The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Etik bildirimi: Bu protokol açıklanan deneysel işlemler münhasıran Drosophila melanogaster ile çalışmak ve Almanya&#39;da hayvan refahı yasalara tabi değildir barındırır. Medya, Araçlar, ve Sinek 1. Hazırlık <ol><li> Potasyum bikarbonat 17 olmadan değiştirilmiş piyasada mevcut toz M3 büyüme ortamı hazırlayın. DİKKAT: Göz ve cildi tahriş eder. % 10 cenin sığır serumu ile orta Ek, 100 E / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. En iyi sonuçlar için ısı ile inaktive edilmiş ve böcek kültür test edilmiş cenin sığır serumu kullanın. -20 ° C&#39;de parçalar halinde, 0.2 um&#39;lik bir şişe iyi filtre birimi ve mağaza (ortam diye değinilmektedir) tam orta filtre. Kullanmadan önce, filtre (0.2 mikron şırınga filtre ucu) orta tekrar çökeltilerin kaldırmak. </li><li> Farmakolojik deneyler için önleyici stok çözelti hazırlayın. Dissolalikotları uygun bir solvent ve mağaza kimyasal ettik. (: Göz ve cildi tahriş edicidir DİKKAT) dimetilsülfoksitte Örneğin, 28.69 mM anakardik asit stok çözeltisi hazırlamak. </li><li> Disseke pupa testis ve tek kist diseksiyon bozulması için araçlar hazırlayın. Iki keskin ve sert iğneler yerine bir çift forseps kullanın. Forseps bir çiftinin iki kolu arasında gelişen kılcal kuvvet çok zor ortamı az miktarda tek kist diseksiyon hale getirir. Örneğin, bir aşı halka tutucu içine yerleştirilmiş paslanmaz çelikten bir böcek iğnesinin ucunu kullanın. </li><li> Beyaz sinek, yeterli sayıda (yaklaşık 40-60 sinekleri) ile uygun olarak yaşlı pupa, tohum ca. 10, büyük kültür şişeleri (4 cm çaplı borular) elde etmek için. HP anahtarı analiz etmek için, onların endojen desen 12,16,22 içinde H2AvD-RFP ve ProtamineB-eGFP ifade sinekler kullanın. 25 ° C&#39;de standart koşullar altında inkübe şişeleri, En fazla 4-5 gün üçüncü instar larvaları tarama kadar takriben ° C ile şişelerin 25 duvarlarında pupa başlar. </li></ol> Diseksiyon için 24 saatlik eski Pupalar elde edilir 2. İşaretleme veya Beyaz Toplama Pre-pupa <ol><li> , HP anahtarı bazı kimyasalların etkisini test yaklaşık 24 saat APF 12 de pupa testisi incelemek. Aşamalı pupa elde edilmesi için, larva pupa ile hazırlanan sinek kültür şişeleri alır (Bölüm 1.4) ve mümkün olduğu kadar çok beyaz önceden tespit pupa. Pupa yılında ilk adımı sırasında ön-pupa hareketsiz olmayan beslenme, dışa çekik spiracles ve beyaz renkli puparium ile oldukça kısaltılmış larva olarak görünür. Puparium pupa gelişme 26 sonraki aşamada gösterir 30 ila 60 dakika, içindeki kahverengi-kahverengi olur. </li><li> Viyallerin dış kalıcı bir kalem ile ön pupaların bir şekilde işaretleyin. Yaklaşık 24 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe şişeleri. <ol><li> Seçenek olarak,PBS tamponu ile nemlendirilmiş küçük bir fırça ile şişelerin yan ön pupa seçin. Daha sonra yeni bir 50 ml&#39;lik reaksiyon tüpünün yan ön pupa aktarın ve yaklaşık 24 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li></ol> Puparium Formasyonu sonra yaklaşık 24 saat sonra Pupa Testislerindeki 3. Diseksiyon <ol><li> , 10 cm Plastik hücre kültürü ya da bir Petri tabağına orta birkaç damla (yaklaşık 80 ul her biri) dağıtın. Forseps geniş bir çift veya ortam ile nemlendirilmiş bir fırça kullanarak, (bakınız bölüm 2) kuluçkaya flakonlarından 24 saat APF aşamada pupa almak. Yemeğin orta her damlasını bir pupa aktarın. </li><li> Diseksiyon için, bir fiber-optik aydınlatıcı ile teçhiz edilmiş bir stereo mikroskop kullanılır. Bu kültürde doğru gelişmesini engelleyebilecek gibi diseksiyonu