The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Etik bildirimi: Bu protokol açıklanan deneysel işlemler münhasıran Drosophila melanogaster ile çalışmak ve Almanya&#39;da hayvan refahı yasalara tabi değildir barındırır. Medya, Araçlar, ve Sinek 1. Hazırlık <ol><li> Potasyum bikarbonat 17 olmadan değiştirilmiş piyasada mevcut toz M3 büyüme ortamı hazırlayın. DİKKAT: Göz ve cildi tahriş eder. % 10 cenin sığır serumu ile orta Ek, 100 E / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin. En iyi sonuçlar için ısı ile inaktive edilmiş ve böcek kültür test edilmiş cenin sığır serumu kullanın. -20 ° C&#39;de parçalar halinde, 0.2 um&#39;lik bir şişe iyi filtre birimi ve mağaza (ortam diye değinilmektedir) tam orta filtre. Kullanmadan önce, filtre (0.2 mikron şırınga filtre ucu) orta tekrar çökeltilerin kaldırmak. </li><li> Farmakolojik deneyler için önleyici stok çözelti hazırlayın. Dissolalikotları uygun bir solvent ve mağaza kimyasal ettik. (: Göz ve cildi tahriş edicidir DİKKAT) dimetilsülfoksitte Örneğin, 28.69 mM anakardik asit stok çözeltisi hazırlamak. </li><li> Disseke pupa testis ve tek kist diseksiyon bozulması için araçlar hazırlayın. Iki keskin ve sert iğneler yerine bir çift forseps kullanın. Forseps bir çiftinin iki kolu arasında gelişen kılcal kuvvet çok zor ortamı az miktarda tek kist diseksiyon hale getirir. Örneğin, bir aşı halka tutucu içine yerleştirilmiş paslanmaz çelikten bir böcek iğnesinin ucunu kullanın. </li><li> Beyaz sinek, yeterli sayıda (yaklaşık 40-60 sinekleri) ile uygun olarak yaşlı pupa, tohum ca. 10, büyük kültür şişeleri (4 cm çaplı borular) elde etmek için. HP anahtarı analiz etmek için, onların endojen desen 12,16,22 içinde H2AvD-RFP ve ProtamineB-eGFP ifade sinekler kullanın. 25 ° C&#39;de standart koşullar altında inkübe şişeleri, En fazla 4-5 gün üçüncü instar larvaları tarama kadar takriben ° C ile şişelerin 25 duvarlarında pupa başlar. </li></ol> Diseksiyon için 24 saatlik eski Pupalar elde edilir 2. İşaretleme veya Beyaz Toplama Pre-pupa <ol><li> , HP anahtarı bazı kimyasalların etkisini test yaklaşık 24 saat APF 12 de pupa testisi incelemek. Aşamalı pupa elde edilmesi için, larva pupa ile hazırlanan sinek kültür şişeleri alır (Bölüm 1.4) ve mümkün olduğu kadar çok beyaz önceden tespit pupa. Pupa yılında ilk adımı sırasında ön-pupa hareketsiz olmayan beslenme, dışa çekik spiracles ve beyaz renkli puparium ile oldukça kısaltılmış larva olarak görünür. Puparium pupa gelişme 26 sonraki aşamada gösterir 30 ila 60 dakika, içindeki kahverengi-kahverengi olur. </li><li> Viyallerin dış kalıcı bir kalem ile ön pupaların bir şekilde işaretleyin. Yaklaşık 24 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe şişeleri. <ol><li> Seçenek olarak,PBS tamponu ile nemlendirilmiş küçük bir fırça ile şişelerin yan ön pupa seçin. Daha sonra yeni bir 50 ml&#39;lik reaksiyon tüpünün yan ön pupa aktarın ve yaklaşık 24 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li></ol> Puparium Formasyonu sonra yaklaşık 24 saat sonra Pupa Testislerindeki 3. Diseksiyon <ol><li> , 10 cm Plastik hücre kültürü ya da bir Petri tabağına orta birkaç damla (yaklaşık 80 ul her biri) dağıtın. Forseps geniş bir çift veya ortam ile nemlendirilmiş bir fırça kullanarak, (bakınız bölüm 2) kuluçkaya flakonlarından 24 saat APF aşamada pupa almak. Yemeğin orta her damlasını bir pupa aktarın. </li><li> Diseksiyon