Whitehall Vakfı'na, scripps araştırma enstitüsünden bu çalışmayı yürüttükleri için fon desteği ve başlangıç fonları için içtenlikle teşekkür ederiz.

1. Abdominal Ganglion Aplysia californica Abdominal Ganglion'dan Abdominal Ganglionların Hazırlanması, Elektrofizyolojik Ölçümler ve Tek Tanımlanmış Nöronların İzolasyonu
<ol><li>Aplysia'yı laboratuvar akvaryumunda 12:12 ışık:karanlık koşullar altında 16 °C'de dolaşan yapay deniz suyu (ASW) ile koruyun.</li>
	<li>Karın ganglionunun izolasyonu.<ol>
<li>5-10 dakika boyunca 380 mM MgCl2 çözeltisi enjekte ederek hayvanları uyuşturun (hayvanın vücut ağırlığının% 30-35'ine eşdeğer).</li>
		<li>Karın ganglionunu merkezi sinir sistemindeki konumuna göre tanımlayın24,28.</li>
		<li>Gangliyleri cerrahi operasyonla çıkarın ve hemen 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3ve 10 mM HEPES 'den (pH 7,4) oluşan yapay deniz suyunda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteaz tedavisi.<ol>
<li>Yukarıda açıklanan ASW'de seyreltilmiş% 0±1 proteaz (dispaz) ile bir Petri kabında 34 °C±0.5'te 30 dakika boyunca karın ganglionunu kuluçkaya yatır. NOT: Kullanılan proteaz miktarının hayvanların yaşı ve ağırlığı ile standartlaştırılması gerekir. Genel olarak, yaşlı ve daha büyük hayvanlar daha fazla proteaz gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gangliyon kılıfa kaldırılması.<ol>
<li>Enzim tedavisinden sonra, gangliyolayı bir hücre odasının Sylgard Silikon tabanına sabitleyin (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) ve oda sıcaklığında (18 °C±2) ASW (akış hızı: 150 μl/ dk) ile perfuse. NOT: Tanımlanan nöronların görünürlüğünü artırmak için ganglionu, 20X ve 40X büyütmeli dürbün stereomikroskop kullanılarak alttan kolayca aydınlatılabilen polikarbonat cam silindirin(Şekil 1) (çap Ø= 2 mm modifiye hücre odası) üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Kılıbını, kümesleri ve mikrosirsörler kullanarak gangliyondan dikkatlice çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki nörondan eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt.<ol>
<li>İlgi çekici nöronları tanımlayın.</li>
		<li>Nöron, 3 M KCl çözeltisi ile doldurulmuş 10-15 MΩ dirençli tek bir hücre içi keskin mikroelekrod ile impale edin.</li>
		<li>Hücre içi kayıt sistemi kullanarak nöronal aktiviteyi (10 kHz bant geçişi) kaydedin.</li>
		<li>Kayıt verilerini Axograph gibi elektrofizyoloji yazılımı kullanarak işleyin. NOT: Kişi birden fazla nörondan kaydı kolayca gerçekleştirebilir. Nöronlar L7, L11 veya R15 ve R2 konumlarına göre kolayca tanımlanır. İki L7 ve R15 nörondan aynı anda kayıt için iki amplifikatör ve iki mikromanipülatör gereklidir (Şekil 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>İlaç uygulaması.<ol>
<li>Seçtiğiniz ilacı nazik pipetleme ile hücre odasına uygulayın veya doğrudan nöronlara enjekte edin.</li>
		<li>Elektrofizyolojik ölçümler yapmak. NOT: Deneysel hedefe bağlı olarak, ilaç uygulamasından önce, ilaç uygulaması sırasında ve sonrasında membran potansiyelindeki (MP) veya eylem potansiyelindeki (AP) değişiklikler gibi nöronların farklı elektrofizyolojik parametreleri ölçülebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek nöronların izolasyonu.<ol>
<li>Elektrofizyolojik deneylerin sonunda, ASW'nin perfüzyonunu durdurun ve ganglionu% 100 etanol ile yıkayın.  Etanol maruziyeti nöronları taşlaştıracak ve ince kümesler kullanarak, gangliondan diğer nöronlara zarar vermeden bireysel nöronların çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.</li>
		<li>Stereomikroskop altında tek nöronları çıkarın ve buz gibi 500 μl RNA ekstraksiyon reaktifi içeren küçük bir Eppendorf tüpüne aktarın. İzole tek nöronlar gelecekteki analizler için -80 °C'de RNA ekstraksiyon reaktifinde saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qPCR) ile Tek Nöronlardan RNA İzolasyonu ve Gen Ekspresyon Analizi
<ol><li>RNA bozulmasını en aza indirmek için önlemler: Ribonikleazlar (RNazlar) RNA'yı bozar ve çok kararlı ve aktif enzimlerdir. RNA'ları işlerken aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Çalışma alanını ve aletleri RNase devre dışı bırakma ajanları ile temizleyin.</li>
		<li>RNA kullanırken her zaman eldiven giyin ve sık sık eldiven değiştirin.</li>