sırasında RT yukarıda testisler ısıtmayın. <ol><li> No 5 forseps iki çift ile pupa ayır. Bir çift, onun en posterior pupa kapmakbölüm (posterior spiracles) ve konumda tutun. </li><li> Forseps diğer çifti ile ön spiracles tut ve ön sonunda pupa kapakçık açın. Toraks en azından bir kısmı açığa çıkana kadar pupa davayı soyulabilir. </li><li> Onun en arka sonuna pozisyonda pupa tutmaya devam edin. Pupa iç basıncını serbest bırakmak için, pupa kafa bölgesine forseps çiftinin her iki kolu yerleştirin. </li><li> Forseps açılması ve anterior yönde forseps hareket ettirerek açık pupa rip. Bu hareket ile oluşturulan açıklık ilk denemede mümkün olduğu kadar büyük olduğundan emin olun. Basınç bu testisler küçük açıklıktan doğrudan itiliyor ve en sık engelleniyor neden olabilir olarak piyasaya sürülmüştür önce, arka sonunda pupa zarar kaçının. </li><li> Pupa açıldıktan sonra, pupa salınan iç basınç la ile yağ ve vücut hücreleri ve doku topakların presler gözlemleyinkafa bölgesinde rge açılması. Pupa testisler zaten bu malzeme ile pupa itilmiş olup olmadığını kontrol edin; Bu, bazı durumlarda ortaya çıkar. Testis 24 saat APF herhangi bir başka doku ile bağlantılı değildir ve bu nedenle pupa 23 kolaylıkla çıkabilmektedir. </li><li> Onlar pupa kalırsa bu testislerin zarar verebilir forseps ile pupa sıkmaktan kaçının. Forseps kullanılarak bir çift açıklığın büyütün. </li><li> Daha sonra, en arka ucunda pupa tutun. Pupa testisler serbest bırakmak için anterior posterior gelen pupa içeriklerini diğer forseps çifti ve yavaşça çizgi kapatın. </li></ol></li><li> Önceden kesilmiş 200 ul pipet içine çekerek testisler toplayın. Testisler ile transfer vücut yağ hücrelerinin sayısını azaltmak için orta sadece çok küçük bir miktar transfer çalışın. Bir taze kültür çanak ortamı içine testisler yerleştirin. Sadece birkaç şişman vücut hücresinde kadar testislerde orta birkaç kez yıkayıns kalır. </li><li> Canlı görüntüleme için, orta ile bir cam alt kültür çanak testisler aktarmak ve ters bir görüntüleme mikroskop kullanıyoruz. Farmakolojik deneyler, adım 5 ile devam edin. </li></ol> Erkek germ-line Kistler ve Canlı Görüntüleme 4. Diseksiyon <ol><li> Cam-alt kültür çanak için bir veya daha fazla pupa testis aktarın. </li><li> Fiber optik aydınlatma ve iki paslanmaz çelik iğne ile stereo-mikroskop kullanmak erkek germ-line kistlerin diseksiyonu için (bölüm 1.3). <ol><li> Bir iğne ile, dikkatlice ön veya arka ucunda bir testis aşağı pin deneyin. Konumda tutun. Testis içine diğer iğneyi ve yanlara iğne hareket ettirerek testis kılıfı bozabilir. Kistlerin çoğu bu hareketi ile testisten çıkacak. </li><li> Bir iğne ile pozisyonda testis tutmaya devam edin. Diğer iğne ile testisten kalan kistlerin nazikçe çizgi. </li><li> Gent tarafından Ayrı toplanmış kistleri yaly kistlerin küme aracılığıyla veya 200 ul pipet kullanarak ortam ile taze kültür çanak kistleri aktararak yana bir iğne hareket. </li></ol></li><li> Tek kist canlı görüntüleme için ters bir görüntüleme mikroskop kültür çanağı hareket. Bir iğne gerekirse yeniden kist dağıtılır. <ol><li> Faz-kontrast ve floresan mikroskobu kullanarak kistlerin sahne tanımlayın. </li><li> Istenen aşamada bir kist odaklanın. Kistler kültür çanak alt uymak ve bu nedenle odak akıp eğilimi yok gibi, sık sık uzun görüntüleme deneyleri sırasında odak ve kist konumunu onaylayın. Not: Hareketsizleştirme için poli-L-lisin ile çanak kaplanması erken germ-çizgisi kist gelişimi için zararlıdır. Bunun yerine, bireysel kistler izole edilebilir. Bazı uygulama ile, çok hafifçe