için, bir fiber-optik aydınlatıcı ile teçhiz edilmiş bir stereo mikroskop kullanılır. Bu kültürde doğru gelişmesini engelleyebilecek gibi diseksiyonu sırasında RT yukarıda testisler ısıtmayın. <ol><li> No 5 forseps iki çift ile pupa ayır. Bir çift, onun en posterior pupa kapmakbölüm (posterior spiracles) ve konumda tutun. </li><li> Forseps diğer çifti ile ön spiracles tut ve ön sonunda pupa kapakçık açın. Toraks en azından bir kısmı açığa çıkana kadar pupa davayı soyulabilir. </li><li> Onun en arka sonuna pozisyonda pupa tutmaya devam edin. Pupa iç basıncını serbest bırakmak için, pupa kafa bölgesine forseps çiftinin her iki kolu yerleştirin. </li><li> Forseps açılması ve anterior yönde forseps hareket ettirerek açık pupa rip. Bu hareket ile oluşturulan açıklık ilk denemede mümkün olduğu kadar büyük olduğundan emin olun. Basınç bu testisler küçük açıklıktan doğrudan itiliyor ve en sık engelleniyor neden olabilir olarak piyasaya sürülmüştür önce, arka sonunda pupa zarar kaçının. </li><li> Pupa açıldıktan sonra, pupa salınan iç basınç la ile yağ ve vücut hücreleri ve doku topakların presler gözlemleyinkafa bölgesinde rge açılması. Pupa testisler zaten bu malzeme ile pupa itilmiş olup olmadığını kontrol edin; Bu, bazı durumlarda ortaya çıkar. Testis 24 saat APF herhangi bir başka doku ile bağlantılı değildir ve bu nedenle pupa 23 kolaylıkla çıkabilmektedir. </li><li> Onlar pupa kalırsa bu testislerin zarar verebilir forseps ile pupa sıkmaktan kaçının. Forseps kullanılarak bir çift açıklığın büyütün. </li><li> Daha sonra, en arka ucunda pupa tutun. Pupa testisler serbest bırakmak için anterior posterior gelen pupa içeriklerini diğer forseps çifti ve yavaşça çizgi kapatın. </li></ol></li><li> Önceden kesilmiş 200 ul pipet içine çekerek testisler toplayın. Testisler ile transfer vücut yağ hücrelerinin sayısını azaltmak için orta sadece çok küçük bir miktar transfer çalışın. Bir taze kültür çanak ortamı içine testisler yerleştirin. Sadece birkaç şişman vücut hücresinde kadar testislerde orta birkaç kez yıkayıns kalır. </li><li> Canlı görüntüleme için, orta ile bir cam alt kültür çanak testisler aktarmak ve ters bir görüntüleme mikroskop kullanıyoruz. Farmakolojik deneyler, adım 5 ile devam edin. </li></ol> Erkek germ-line Kistler ve Canlı Görüntüleme 4. Diseksiyon <ol><li> Cam-alt kültür çanak için bir veya daha fazla pupa testis aktarın. </li><li> Fiber optik aydınlatma ve iki paslanmaz çelik iğne ile stereo-mikroskop kullanmak erkek germ-line kistlerin diseksiyonu için (bölüm 1.3). <ol><li> Bir iğne ile, dikkatlice ön veya arka ucunda bir testis aşağı pin deneyin. Konumda tutun. Testis içine diğer iğneyi ve yanlara iğne hareket ettirerek testis kılıfı bozabilir. Kistlerin çoğu bu hareketi ile testisten çıkacak. </li><li> Bir iğne ile pozisyonda testis tutmaya devam edin. Diğer iğne ile testisten kalan kistlerin nazikçe çizgi. </li><li> Gent tarafından Ayrı toplanmış kistleri yaly kistlerin küme aracılığıyla veya 200 ul pipet kullanarak ortam ile taze kültür çanak kistleri aktararak yana bir iğne hareket. </li></ol></li><li> Tek kist canlı görüntüleme için ters bir görüntüleme mikroskop kültür çanağı hareket. Bir iğne gerekirse yeniden kist dağıtılır. <ol><li> Faz-kontrast ve floresan mikroskobu kullanarak kistlerin sahne tanımlayın. </li><li> Istenen aşamada bir kist odaklanın. Kistler kültür çanak alt uymak ve bu nedenle odak akıp eğilimi yok gibi, sık sık uzun görüntüleme deneyleri sırasında odak ve kist konumunu onaylayın. Not: Hareketsizleştirme için poli-L-lisin ile çanak kaplanması erken germ-çizgisi kist gelişimi için zararlıdır. Bunun yerine, bireysel kistler izole edilebilir. Bazı uygulama ile, çok hafifçe iğne ile iterek belirli bir kist tek tek mümkündür. Bu ayrı kült tek kistlerin transferi sağlayacakmikroskop görüş alanına sığar çizilmiş bir ucu bir cam Pasteur pipeti ile ure yemekler. İzole kistler daha sonra kolayca hatta uzun süreli inkübasyon sonrasında kültür tabaklarında taşındı olabilir. </li></ol></li></ol> Bozulmamış Pupa Testislerindeki 5. Farmakolojik Deneyi <ol><li> 12 replika deney için ortamdan 500 ul, 24 gözlü hücre kültür plakasının her bir gözeneğine doldurun. Önceden kesilmiş 200 ul pipet kullanarak her bir kuyunun Transfer tek pupa testis,. <ol><li> Ters bir floresan mikroskobu kullanılarak izole testislerde protaminler varlığı kontrol edin. Testisler, HP anahtarı kistlerin herhangi bir yer almadığını gösterir ProtamineB-eGFP sinyal, ücretsiz olmalıdır. Zaten ProtamineB-eGFP-pozitif kistler göstermek testisler değiştirin. </li><li> İlk 12 kuyuya, arzu edilen nihai konsantrasyonu elde etmek üzere seyreltildi inhibitör bileşiği (anakardik asit) içeren bir maddenin 500 ulOyuk başına 1 ml ortam maddesi içinde (150 uM). Tedavi edilmeyen kontroller olarak kalan kuyuları kullanın; inhibitör bileşikleri gibi kullanılan çözücü ile aynı miktarda ortamının 500 ul ilave edin. Not: Birçok farklı bileşik, ve çözücü maddeler kullanıldığında, bu kontrol olarak sadece ortamını kullanmak için daha verimli olabilir ve ayrı deneyde çözücü artan konsantrasyonlarının etkisini test etmek. </li></ol></li><li> Karanlıkta, 24 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi inkübe testislerde protaminler varlığında tekrar edin. Kontrol testis, HP anahtarı aracılığıyla geçişi gösterir bir veya daha fazla ProtamineB-eGFP-pozitif kistler, göstermelidir. </li><li> 200 ul, bir pipet ucu kullanarak, poli-L-lizin kaplı slaytlar testisler aktarmak başka 12,27,28 tarif edildiği gibi uygun bir floresan antikorlar ile kabak hazırlıklar ve leke olun. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.

Sunulan protokol belirli bir gelişim aşamasında ve bir kültür çanak bu hücrelerin ve dokuların ex vivo geliştirme Drosophila testisler ve tek germ-line kistler incelemek için yeteneği hem dayalı iki farklı uygulamaları açıklar. Diğer bir uygulama geliştirme sırasında sperm yaşam süreçlerini önemli farmakolojik değiştirmedir. Önemlisi, bu kolayca sinek genetik dayalı işlevsel analizler kullanılarak elde değil post-mayoz spermatogenez için erişim sağlar. Diğer uygulama yaşayan ve germ hücreleri ve testislerin geliştirilmesi mikroskobik gözlem. Özellikle kültür Drosophila hücreleri ve organların yeteneği, bu uygulama avantajları hayatta kalma ve oda sıcaklığında ve normal bir atmosfer altında geliştirmektir. Böylece, bir (25 ° C standart yetiştirme sıcaklıkta ısıtılarak) ısıtılmış aşaması ile donatılan bir ters mikroskop görüntüleme canlı görüntüleme deneylerinde anlamlı sonuçlar elde etmek için yeterlidir. Ayrıcacanlı görüntüleme için floresan protein-etiketli proteinleri eksprese Dahası, pek çok transjenik sinek suşları mevcut veya kolayca kurulabilir. Belirli bir gelişim aşamasında pupa testisler ya da germ-line kistler elde etmek için, bu bir Drosophila gelişme zamanlama aşina olduğu önemlidir. Her aşama için kesin zamanlama laboratuvarlar, kültür koşulları arasında değişir ve suşları sinek ve ampirik kurulmalıdır olabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, bu örnek için, HP anahtarı hedef, farmakolojik tahliller için özellikle önemlidir. Bu deneyler için, zamanlama bile bir popülasyon içinde değişiklik gösterebilir, çünkü her gerçek önleyicisi test öncesi bir ProtamineB-EGFP sinyal spermatidler kontrol edilmesi tavsiye edilir. Ekli vücut yağ dokusu serbest dokunulmamış organlar gibi erken pupa aşamalarında testisler incelemek için deneyci sağlamalıdır yukarıda protokolünü takiben. Bu testis ve hatta daha çok, ge izolerm-hat kistler çok kırılgan. Bu nedenle, taşıma ve forseps, iğneler, ve pipetler kullanarak testisler ve kistler aktarılması için gerekli el becerisi ve deneyimlerini geliştirmek için çok önemlidir. Özellikle mayoz ve erken post-mayoz germ hücresi gelişimini hedefleyen çalışmalar bu yararlanacak. Erişkin testis uzun Kamçılı geç spermatid kistleri incelemek için nispeten kolay olsa da, daha önce aşamalarını elde etmek zordur. Bu protokol sonrası erken pupa testis bu kistler Diseksiyon çok daha verimli. Olağan sinek türünde, pupa sadece yaklaşık% 50 erkek olacak aklınızda tutun. Bu nedenle, gerekli testislerin sayısı kadar pupa olarak en az iki kez incelemek için hazırlar. Alternatif olarak, testisler dokunulmamış larva 23,34 yanal yağ vücut dokuları içine gömülü olarak saydam tur organları tespit edilebilir, stereo-mikroskop kullanılarak erkek L3 larvalarına tespit etmek ve taze kültür şişeleri içerisinde toplamak mümkün olduğunu canevreleme ve diseksiyonlardan ön-pupa seçmek için kullanılabilir. Bu erkek ön pupa 35 tespit etmek de mümkündür. Ayrıca önceden 18 bildirilmiştir Biz, izole germ-line kistler ve kültür bozulmamış pupa testisler hem ışık duyarlı olduğunu fark ettim. Bu ışık duyarlılığı da farmakolojik deneylerde kullanılan bazı kimyasal bileşiklerin tutabilir. Bu nedenle, inkübasyon sırasında karanlıkta bir tahlilin kültür kaplarına tutmak için en iyisidir. Gelişmekte testis ve time-lapse görüntüleme deneyleri planlarken Aynı şekilde, özellikle, izole kistler, çok uzun pozlama süreleri ve / veya çok yüksek örnekleme oranları, ex vivo gelişimini engelleyebilmektedir akılda tutmak. Uygun olan numune alma oranı deneysel olarak tespit edilmelidir. Kültür tabaklarında bakteriyel ve / veya mantar enfeksiyonları ve aşırı büyüme ciddi bir sorun teşkil etmektedir. Çok bakteri ile enfekte kültür yemekleri ex vivo deve desteği yoktestis ve kistlerin lopment. Bu nedenle, tarif edilen kültür ortamı, penisilin ve streptomisin (adım 1.1), ancak uzun süreli inkübasyon sırasında içerir Bu antibiyotikler, düşebilir ve etkinlik azalır olabilir. Bu sağkalım sınırlı bir süre için nedenlerinden biri (max. 72 saat) Yukarıdaki protokolü kullanarak gözlemlenen kültür kist olabilir. Ancak bu zaman çerçevesi yemekler kültür ortamının değiştirilmesi ile normal genişletilebilir olabilir. Biz diğer faktörler gibi genital sistem diğer dokulardan büyüme sinyalleri bir eksikliği olarak, kültürde hayatta etkileyebilir sonucuna varıldı. Öte yandan, öz değişmesine ait sonrası daha hızlı gelişimi Drosophila memelilerde daha uzundur. Drosophila, spermiogenesis yaklaşık 90 saat sürer ve HP anahtarı mayoz 9,12 sonra 50 ve 60 saat arasında gerçekleşir. Dolayısıyla, bu protokol ile elde etrafında 48 saatte normal sağkalım süresi müstakbel önemli gelişim süreçlerini takip etmek uygundurBöyle Mayotik bölümler veya HP anahtar olarak rmatogenesis. Bakteri veya mantar kontaminasyonu temiz araçları ve medyayı kullanarak önlenebilir olmasına rağmen, sunulan protokol sinekler nedeniyle kesinlikle steril çalışma koşulları faydalanmak ve standart koşullar altında geçirilen zaman testisler zaten bakteri barındırmaz uçmaz. Yine de, bu kültür tekniğinin bazı uygulamaları disseke sinekler yarar olabilir hatta (protokoller için, 17,36,37 bakınız) aseptik koşullarda kaldırdı. Farmakolojik deneyler inhibitörleri veya aktivatörlerinin çeşitli enzimlerin işlevi gören kimyasal bileşiklerin kullanımına bağlıdır. Yaygın haliyle, deneylerde kullanılan bileşikler genellikle, hedef spesifikliği bakımından büyük farklılıklar vardır. Bir avantaj olarak, bu anakardik asit inhibe p300 / CBP, PCAF, ve şapkalar 38 MYST aile üyeleri ile, örneğin, bütün enzim sınıfları hedef potansiyel sunmaktadır. Bu olumsuz hedef dışı veya sitotoksik etkileri induc bir potansiyel olabilirBu tür bileşiklerin ederek hazırlanabilir. Bu nedenle, testis veya pupa kistli bir deneyde kullanılan her bileşiğin, sitotoksisite ve farklı konsantrasyonlarda özel etkiler için test edilmelidir. Buna ek olarak, kültür koşulları, bileşik konsantrasyonu veya aktivitesi, hücre geçirgenliği değişiklikler küçük farklılıklar bağlı etkilerin değişkenliğe neden olabilir. Bu nedenle, her bir deney için tedavinin başarısını izlenmesi gereklidir. Biz 150 uM&#39;de anakardik asit kullanıldığında histon H4 asetilasyonu sürekli azaldığı Örneğin, biz ile bazen testis olan kromatin kondensasyonu fenotipin kuvvetinde hafif bir değişkenlik gözlenmektedir. Kültüründe Drosophila testisler ile farmakolojik deneyler spermatogenez 4,12,14,21 öncesi ve sonrası-mayoz mekanizmalarını analiz etmek için kullanılmıştır. Genetik araçları ile post-mayoz spermatogenez erişmek zor olduğundan Essentia ile oyuncu hedefl ön-mayoz ve mayoz fonksiyonları, bu ex vivo yaklaşım bir alternatif oluşturmaktadır. Ayrıca, ilke olarak, yöntem, zaman içinde tedavi edilen üreme hücrelerinin gelişimini izlemek kovalayıcı deneyler pulse uyarlanabilir. Ancak, henüz bu olasılığı test etmedim. Erken pupa testislerde Yapımı kullanımı farmakolojik testlerin bir avantajdır. İlk olarak, (24 saat APF civarında) genç pupa testislerin ince dış kılıf kimyasal bileşiklerin geliştirilmiş geçirgenlik izin verebilir. Post-mayoz HP anahtarını okuyan İkincisi, pupa testisler, HP anahtarı etkilenen veya yapılmadığının doğrudan okuma etkinleştirmek Protamine-GFP ifade sinek hattı 24 saat APF disseke. Bugüne kadar, Drosophila organ ve testis ve germ-çizgisi kistler dahil olmak üzere dokuların ex vivo olarak kültivasyonu için çeşitli protokoller (örneğin, bkz 4,14,17,20,39,40) geliştirilmiştir. Yetiştirme ortamı ve kullanılan genel şartları1979 yılında kuruldu burada sunulan protokolünde 17. kültür sistemi, daha sonra yetişkin testis 4 izole sonrası geç-mayoz kistlerde bireyleşme mekanizmasının in vivo görüntüleme adapte edildi. Daha önce, bu koşulları da etrafında 48 saat 12 onların kist hayatta kalmayı ve mayoz ve erken post-mayoz germ hücrelerinin farklılaşmasını destekleyen bildirdi. Diğer kültür sistemlerine 19 aksine, bu kültürlerde gözlenen gelişim zamanlaması (ayrıntılar için, bakınız 12) sabit örneklerden belirlenir zamanlama ile hemen hemen sabit olmuştur. H2AvD-RFP ve protamin-GFP flöresan sinyalleri kültürde üreme hücrelerinin nükleer kromatin morfolojisi ve bileşim görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Biz kültürde gelişim aşamaları net bir şekilde belirlenmesi için, bu tür kistlerin kıvrılma gibi diğer kriterler üzerinde avantajlı olduğunu bulundu. Önemli olarak, uçucu Sunulan protokol ext ilavesini içermezfetal sığır serumu dışında ract ya da diğer büyüme faktörleri. Ayrıca, koşullar ex vivo kültür içinde öz değişmesine ait bölünme floresan mikroskobu görüntüleme ile uyumlu olduğunu gösteriyoruz. Çıkan uzun süreli gelişimini destekleyen bir kolay kullanımlı ortamda makul çözünürlük ile elde edilebilir. Bu Voltalef petrol 41,42 kısa vadeli (yaklaşık 3 saat) gözlemlerini sağlayan protokolleri tersidir. Yetiştirme ve pupa testis ve tek erkek germ-line kistlerin farmakolojik tedavisi için, yukarıda anlatılan prosedürler Drosophila spermatogenezde araştırılabilir birçok genetik, epigenetik, biyolojik hücre veya gelişimsel sorulara kolayca uyarlanabilir. Bu germ-line kök hücreler üzerinde duruluyor özellikle araştırmalar içerir. Gösterilmiştir ki, kültürlenen yetişkin canlı görüntüleme ile takip edilebilir kök hücre gelişimi 20,43 testis gösterilmiştir. Bununla birlikte, testis olgun peristaltik hareketi kılıfh görüntü alımı ile müdahale. Bu yüzden, iki görüntüleme parçalanmış testisler 43 veya görüntüleme gerçekleştirilen deneylerin sayısı kayıp veri kümeleri 20 hesaba arttırılmalıdır kullanılarak yapılır. Erken pupa testisler (24 saat APF) henüz kas hücreleri ile kapalı değildir. Hatta biraz eski testisler (36-45 saat APF) birkaç peristaltik hareketleri göstermek (Şekil 3 ve Ek videoyu 1 karşılaştırmak) görünür. Bu nedenle, dokunulmamış organlar gibi genç pupa testislerin ekimi bir alternatif olarak hizmet verebilir. Ayrıca, bir kez pupa testisler incelemek için yeteneği hakim ve sonunda izole germ-çizgisi kistler, küçük hücre popülasyonu olsa homojen bir kaynağı olarak tek bir kist kullanılarak daha fazla uygulamalar sağlar. Bugüne kadar görüldüğü gibi, örneğin, bir, spermatojenez, tanımlanmış aşamalarda spesifik genlerin transkripsiyonu düzenlediği analiz etmek için RT-qPCR gerçekleştirmek mümkün olmaktadır <sup&gt; 15.

Birçok türün erkek germ hücrelerinin gelişimi sıralı süreçtir. Bu morfolojik ve epigenetik oldukça uzmanlaşmış sperm oluşumu ile sonuçlanacak çok önemli bir dizi olay ile karakterize edilir. Drosophila melanogaster, testis böl ucunda germ-line kök hücreler asimetrik 1,2 (genel bir bakış için bkz Şekil 1), yeni bir kök hücre ve spermatogonyum, yani farklılaşma kararlıdır yavru hücre meydana getirmek için . Spermatogonyum mayoz başlangıcı ile, şaşırtıcı gelişmeler ve transkripsiyon aktivite fazı spermatosit aşaması olarak adlandırılan, mitotik bölünmeleri dört tur geçirilir ve. Bir spermatogonyum kaynaklanan hücreler birbirine bağlı iki somatik hücre-bir yapı, kist olarak adlandırılır tarafından sarılı bir paket olarak eşzamanlı geliştirmek kalır. Mayoz tamamlanmasından sonra, erkek üreme hücrelerinin morfolojisi tamamenyeniden (şematik olarak, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir). Başlangıçta, yuvarlak spermatidler hidrodinamik kafası yapısının oluşturulması için uzunlamasına ve kamçı geliştirir. 5 - Sonunda, sperm hücrelerinin bireyselleştirilmesi 3 olarak adlandırılan karmaşık bir apoptoz ile ilgili bir mekanizma ile birbirinden ayrılır. 9 - Drosophila melanogaster ve memeli türler de dahil olmak üzere birçok türde, haploid germ-line kromatin olağanüstü bir epigenetik yeniden düzenlenmesi eşliğinde germ hücrelerinin morfolojik değişiklikler, (HP anahtarı) 6 histon-to-protamin anahtarı da denir. Muhtemelen hemen hemen tüm standart histon ve histon birçok varyant molekülü DNA&#39;dan ayrılır ve olgun sperm kromatin özgü, yüksek ölçüde kompakt bir yapıyla sonuçlanan nucleoprotamine küçük temel protein, protamin, ile yer değiştirir. HP anahtarının genel özellikleri t vardırsonra ilk geçiş proteinleri tarafından ve nihayet protaminler tarafından histon varyantları tarafından kanonik histonların diye değiştirilmesi. 12 - Tüm bu histon kaldırılması 7,10 hemen önce böyle histon H4 asetilasyonu seviyelerinde bir dalgalanma olarak epigenetik işaretleri çeşitli değişiklikler eşlik eder. Tümü değilse de çoğu, yukarıda sözü edilen işlemlerin, olgun, tam olarak fertil sperm gelişimi için gereklidir. Bu memeli spermatogenez pay olarak, omurgasız sistem 1,8,9 benzerliği önemli bir bölümü, Drosophila aynı zamanda insanlarda sadece geçerlidir. Germ-hücre gelişimini büyük ölçüde incelenmesi Drosophila model sistemde kolaylaştırılır. Sinekler genetik derece erişilebilir. Mutantlarının üretilmesi hem de kimerik gen ya da RNA interferans yapıları ifade eden uçucu soylarının kurulması çok az çaba gerektirir. Bununla birlikte, sonra-mayoz spermatojenez, mutantların kullanımının bir çalışmadad basit bir genetik araçlar sınıra ulaşabilir. Drosophila spermatogenezde, transkripsiyon mayoz bölünmeler içine girişi ile neredeyse tamamen sona erer. 16 - Böylece, öz değişmesine ait spermatogenez sonrası esas olarak uzun bir öz değişmesine ait profaz 13&#39;te sentezlenen translasyon bastırılmış depolanmıştır mRNA&#39;lar dayanmaktadır. Bu nedenle, RNA interferansı veya şartsız mutantlarının kullanımı gibi araçlar, özellikle de ön öz değişmesine ait ya da öz değişmesine ait germ hücre gelişiminde temel fonksiyonları yerine gen ürünlerinin post-öz değişmesine ait rolleri incelemek için uygun değildir. 20 - gibi durumlarda yararlanılabilir Drosophila bir avantajı, kültür ortamında 4,12,17 ex vivo olarak geliştirmek için teşrih sağlam testis ve germ hücre da kistlerin yeteneğidir. Testis veya germ-line kistlerin diseksiyonu ve yetiştirme canlı hücreler germ hücre gelişiminde değil, sadece mikroskopik gözlem sağlar, ama birLSO farmakolojik deneyler, kullanımı gibi, örneğin, histon asetiltransferazlar (şapka), histon deasetilazların (HDAC&#39;ler), topoizomerazlar, ya da proteazom gibi enzim komplekslerinin önleyicileri. Bu nedenle, post-mayoz spermatogenez sırasında enzimatik fonksiyonları işlemek için ve ne olursa olsun, embriyonik ön-mayoz veya mayoz fonksiyonların 4,12 gelişimsel sonuçlarını izlemek mümkündür. Farmakolojik analizlerde, biz daha önce mayoz profaz sırasında bromodomain proteinin asetilleşme bağımlı lokalizasyonu gibi şapkalar ve HDAC&#39;ler 12,21 hedefleyen özel inhibitörleri kullanarak post-mayoz spermatogenezde epigenetik, HP anahtarı için histon asetilasyonun düzeylerinin alaka analiz. Bu deneylerde, HP anahtarı Hedefleme füzyon genleri histone2AvD-TTT ile endojen desen protamineB-EGFP 12,22 eksprese eden bir uçucu suşu kullanılarak mümkün kılınmıştır ve gözlem olduğupupa testislerde ilk spermatid 24 ve 48 saat APF 12 arasındaki HP anahtarı geçer. Sunulan protokol Drosophila pupa, kültür koşulları ve sağlam olan bir pupa testis farmakolojik testte testis ve kistlerin diseksiyon açıklar. Bu amaçla, puparium formasyonu (APF) sonra yaklaşık 24 saat sonra pupa testis kesilip alınmıştır (Şekil 1 ve 2 &#39;ye bakınız). Bu anda, testisler diğer dokulara bağlantıları yapılmış değil ve inhibitör bileşiklerin 23,24 daha iyi nüfuz etmesini sağlar sadece ince bir dış kılıf ile çevrilidir. Testisler kolayca kültürün içine alınabilir fasulyesi ya da armut şeklinde bir organdır. Bu kültür testis, kesilmiş ve spesifik inhibitörleri ile tedavi edilmektedir. Daha sonra, inhibitörlerin etkileri immünofloresan analiz eder ve füzyon protein ifade floresan mikroskopi kullanılarak izlenir ve nükleer morfolin karşılaştırılmasıylaTedavi edilmeyen germ hücrelerinin olduğu için tedavi germ hücrelerinin ogy. Bu protokol sunulan koşullar aynı zamanda kültür testisler ve germ-line kistler gelişmekte canlı görüntüleme sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Memelilerde ve Drosophila melanogaster spermatogenez sırasında, erkek germ hücreleri temel gelişim süreçleri bir dizi geliştirmek. Bu kök hücre popülasyonu, mitoz büyütmesi ve mayoz farklılaşmasını içerir. Ek olarak, öz değişmesine ait sonrası germ hücreleri, dramatik bir morfolojik yeniden şekillendirme işlemi gibi mikrop hattı kromatin-histon-protamin ile anahtarın küresel epigenetik tekrar konfigüre tabi tutulur. Mutagenezi veya başka genetik araçlar kullanılarak sonrası öz değişmesine ait spermatogenez bir proteinin rolünün incelenmesi, genellikle temel embriyonik ön mayoz veya araştırma altındaki protein öz değişmesine ait işlevleri tarafından engellenmektedir. Bu tür bir protein, bir mutantının sonrası öz değişmesine ait fenotip önceki bir gelişim bloğu bulanıklaşmasının edilebilir veya fenotipin yorumlanması karmaşık olabilir. Model organizma Drosophila melanogaster bir bu soruna bypass sunar: sağlam testisler veErken pupa disseke germ hücrelerinin bile kistleri kültür ortamında ex vivo geliştirmek edebiliyoruz. Bu tür kültürlerin Yapımı kullanımı testislerde ve germ-line kistler germ hücrelerine yaşayan mikroskobik görüntüleme sağlar. Önemli olarak, ekili testis hücreleri ve tohum hücreleri de bu şekilde sonrası miyoza ait aşamaları dahil olmak üzere, spermatojenez sırasında enzimatik işlevleri manipülasyonuna izin veren farmakolojik önleyicileri tarafından ulaşılabilir olur. Sunulan protokol incelemek ve pupa testisler ve germ-line kistler yetiştirmek için nasıl açıklar. Pupa testis ve kültür şartlarının geliştirilmesi ile ilgili bilgiler kültürün canlı testisler ve germ-line kist mikroskop görüntüleme verilerinin yanında verilmektedir. Biz de histon asetiltransferaz inhibitörü anakardik asit kullanılarak histon-to-protamin anahtarı hedefleyen bir deneyle örneklenen post-mayoz spermatogenez, çalışmak için farmakolojik tahlil açıklar. Prensip olarak, bu uygulama metodu birçok o ele adapte olabiliröncesi ve sonrası mayoz spermatogenezde ther araştırma soruları.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment at JoVE.com

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K Görüntüleme.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Video: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.