		<li>RNA'ları işlemek için yalnızca RNase içermeyen plastikler kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Total RNA'nın Tek nöronlardan izole edilmesi:<ol>
<li>RNA izolasyonu için standart Trizol protokolü, RNA'ları tek nöronlardan izole etmek için kullanılabilir. Trizol'a kısaca% 20 v / v kloroform ekleyin, kısa girdap ile iyice karıştırın.</li>
		<li>Tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca rotator üzerine yerleştirin. Trizol-Kloroform karışımını 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika döndürün.</li>
		<li>Sulu fazı toplayın ve taze bir tüpe aktarın.</li>
		<li>RNA'yı çökeltmek için 0,3 M, 100 ng/ml coprecipitant GlycoBlue ve 2,5 hacim %100 etanol nihai konsantrasyonuna sodyum asetat çözeltisi (pH 5,5) ekleyin.</li>
		<li>Numuneleri iyice karıştırın ve gece boyunca -80 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün ve tüpün dibinde küçük mavi bir pelet görünecektir.</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve peletin 850 μl% 75 buz gibi etanol ile 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Üstnatant dikkatlice çıkarın ve RNA peletini maksimum 7-10 dakika boyunca havayla kurulayın. NOT: RNA'nın uzunsüre kurumaya bırakılmamasını bekleyin - RNA peletininkurutılması çözünürlüğü çok zorlaştırır.
</li>
		<li>Kuruduktan sonra, RNA peletini 10 μl RNAse serbest suya yeniden boşaltın ve RNA konsantrasyonu belirleyin. NOT: Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu belirleyin. Hemen kullanmadığınızda, RNA'yı -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>tek nöronlardan aRNA sentezi:<ol>
<li>Ticari olarak kullanılabilen doğrusal RNA amplifikasyon sistemini kullanarak RNA'yı (deneysel hedefe bağlı olarak bir veya iki tur) güçlendirin. NOT: Tek nöronlardan elde edilen toplam RNA ~10-60 ng arasında değişmektedir. İlk tur amplifikasyonun beklenen verimi ~100-300 ng ve ikinci amplifikasyon turu ~0.8-1.5 μg RNA'dır.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA'nın ters transkripsiyon:<ol>
<li>aRNA'dan cDNA oluşturmak için, 20 μl ters transkripsiyon reaksiyonunda 1,0 μg aRNA kullanın. Bu amaçla çeşitli kitler ticari olarak mevcuttur. NOT: cDNA, termal çevrimcide aşağıdaki ayarlar kullanılarak üreticinin protokolüne göre sentezlenmiştir. 25 °C'de 5 dk 42 °C'de 30 dk 85 °C'de 5 dk 4 °C'de tutun</li>
		<li>Ters transkripsiyon adımından sonra, cDNA'yı uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Astar tasarımı ve standardizasyonu: Gerçek zamanlı amplifikasyonlar için astarlar tasarlamak için ücretsiz olarak çeşitli mükemmel yazılım programları mevcuttur.<ol>
<li>70-110 bp amplicon üreten ve astarları ticari kaynakları kullanarak sentezleyen 18-24 mer oligonükleotid seçin. NOT: İlgi çekici her gen için iki ila üç astar çifti tasarlanmalıdır. Her astar setin qPCR tarafından standartlaştırılması gerekir. CREB1 geni için kullanılan ileri ve geri astar çiftleri (Şekil 4) aşağıdadır: Astar seti 1 İleri: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3' Geri vites: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Astar seti 2 İleri: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Ters: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Aşağı akış analizleri için kullanılacak en iyi astarı seçmek için ct değerini ve qPCR'deki amplifikasyon eğrisinin şeklini izleyin. NOT: PCR'nin üstel fazında 40 yuvarlak amplifikasyonda 10-35 arasında Ct (Döngü eşiği) değerleri ve ardından pürüzsüz bir plato ile pürüzsüz eğriler veren primerler gen ekspresyon analizleri için en uygunudur.</li>
	</ol></li>
	<li>Nicel Gerçek Zamanlı PCR (qPCR): Not: qPCR makinesiyle uyumlu uygun tüpler veya plakalar kullanın.<ol>
<li>CDNA'yı çekirdeksiz su ile 5x'e seyreltin.</li>
		<li>2 μl seyreltilmiş cDNA'ya, 2 μl H 2 O, 5 μl2xSYBR Green master mix ve 10 μM (her biri) ileri ve ters astar içeren 8 μl qPCR ana karışımı ekleyin.</li>
		<li>Boruları kapatın ve cDNA ve ana karışımı pipetledikten sonra plakayı kapatın. 30 saniye boyunca 1.500 rpm'de hafifçe dokunup aşağı döndürerek içeriği karıştırın.</li>
		<li>qPCR makinesini kurmaya devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların herhangi bir rakip finansal çıkarları yok.

Nöron R15 kardiyovasküler, sindirim, solunum ve üreme sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar30. AP'nin düzenli olarak ritmik bir patlama aktivitesi R15'in bir özelliğidir. Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, R15 ve L7'nin eşleştirilmiş kaydı, gangliyon preparatının R15 nöronlarının aktivitesini koruduğunu göstermektedir. R15 ve L7 nöronları Ach'e uygun şekilde yanıt verdi. Bu gangliyon preparat 8-10 saate kadar sürdürülebilir ve elektrofizyolojik aktivite sürekli olarak izlen...

İnsan beyni, neredeyse 100 milyar nöron ve trilyonlarca sinaptik bağlantı ile olağanüstü karmaşıktır. Nöronlarla etkileşime giren ve beyindeki işlevlerini düzenleyen neredeyse eşit sayıda nonneuronal hücre vardır. Nöronlar belirli davranışları düzenleyen devreler halinde düzenlenir. Beyin fonksiyonlarını ve sinir devrelerini anlamamızdaki gelişmelere rağmen, belirli bir davranışı kontrol eden devre bileşenlerinin kimliği hakkında çok az şey bilinmektedir. Bir devrenin çeşitli bileşenlerinin kimliklerinin bilgisi, davranışın hem hücresel hem de moleküler temelini anlamamızı büyük ölçüde kolaylaştıracak ve nöropsikiyatrik bozukluklar için yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır.
Deniz salyangozu Aplysia californica, belirli davranışların altında kalan nöronal devreleri belirlemek için bir çalışma atı olmuştur1-14. Aplysia sinir sistemi, 9 farklı gangliyon halinde organize edilmiş yaklaşık 20.000 nöron içerir. Aplysia'nın nöronları büyüktür ve boyutlarına, elektriksel özelliklerine ve gangliyondaki konumlarına göre kolayca tanımlanabilir. Aplysia, çalışılabilen zengin bir davranış repertuarına sahiptir. İyi çalışılmış davranışlardan biri solungaç çekme refleksidir (GWR). Bu refleksin merkezi bileşenleri abdominal gangliyonlarda bulunur. GWR devresinin bileşenleri haritalandı ve çeşitli bileşenlerin katkıları belirlendi. Daha da önemlisi, GWR devresi ilişkilendirilebilir ve ilişkisiz öğrenmeden geçer5,6,15-19. Bu refleks üzerinde onlarca yıllık çalışma da öğrenme ve hafızada kilit bir role sahip birkaç sinyal yolu tanımlamıştır20-24.
Hafıza depolamanın hücresel ve moleküler temelini incelemek için Aplysia'nın birkaç farklı preparatı kullanıldı. Bunlar arasında sağlam hayvan2,3, yarı bozulmamış hazırlık1,7,13,14,16 ve nöral devrenin ana bileşenlerinin yeniden25-29. Tanımlanan nöronal devrelerin elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia gangliyonlarını keşfetmeye yönelik daha az hazırlık burada açıklanmıştır. Tespit edilen dört nöron incelendi. R15, patlayan bir nöron, L7 ve L11, iki farklı motor nöron ve bir kolinerjik nöron olan R2 incelendi. R2 omurgasız sinir sisteminde tanımlanan en büyük nörondur. Kısaca, bu metodoloji gangliyonların proteaz tedavisini, farmakolojik tedavilerden önce ve sonra elektrofizyolojik ölçümleri ve gen ekspresyonunun nicel analizi için tek nöronların izolasyonu içerir. Bu metodoloji, moleküler analizleri birden fazla nörondan eşzamanlı kayıtla birleştirmemizi sağlar. Bu metodoloji, R15 ve L7 nöronlarının asetilkoline (Ach) eşleştirilmiş hücre içi kayıtlarla verdiği yanıtları incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümler sonrasında R15 ve L7 ve L11 ve R2 gibi tanımlanan diğer nöronlar, bellek depolama için önemli bir transkripsiyon faktörü olan CREB1 ekspresyonunun nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için izole edildi.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt;</td><td>National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S 3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P 9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>C5080- 500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 214-501</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA</td><td>S 6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H 3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>GIBCO</td><td>17105-042</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194002</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>ACROS</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc, pH 5.5</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9737</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1751</td><td></td></tr><tr><td>qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95048-100</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Minutien Pins&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10 or</td><td></td></tr><tr><td>26002-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>5430R Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R Centrifuge</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT Fast Real-Time PCR</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>BRAMP-01R</td><td>NPI Electronics</td><td></td></tr><tr><td>Digidata Converter</td><td>Instrutech ITC-18</td><td>HEKA ELEKTRONIK</td><td></td></tr><tr><td>Micro Manipulator</td><td>Patch Star</td><td>Scientifica</td><td></td></tr></tbody></table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Nörobiyolojide önemli bir zorluk, belirli bir davranışı yöneten sinir devrelerinin moleküler temellerini anlamaktır. Spesifik moleküler mekanizmalar belirlendikten sonra, dejeneratif hastalıkların veya sinir sisteminin yaşlanmasının neden olduğu belirli davranışlardaki anormallikleri tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler geliştirilebilir. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelinin araştırılması için çok uygundur, çünkü belirli bir davranışın altında kalan sinir devreleri kolayca belirlenebilir ve devrenin bireysel bileşenleri kolayca manipüle edilebilir. Aplysia'nın bu avantajları, öğrenme ve hafıza nörobiyolojisinin birkaç temel keşifine yol açmıştır. Burada, aplysia sinir sisteminin bireysel nöronların elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için bir hazırlığını açıklıyoruz. Kısaca, sinir sisteminden parçalanan ganglion, ganglion kılıfını çıkarmak için proteazlara maruz kalır, böylece nöronlar maruz kalır, ancak bozulmamış hayvanda olduğu gibi nöronal aktiviteyi korur. Bu preparat, tek veya birden fazla nöronun elektrofizyolojik ölçümlerini yapmak için kullanılır. Daha da önemlisi, basit bir metodoloji kullanılarak kaydı takiben, nöronlar gen ekspresyon analizi için doğrudan gangliyondan izole edilebilir. Bu protokoller, L7 ve R15 nöronlarından eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmek, aplysia'nınizole tek L7, L11, R15 ve R2 nöronlarında CREB1 geninin asetilkolin ve nicel ekspresyonlarına yanıtlarını incelemek için kullanıldı.