iğne ile iterek belirli bir kist tek tek mümkündür. Bu ayrı kült tek kistlerin transferi sağlayacakmikroskop görüş alanına sığar çizilmiş bir ucu bir cam Pasteur pipeti ile ure yemekler. İzole kistler daha sonra kolayca hatta uzun süreli inkübasyon sonrasında kültür tabaklarında taşındı olabilir. </li></ol></li></ol> Bozulmamış Pupa Testislerindeki 5. Farmakolojik Deneyi <ol><li> 12 replika deney için ortamdan 500 ul, 24 gözlü hücre kültür plakasının her bir gözeneğine doldurun. Önceden kesilmiş 200 ul pipet kullanarak her bir kuyunun Transfer tek pupa testis,. <ol><li> Ters bir floresan mikroskobu kullanılarak izole testislerde protaminler varlığı kontrol edin. Testisler, HP anahtarı kistlerin herhangi bir yer almadığını gösterir ProtamineB-eGFP sinyal, ücretsiz olmalıdır. Zaten ProtamineB-eGFP-pozitif kistler göstermek testisler değiştirin. </li><li> İlk 12 kuyuya, arzu edilen nihai konsantrasyonu elde etmek üzere seyreltildi inhibitör bileşiği (anakardik asit) içeren bir maddenin 500 ulOyuk başına 1 ml ortam maddesi içinde (150 uM). Tedavi edilmeyen kontroller olarak kalan kuyuları kullanın; inhibitör bileşikleri gibi kullanılan çözücü ile aynı miktarda ortamının 500 ul ilave edin. Not: Birçok farklı bileşik, ve çözücü maddeler kullanıldığında, bu kontrol olarak sadece ortamını kullanmak için daha verimli olabilir ve ayrı deneyde çözücü artan konsantrasyonlarının etkisini test etmek. </li></ol></li><li> Karanlıkta, 24 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi inkübe testislerde protaminler varlığında tekrar edin. Kontrol testis, HP anahtarı aracılığıyla geçişi gösterir bir veya daha fazla ProtamineB-eGFP-pozitif kistler, göstermelidir. </li><li> 200 ul, bir pipet ucu kullanarak, poli-L-lizin kaplı slaytlar testisler aktarmak başka 12,27,28 tarif edildiği gibi uygun bir floresan antikorlar ile kabak hazırlıklar ve leke olun. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.

Sunulan protokol belirli bir gelişim aşamasında ve bir kültür çanak bu hücrelerin ve dokuların ex vivo geliştirme Drosophila testisler ve tek germ-line kistler incelemek için yeteneği hem dayalı iki farklı uygulamaları açıklar. Diğer bir uygulama geliştirme sırasında sperm yaşam süreçlerini önemli farmakolojik değiştirmedir. Önemlisi, bu kolayca sinek genetik dayalı işlevsel analizler kullanılarak elde değil post-mayoz spermatogenez için erişim sağlar. Diğer uygulama yaşayan ve germ hücreleri ve testislerin geliştirilmesi mikroskobik gözlem. Özellikle kültür Drosophila hücreleri ve organların yeteneği, bu uygulama avantajları hayatta kalma ve oda sıcaklığında ve normal bir atmosfer altında geliştirmektir. Böylece, bir (25 ° C standart yetiştirme sıcaklıkta ısıtılarak) ısıtılmış aşaması ile donatılan bir ters mikroskop görüntüleme canlı görüntüleme deneylerinde anlamlı sonuçlar elde etmek için yeterlidir. Ayrıcacanlı görüntüleme için floresan protein-etiketli proteinleri eksprese Dahası, pek çok transjenik sinek suşları mevcut veya kolayca kurulabilir. Belirli bir gelişim aşamasında pupa testisler ya da germ-line kistler elde etmek için, bu bir Drosophila gelişme zamanlama aşina olduğu önemlidir. Her aşama için kesin zamanlama laboratuvarlar, kültür koşulları arasında değişir ve suşları sinek ve ampirik kurulmalıdır olabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, bu örnek için, HP anahtarı hedef, farmakolojik tahliller için özellikle önemlidir. Bu deneyler için, zamanlama bile bir popülasyon içinde değişiklik gösterebilir, çünkü her gerçek önleyicisi test öncesi bir ProtamineB-EGFP sinyal spermatidler kontrol edilmesi tavsiye edilir. Ekli vücut yağ dokusu serbest dokunulmamış organlar gibi erken pupa aşamalarında testisler incelemek için deneyci sağlamalıdır yukarıda protokolünü takiben. Bu testis ve hatta daha çok, ge izolerm-hat kistler çok kırılgan. Bu nedenle, taşıma ve forseps, iğneler, ve pipetler kullanarak testisler ve kistler aktarılması için gerekli el becerisi ve deneyimlerini geliştirmek için çok önemlidir. Özellikle mayoz ve erken post-mayoz germ hücresi gelişimini hedefleyen çalışmalar bu yararlanacak. Erişkin testis uzun Kamçılı geç spermatid kistleri incelemek için nispeten kolay olsa da, daha önce aşamalarını elde etmek zordur. Bu protokol sonrası erken pupa testis bu kistler Diseksiyon çok daha verimli. Olağan sinek türünde, pupa sadece yaklaşık% 50 erkek olacak aklınızda tutun. Bu nedenle, gerekli testislerin sayısı kadar pupa olarak en az iki kez incelemek için hazırlar. Alternatif olarak, testisler dokunulmamış larva 23,34 yanal yağ vücut dokuları içine gömülü olarak saydam tur organları tespit edilebilir, stereo-mikroskop kullanılarak erkek L3 larvalarına tespit etmek ve taze kültür şişeleri içerisinde toplamak mümkün olduğunu canevreleme ve diseksiyonlardan ön-pupa seçmek için kullanılabilir. Bu erkek ön pupa 35 tespit etmek de mümkündür. Ayrıca önceden 18 bildirilmiştir Biz, izole germ-line kistler ve kültür bozulmamış pupa testisler hem ışık duyarlı olduğunu fark ettim. Bu ışık duyarlılığı da farmakolojik deneylerde kullanılan bazı kimyasal bileşiklerin tutabilir. Bu nedenle, inkübasyon sırasında karanlıkta bir tahlilin kültür kaplarına tutmak için en iyisidir. Gelişmekte testis ve time-lapse görüntüleme deneyleri planlarken Aynı şekilde, özellikle, izole kistler, çok uzun pozlama süreleri ve / veya çok yüksek örnekleme oranları, ex vivo gelişimini engelleyebilmektedir akılda tutmak. Uygun olan numune alma oranı deneysel olarak tespit edilmelidir. Kültür tabaklarında bakteriyel ve / veya mantar enfeksiyonları ve aşırı büyüme ciddi bir sorun teşkil etmektedir. Çok bakteri ile enfekte kültür yemekleri ex vivo deve desteği yoktestis ve kistlerin lopment. Bu nedenle, tarif edilen kültür ortamı, penisilin ve streptomisin (adım 1.1), ancak uzun süreli inkübasyon sırasında içerir Bu antibiyotikler, düşebilir ve etkinlik azalır olabilir. Bu sağkalım sınırlı bir süre için nedenlerinden biri (max. 72 saat) Yukarıdaki protokolü kullanarak gözlemlenen kültür kist olabilir. Ancak bu zaman çerçevesi yemekler kültür ortamının değiştirilmesi ile normal genişletilebilir olabilir. Biz diğer faktörler gibi genital sistem diğer dokulardan büyüme sinyalleri bir eksikliği olarak, kültürde hayatta etkileyebilir sonucuna varıldı. Öte yandan, öz değişmesine ait sonrası daha hızlı gelişimi Drosophila memelilerde daha uzundur. Drosophila, spermiogenesis yaklaşık 90 saat sürer ve HP anahtarı mayoz 9,12 sonra 50 ve 60 saat arasında gerçekleşir. Dolayısıyla, bu protokol ile elde etrafında 48 saatte normal sağkalım süresi müstakbel önemli gelişim süreçlerini takip etmek uygundurBöyle Mayotik bölümler veya HP anahtar olarak rmatogenesis. Bakteri veya mantar kontaminasyonu temiz araçları ve medyayı kullanarak önlenebilir olmasına rağmen, sunulan protokol sinekler nedeniyle kesinlikle steril çalışma koşulları faydalanmak ve standart koşullar altında geçirilen zaman testisler zaten bakteri barındırmaz uçmaz. Yine de, bu kültür tekniğinin bazı uygulamaları disseke sinekler yarar olabilir hatta (protokoller için, 17,36,37 bakınız) aseptik koşullarda kaldırdı. Farmakolojik deneyler inhibitörleri veya aktivatörlerinin çeşitli enzimlerin işlevi gören kimyasal bileşiklerin kullanımına bağlıdır. Yaygın haliyle, deneylerde kullanılan bileşikler genellikle, hedef spesifikliği bakımından büyük farklılıklar vardır. Bir avantaj olarak, bu anakardik asit inhibe p300 / CBP, PCAF, ve şapkalar 38 MYST aile üyeleri ile, örneğin, bütün enzim sınıfları hedef potansiyel sunmaktadır. Bu olumsuz hedef dışı veya sitotoksik etkileri induc bir potansiyel olabilirBu tür bileşiklerin ederek hazırlanabilir. Bu nedenle, testis veya pupa kistli bir deneyde kullanılan her bileşiğin, sitotoksisite ve farklı konsantrasyonlarda özel etkiler için test edilmelidir. Buna ek olarak, kültür koşulları, bileşik konsantrasyonu veya aktivitesi, hücre geçirgenliği değişiklikler küçük farklılıklar bağlı etkilerin değişkenliğe neden olabilir. Bu nedenle, her bir deney için tedavinin başarısını izlenmesi gereklidir. Biz 150 uM&#39;de anakardik asit kullanıldığında histon H4 asetilasyonu sürekli azaldığı Örneğin, biz ile bazen testis olan kromatin kondensasyonu fenotipin kuvvetinde hafif bir değişkenlik gözlenmektedir. Kültüründe Drosophila testisler ile farmakolojik deneyler spermatogenez 4,12,14,21 öncesi ve sonrası-mayoz mekanizmalarını analiz etmek için kullanılmıştır. Genetik araçları ile post-mayoz spermatogenez erişmek zor olduğundan Essentia ile oyuncu hedefl ön-mayoz ve mayoz fonksiyonları, bu ex vivo yaklaşım bir alternatif oluşturmaktadır. Ayrıca, ilke olarak, yöntem, zaman içinde tedavi edilen üreme hücrelerinin gelişimini izlemek kovalayıcı deneyler pulse uyarlanabilir. Ancak, henüz bu olasılığı test etmedim. Erken pupa testislerde Yapımı kullanımı farmakolojik testlerin bir avantajdır. İlk olarak, (24 saat APF civarında) genç pupa testislerin ince dış kılıf kimyasal bileşiklerin geliştirilmiş geçirgenlik izin verebilir. Post-mayoz HP anahtarını okuyan İkincisi, pupa testisler, HP anahtarı etkilenen veya yapılmadığının doğrudan okuma etkinleştirmek Protamine-GFP ifade sinek hattı 24 saat APF disseke. Bugüne kadar, Drosophila organ ve testis ve germ-çizgisi kistler dahil olmak üzere dokuların ex vivo olarak kültivasyonu için çeşitli protokoller (örneğin, bkz 4,14,17,20,39,40) geliştirilmiştir. Yetiştirme ortamı ve kullanılan genel şartları1979 yılında kuruldu burada sunulan protokolünde 17. kültür sistemi, daha sonra yetişkin testis 4 izole sonrası geç-mayoz kistlerde bireyleşme mekanizmasının in vivo görüntüleme adapte edildi. Daha önce, bu koşulları da etrafında 48 saat 12 onların kist hayatta kalmayı ve mayoz ve erken post-mayoz germ hücrelerinin farklılaşmasını destekleyen bildirdi. Diğer kültür sistemlerine 19 aksine, bu kültürlerde gözlenen gelişim zamanlaması (ayrıntılar için, bakınız 12) sabit örneklerden belirlenir zamanlama ile hemen hemen sabit olmuştur. H2AvD-RFP ve protamin-GFP flöresan sinyalleri kültürde üreme hücrelerinin nükleer kromatin morfolojisi ve bileşim görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Biz kültürde gelişim aşamaları net bir şekilde belirlenmesi için, bu tür kistlerin kıvrılma gibi diğer kriterler üzerinde avantajlı olduğunu bulundu. Önemli olarak, uçucu Sunulan protokol ext ilavesini içermezfetal sığır serumu dışında ract ya da diğer büyüme faktörleri. Ayrıca, koşullar ex vivo kültür içinde öz değişmesine ait bölünme floresan mikroskobu görüntüleme ile uyumlu olduğunu gösteriyoruz. Çıkan uzun süreli gelişimini destekleyen bir kolay kullanımlı ortamda makul çözünürlük ile elde edilebilir. Bu Voltalef petrol 41,42 kısa vadeli (yaklaşık 3 saat) gözlemlerini sağlayan protokolleri tersidir. Yetiştirme ve pupa testis ve tek erkek germ-line kistlerin farmakolojik tedavisi için, yukarıda anlatılan prosedürler Drosophila spermatogenezde araştırılabilir birçok genetik, epigenetik, biyolojik hücre veya gelişimsel sorulara kolayca uyarlanabilir. Bu germ-line kök hücreler üzerinde duruluyor özellikle araştırmalar içerir. Gösterilmiştir ki, kültürlenen yetişkin canlı görüntüleme ile takip edilebilir kök hücre gelişimi 20,43 testis gösterilmiştir. Bununla birlikte, testis olgun peristaltik hareketi kılıfh görüntü alımı ile müdahale. Bu yüzden, iki görüntüleme parçalanmış testisler 43 veya görüntüleme gerçekleştirilen deneylerin sayısı kayıp veri kümeleri 20 hesaba arttırılmalıdır kullanılarak yapılır. Erken pupa testisler (24 saat APF) henüz kas hücreleri ile kapalı değildir. Hatta biraz eski testisler (36-45 saat APF) birkaç peristaltik hareketleri göstermek (Şekil 3 ve Ek videoyu 1 karşılaştırmak) görünür. Bu nedenle, dokunulmamış organlar gibi genç pupa testislerin ekimi bir alternatif olarak hizmet verebilir. Ayrıca, bir kez pupa testisler incelemek için yeteneği hakim ve sonunda izole germ-çizgisi kistler, küçük hücre popülasyonu olsa homojen bir kaynağı olarak tek bir kist kullanılarak daha fazla uygulamalar sağlar. Bugüne kadar görüldüğü gibi, örneğin, bir, spermatojenez, tanımlanmış aşamalarda spesifik genlerin transkripsiyonu düzenlediği analiz etmek için RT-qPCR gerçekleştirmek mümkün olmaktadır <sup&gt; 15.

Birçok türün erkek germ hücrelerinin gelişimi sıralı süreçtir. Bu morfolojik ve epigenetik oldukça uzmanlaşmış sperm oluşumu ile sonuçlanacak çok önemli bir dizi olay ile karakterize edilir. Drosophila melanogaster, testis böl ucunda germ-line kök hücreler asimetrik 1,2 (genel bir bakış için bkz Şekil 1), yeni bir kök hücre ve spermatogonyum, yani farklılaşma kararlıdır yavru hücre meydana getirmek için . Spermatogonyum mayoz başlangıcı ile, şaşırtıcı gelişmeler ve transkripsiyon aktivite fazı spermatosit aşaması olarak adlandırılan, mitotik bölünmeleri dört tur geçirilir ve. Bir spermatogonyum kaynaklanan hücreler birbirine bağlı iki somatik hücre-bir yapı, kist olarak adlandırılır tarafından sarılı bir paket olarak eşzamanlı geliştirmek kalır. Mayoz tamamlanmasından sonra, erkek üreme hücrelerinin morfolojisi tamamenyeniden (şematik olarak, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir). Başlangıçta, yuvarlak spermatidler hidrodinamik kafası yapısının oluşturulması için uzunlamasına ve kamçı geliştirir. 5 - Sonunda, sperm hücrelerinin bireyselleştirilmesi 3 olarak adlandırılan karmaşık bir apoptoz ile ilgili bir mekanizma ile birbirinden ayrılır. 9 - Drosophila melanogaster ve memeli türler de dahil olmak üzere birçok türde, haploid germ-line kromatin olağanüstü bir epigenetik yeniden düzenlenmesi eşliğinde germ hücrelerinin morfolojik değişiklikler, (HP anahtarı) 6 histon-to-protamin anahtarı da denir. Muhtemelen hemen hemen tüm standart histon ve histon birçok varyant molekülü DNA&#39;dan ayrılır ve olgun sperm kromatin özgü, yüksek ölçüde kompakt bir yapıyla sonuçlanan nucleoprotamine küçük temel protein, protamin, ile yer değiştirir. HP anahtarının genel özellikleri t vardırsonra ilk geçiş proteinleri tarafından ve nihayet protaminler tarafından histon varyantları tarafından kanonik histonların diye değiştirilmesi. 12 - Tüm bu histon kaldırılması 7,10 hemen önce böyle histon H4 asetilasyonu seviyelerinde bir dalgalanma olarak epigenetik işaretleri çeşitli değişiklikler eşlik eder. Tümü değilse de çoğu, yukarıda sözü edilen işlemlerin, olgun, tam olarak fertil sperm gelişimi için gereklidir. Bu memeli spermatogenez pay olarak, omurgasız sistem 1,8,9 benzerliği önemli bir bölümü, Drosophila aynı zamanda insanlarda sadece geçerlidir. Germ-hücre gelişimini büyük ölçüde incelenmesi Drosophila model sistemde kolaylaştırılır. Sinekler genetik derece erişilebilir. Mutantlarının üretilmesi hem de kimerik gen ya da RNA interferans yapıları ifade eden uçucu soylarının kurulması çok az çaba gerektirir. Bununla birlikte, sonra-mayoz spermatojenez, mutantların kullanımının bir çalışmadad basit bir genetik araçlar sınıra ulaşabilir. Drosophila spermatogenezde, transkripsiyon mayoz bölünmeler içine girişi ile neredeyse tamamen sona erer. 16 - Böylece, öz değişmesine ait spermatogenez sonrası esas olarak uzun bir öz değişmesine ait profaz 13&#39;te sentezlenen translasyon bastırılmış depolanmıştır mRNA&#39;lar dayanmaktadır. Bu nedenle, RNA interferansı veya şartsız mutantlarının kullanımı gibi araçlar, özellikle de ön öz değişmesine ait ya da öz değişmesine ait germ hücre gelişiminde temel fonksiyonları yerine gen ürünlerinin post-öz değişmesine ait rolleri incelemek için uygun değildir. 20 - gibi durumlarda yararlanılabilir Drosophila bir avantajı, kültür ortamında 4,12,17 ex vivo olarak geliştirmek için teşrih sağlam testis ve germ hücre da kistlerin yeteneğidir. Testis veya germ-line kistlerin diseksiyonu ve yetiştirme canlı hücreler germ hücre gelişiminde değil, sadece mikroskopik gözlem sağlar, ama birLSO farmakolojik deneyler, kullanımı gibi, örneğin, histon asetiltransferazlar (şapka), histon deasetilazların (HDAC&#39;ler), topoizomerazlar, ya da proteazom gibi enzim komplekslerinin önleyicileri. Bu nedenle, post-mayoz spermatogenez sırasında enzimatik fonksiyonları işlemek için ve ne olursa olsun, embriyonik ön-mayoz veya mayoz fonksiyonların 4,12 gelişimsel sonuçlarını izlemek mümkündür. Farmakolojik analizlerde, biz daha önce mayoz profaz sırasında bromodomain proteinin asetilleşme bağımlı lokalizasyonu gibi şapkalar ve HDAC&#39;ler 12,21 hedefleyen özel inhibitörleri kullanarak post-mayoz spermatogenezde epigenetik, HP anahtarı için histon asetilasyonun düzeylerinin alaka analiz. Bu deneylerde, HP anahtarı Hedefleme füzyon genleri histone2AvD-TTT ile endojen desen protamineB-EGFP 12,22 eksprese eden bir uçucu suşu kullanılarak mümkün kılınmıştır ve gözlem olduğupupa testislerde ilk spermatid 24 ve 48 saat APF 12 arasındaki HP anahtarı geçer. Sunulan protokol Drosophila pupa, kültür koşulları ve sağlam olan bir pupa testis farmakolojik testte testis ve kistlerin diseksiyon açıklar. Bu amaçla, puparium formasyonu (APF) sonra yaklaşık 24 saat sonra pupa testis kesilip alınmıştır (Şekil 1 ve 2 &#39;ye bakınız). Bu anda, testisler diğer dokulara bağlantıları yapılmış değil ve inhibitör bileşiklerin 23,24 daha iyi nüfuz etmesini sağlar sadece ince bir dış kılıf ile çevrilidir. Testisler kolayca kültürün içine alınabilir fasulyesi ya da armut şeklinde bir organdır. Bu kültür testis, kesilmiş ve spesifik inhibitörleri ile tedavi edilmektedir. Daha sonra, inhibitörlerin etkileri immünofloresan analiz eder ve füzyon protein ifade floresan mikroskopi kullanılarak izlenir ve nükleer morfolin karşılaştırılmasıylaTedavi edilmeyen germ hücrelerinin olduğu için tedavi germ hücrelerinin ogy. Bu protokol sunulan koşullar aynı zamanda kültür testisler ve germ-line kistler gelişmekte canlı görüntüleme sağlar.

<table><tbody><tr><td>Anacardic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>172050</td><td>brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td></tr><tr><td>Anti-acetyl-Histone H4</td><td>Merck Millipore</td><td>06-598</td><td>brand: Upstate</td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver.Z1 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5-Inox forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optical&amp;nbsp; illuminator</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td><td>Dianova</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B1155</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop or pin holder</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td><td>Plano GmbH</td><td>N5018</td><td>In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td><td>Plano GmbH</td><td>N5014</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, 24-wells</td><td>Becton Dickinson</td><td>351147</td><td>brand: Falcon</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>invitrogen</td><td>15070</td><td>brand: Gibco</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 binocular</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Memelilerde ve Drosophila melanogaster spermatogenez sırasında, erkek germ hücreleri temel gelişim süreçleri bir dizi geliştirmek. Bu kök hücre popülasyonu, mitoz büyütmesi ve mayoz farklılaşmasını içerir. Ek olarak, öz değişmesine ait sonrası germ hücreleri, dramatik bir morfolojik yeniden şekillendirme işlemi gibi mikrop hattı kromatin-histon-protamin ile anahtarın küresel epigenetik tekrar konfigüre tabi tutulur. Mutagenezi veya başka genetik araçlar kullanılarak sonrası öz değişmesine ait spermatogenez bir proteinin rolünün incelenmesi, genellikle temel embriyonik ön mayoz veya araştırma altındaki protein öz değişmesine ait işlevleri tarafından engellenmektedir. Bu tür bir protein, bir mutantının sonrası öz değişmesine ait fenotip önceki bir gelişim bloğu bulanıklaşmasının edilebilir veya fenotipin yorumlanması karmaşık olabilir. Model organizma Drosophila melanogaster bir bu soruna bypass sunar: sağlam testisler veErken pupa disseke germ hücrelerinin bile kistleri kültür ortamında ex vivo geliştirmek edebiliyoruz. Bu tür kültürlerin Yapımı kullanımı testislerde ve germ-line kistler germ hücrelerine yaşayan mikroskobik görüntüleme sağlar. Önemli olarak, ekili testis hücreleri ve tohum hücreleri de bu şekilde sonrası miyoza ait aşamaları dahil olmak üzere, spermatojenez sırasında enzimatik işlevleri manipülasyonuna izin veren farmakolojik önleyicileri tarafından ulaşılabilir olur. Sunulan protokol incelemek ve pupa testisler ve germ-line kistler yetiştirmek için nasıl açıklar. Pupa testis ve kültür şartlarının geliştirilmesi ile ilgili bilgiler kültürün canlı testisler ve germ-line kist mikroskop görüntüleme verilerinin yanında verilmektedir. Biz de histon asetiltransferaz inhibitörü anakardik asit kullanılarak histon-to-protamin anahtarı hedefleyen bir deneyle örneklenen post-mayoz spermatogenez, çalışmak için farmakolojik tahlil açıklar. Prensip olarak, bu uygulama metodu birçok o ele adapte olabiliröncesi ve sonrası mayoz spermatogenezde ther araştırma soruları.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment at JoVE.com

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.4K Görüntüleme.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Video: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Nörobilim

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Biyoloji

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Fly Testislerin görüntüleme centrosomes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler