılanan exosomes gelen miRNA&#39;lar ve haberci RNA&#39;lar (mRNA) analiz için prosedür anlatacağız. Saf exosomes ilgi mRNA için exosomal işaretleri ve PCR için western blot analizi ile karakterize edilecektir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve immunogold etiketleme exosomal morfolojisi ve bütünlüğünü doğrulamak için kullanılacaktır. Toplam RNA biz aynı örnekten mRNA ve miRNA hem eğitim sağlamak için bu exosomes arınmış olacaktır. Bioanalyzer RNA bütünlüğünü doğrulayarak sonra, Taqman Alçak Yoğunluk Array (TLDA) kartları ve ilgi transkript için gen ekspresyon çalışmaları kullanarak exosomal miRNA tanımlamak için orta düzeyde kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) gerçekleştirir. Bu protokoller exosomal miRNAs değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir ifarmakolojik müdahale öncesi ve sonrası n hasta, kemirgen modelleri ve hücre kültür ortamı. Exosomal içeriği nedeniyle kökenli kaynağı ve salgılayan exosomes bu hücrelerin fizyolojik koşullara değişir. Bu varyasyonlar hücreler ve sistemler stres veya fizyolojik değişimleri ile baş nasıl fikir sağlayabilir. Bizim temsilcisi veri miRNA&#39;lar farklılıklar fare kan, insan kanı ve insan hücre kültürü ortamı arındırılmış exosomes mevcut göstermek

Kan ya da hücre kültür ortamından izole exosomes sonra exosomes saflığı elektron mikroskopisi (EM) ve Western Blot (Şekil 1A ve 1B) ile test edilebilir. Biz EM ve birden fazla antikor kullanarak western blot ile çeşitli kaynaklardan bizim exosome hazırlıkları doğruladı. Şekil 1A exosomes ~ çapında 30 -100 nm ile sağlam ve immunogold etiketleme ile CD81 içeren teyit EM görüntüleri gösterir. Yaygın olarak kullanılan exosomal işaretleri Hsp70 ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media at JoVE.com

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA&#39;lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

purification-microrna-profiling-exosomes-derived-from-blood-culture

Research

JoVE Journal

Biology

31.7K Görüntüleme.  Drexel University College of Medicine. Exosomes istikrarlı microRNA (miRNA'lar) varlığı biyolojik olarak ve terapötik müdahale için bir yol olarak potansiyel programı için, hücreler arası iletişim yeni bir mod olarak büyük ilgi üretti. Burada taşınmaları miRNAs tespit etmek kantitatif PCR tarafından takip edilir ve kan kültür ortamından saflaştırılması exosome göstermektedir.

Video: Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Purification of Platelets from Mouse Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), and plasma proteins. We describe here purification of platelets from mouse blood using three-fold more iohexol gradient medium relative to blood sample volume and centrifugation in a swinging bucket rotor at 400 x g for 20 min at 20 &#176;C. The recovery/yield of the purified platelets were 18.2-38.5%, and the purified platelets were in a resting state, which did not contain any significant number of RBC and WBC. The purified platelets treated with thrombin showed up to 93% activation, indicating their viability. We confirmed that the purified platelets are sufficiently pure using flow cytometric and microscopic evaluation. These platelets can be used for gene expression, activation, granule release, aggregation, and adhesion assays. This method can be used for purification of platelets from the blood of other species as well.

Here, mouse blood was collected in the presence of an anti-coagulant. The platelets were purified by iohexol gradient medium using low speed centrifugation. The platelets were activated with thrombin to investigate if they were viable. The quality of the purified platelets was analyzed by flow cytometry and microscopy.

Fare kan trombosit arıtma

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...