Bu çalışmada kullanılan hayvanların ağırlıkları 100-200 g arasında değişmektedir. Açıklanan protokollerin ardından 2-5 g ile 200-300 g arasında değişen hayvanlardan izole edilmiş abdominal gangliyon nöronlarının elektrofizyolojik ölçümlerini ve moleküler analizlerini yaptık.
Proteaz tedavisinin standardizasyonu, gangliyonlardaki nöronların başarılı elektrofizyolojik ölçümleri için önemlidir. Başlangıçta, birden fazla proteaz (Dispase) konsantrasyonu ve s...

Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Görüntüleme.  The Scripps Research Institute, Florida. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Video: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

Elektrot İmalat ve İmplantasyon Aplysia californica Bozulmamış, Serbestçe Behaving Hayvanlar Çok kanallı Sinir ve Kas Kayıtlar

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Nörobilim

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Biyoloji

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

An<em&gt; In Vitro</emFizyolojik Hareketleri Besleme Motor Programlar ortaya çıkartılması ve kayıt için&gt; Hazırlık<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

Kütle Spektrometrisi Kullanarak Tek Nöronlardaki RNA Modifikasyonlarını Karakterize Etme

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Kimya

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Elektrot İmalat ve İmplantasyon Aplysia californica Bozulmamış, Serbestçe Behaving Hayvanlar Çok kanallı Sinir ve Kas Kayıtlar

Büyüme Konileri Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için Aplysia Nöronal Hücre Kültürleri

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler

An

Hazırlanması Aplysia Duyusal-motor Nöronal Hücre Kültürleri

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi

Duyusal nöronlar izolasyonu

Kütle Spektrometrisi Kullanarak Tek Nöronlardaki RNA Modifikasyonlarını Karakterize Etme

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji