Whitehall Vakfı'na, scripps araştırma enstitüsünden bu çalışmayı yürüttükleri için fon desteği ve başlangıç fonları için içtenlikle teşekkür ederiz.

1. Abdominal Ganglion Aplysia californica Abdominal Ganglion'dan Abdominal Ganglionların Hazırlanması, Elektrofizyolojik Ölçümler ve Tek Tanımlanmış Nöronların İzolasyonu
<ol><li>Aplysia'yı laboratuvar akvaryumunda 12:12 ışık:karanlık koşullar altında 16 °C'de dolaşan yapay deniz suyu (ASW) ile koruyun.</li>
	<li>Karın ganglionunun izolasyonu.<ol>
<li>5-10 dakika boyunca 380 mM MgCl2 çözeltisi enjekte ederek hayvanları uyuşturun (hayvanın vücut ağırlığının% 30-35'ine eşdeğer).</li>
		<li>Karın ganglionunu merkezi sinir sistemindeki konumuna göre tanımlayın24,28.</li>
		<li>Gangliyleri cerrahi operasyonla çıkarın ve hemen 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3ve 10 mM HEPES 'den (pH 7,4) oluşan yapay deniz suyunda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteaz tedavisi.<ol>
<li>Yukarıda açıklanan ASW'de seyreltilmiş% 0±1 proteaz (dispaz) ile bir Petri kabında 34 °C±0.5'te 30 dakika boyunca karın ganglionunu kuluçkaya yatır. NOT: Kullanılan proteaz miktarının hayvanların yaşı ve ağırlığı ile standartlaştırılması gerekir. Genel olarak, yaşlı ve daha büyük hayvanlar daha fazla proteaz gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gangliyon kılıfa kaldırılması.<ol>
<li>Enzim tedavisinden sonra, gangliyolayı bir hücre odasının Sylgard Silikon tabanına sabitleyin (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) ve oda sıcaklığında (18 °C±2) ASW (akış hızı: 150 μl/ dk) ile perfuse. NOT: Tanımlanan nöronların görünürlüğünü artırmak için ganglionu, 20X ve 40X büyütmeli dürbün stereomikroskop kullanılarak alttan kolayca aydınlatılabilen polikarbonat cam silindirin(Şekil 1) (çap Ø= 2 mm modifiye hücre odası) üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Kılıbını, kümesleri ve mikrosirsörler kullanarak gangliyondan dikkatlice çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki nörondan eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt.<ol>
<li>İlgi çekici nöronları tanımlayın.</li>
		<li>Nöron, 3 M KCl çözeltisi ile doldurulmuş 10-15 MΩ dirençli tek bir hücre içi keskin mikroelekrod ile impale edin.</li>
		<li>Hücre içi kayıt sistemi kullanarak nöronal aktiviteyi (10 kHz bant geçişi) kaydedin.</li>
		<li>Kayıt verilerini Axograph gibi elektrofizyoloji yazılımı kullanarak işleyin. NOT: Kişi birden fazla nörondan kaydı kolayca gerçekleştirebilir. Nöronlar L7, L11 veya R15 ve R2 konumlarına göre kolayca tanımlanır. İki L7 ve R15 nörondan aynı anda kayıt için iki amplifikatör ve iki mikromanipülatör gereklidir (Şekil 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>İlaç uygulaması.<ol>
<li>Seçtiğiniz ilacı nazik pipetleme ile hücre odasına uygulayın veya doğrudan nöronlara enjekte edin.</li>
		<li>Elektrofizyolojik ölçümler yapmak. NOT: Deneysel hedefe bağlı olarak, ilaç uygulamasından önce, ilaç uygulaması sırasında ve sonrasında membran potansiyelindeki (MP) veya eylem potansiyelindeki (AP) değişiklikler gibi nöronların farklı elektrofizyolojik parametreleri ölçülebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek nöronların izolasyonu.<ol>
<li>Elektrofizyolojik deneylerin sonunda, ASW'nin perfüzyonunu durdurun ve ganglionu% 100 etanol ile yıkayın.  Etanol maruziyeti nöronları taşlaştıracak ve ince kümesler kullanarak, gangliondan diğer nöronlara zarar vermeden bireysel nöronların çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.</li>
		<li>Stereomikroskop altında tek nöronları çıkarın ve buz gibi 500 μl RNA ekstraksiyon reaktifi içeren küçük bir Eppendorf tüpüne aktarın. İzole tek nöronlar gelecekteki analizler için -80 °C'de RNA ekstraksiyon reaktifinde saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qPCR) ile Tek Nöronlardan RNA İzolasyonu ve Gen Ekspresyon Analizi
<ol><li>RNA bozulmasını en aza indirmek için önlemler: Ribonikleazlar (RNazlar) RNA'yı bozar ve çok kararlı ve aktif enzimlerdir. RNA'ları işlerken aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Çalışma alanını ve aletleri RNase devre dışı bırakma ajanları ile temizleyin.</li>
		<li>RNA kullanırken her zaman eldiven giyin ve sık sık eldiven değiştirin.</li>
		<li>RNA'ları işlemek için yalnızca RNase içermeyen plastikler kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Total RNA'nın Tek nöronlardan izole edilmesi:<ol>
<li>RNA izolasyonu için standart Trizol protokolü, RNA'ları tek nöronlardan izole etmek için kullanılabilir. Trizol'a kısaca% 20 v / v kloroform ekleyin, kısa girdap ile iyice karıştırın.</li>
		<li>Tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca rotator üzerine yerleştirin. Trizol-Kloroform karışımını 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika döndürün.</li>
		<li>Sulu fazı toplayın ve taze bir tüpe aktarın.</li>
		<li>RNA'yı çökeltmek için 0,3 M, 100 ng/ml coprecipitant GlycoBlue ve 2,5 hacim %100 etanol nihai konsantrasyonuna sodyum asetat çözeltisi (pH 5,5) ekleyin.</li>
		<li>Numuneleri iyice karıştırın ve gece boyunca -80 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün ve tüpün dibinde küçük mavi bir pelet görünecektir.</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve peletin 850 μl% 75 buz gibi etanol ile 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Üstnatant dikkatlice çıkarın ve RNA peletini maksimum 7-10 dakika boyunca havayla kurulayın. NOT: RNA'nın uzunsüre kurumaya bırakılmamasını bekleyin - RNA peletininkurutılması çözünürlüğü çok zorlaştırır.
</li>
		<li>Kuruduktan sonra, RNA peletini 10 μl RNAse serbest suya yeniden boşaltın ve RNA konsantrasyonu belirleyin. NOT: Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu belirleyin. Hemen kullanmadığınızda, RNA'yı -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>tek nöronlardan aRNA sentezi:<ol>
<li>Ticari olarak kullanılabilen doğrusal RNA amplifikasyon sistemini kullanarak RNA'yı (deneysel hedefe bağlı olarak bir veya iki tur) güçlendirin. NOT: Tek nöronlardan elde edilen toplam RNA ~10-60 ng arasında değişmektedir. İlk tur amplifikasyonun beklenen verimi ~100-300 ng ve ikinci amplifikasyon turu ~0.8-1.5 μg RNA'dır.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA'nın ters transkripsiyon:<ol>
<li>aRNA'dan cDNA oluşturmak için, 20 μl ters transkripsiyon reaksiyonunda 1,0 μg aRNA kullanın. Bu amaçla çeşitli kitler ticari olarak mevcuttur. NOT: cDNA, termal çevrimcide aşağıdaki ayarlar kullanılarak üreticinin protokolüne göre sentezlenmiştir. 25 °C'de 5 dk 42 °C'de 30 dk 85 °C'de 5 dk 4 °C'de tutun</li>
		<li>Ters transkripsiyon adımından sonra, cDNA'yı uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Astar tasarımı ve standardizasyonu: Gerçek zamanlı amplifikasyonlar için astarlar tasarlamak için ücretsiz olarak çeşitli mükemmel yazılım programları mevcuttur.<ol>
<li>70-110 bp amplicon üreten ve astarları ticari kaynakları kullanarak sentezleyen 18-24 mer oligonükleotid seçin. NOT: İlgi çekici her gen için iki ila üç astar çifti tasarlanmalıdır. Her astar setin qPCR tarafından standartlaştırılması gerekir. CREB1 geni için kullanılan ileri ve geri astar çiftleri (Şekil 4) aşağıdadır: Astar seti 1 İleri: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3' Geri vites: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Astar seti 2 İleri: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Ters: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Aşağı akış analizleri için kullanılacak en iyi astarı seçmek için ct değerini ve qPCR'deki amplifikasyon eğrisinin şeklini izleyin. NOT: PCR'nin üstel fazında 40 yuvarlak amplifikasyonda 10-35 arasında Ct (Döngü eşiği) değerleri ve ardından pürüzsüz bir plato ile pürüzsüz eğriler veren primerler gen ekspresyon analizleri için en uygunudur.</li>
	</ol></li>
	<li>Nicel Gerçek Zamanlı PCR (qPCR): Not: qPCR makinesiyle uyumlu uygun tüpler veya plakalar kullanın.<ol>
<li>CDNA'yı çekirdeksiz su ile 5x'e seyreltin.</li>
		<li>2 μl seyreltilmiş cDNA'ya, 2 μl H 2 O, 5 μl2xSYBR Green master mix ve 10 μM (her biri) ileri ve ters astar içeren 8 μl qPCR ana karışımı ekleyin.</li>
		<li>Boruları kapatın ve cDNA ve ana karışımı pipetledikten sonra plakayı kapatın. 30 saniye boyunca 1.500 rpm'de hafifçe dokunup aşağı döndürerek içeriği karıştırın.</li>
		<li>qPCR makinesini kurmaya devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların herhangi bir rakip finansal çıkarları yok.

Nöron R15 kardiyovasküler, sindirim, solunum ve üreme sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar30. AP'nin düzenli olarak ritmik bir patlama aktivitesi R15'in bir özelliğidir. Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, R15 ve L7'nin eşleştirilmiş kaydı, gangliyon preparatının R15 nöronlarının aktivitesini koruduğunu göstermektedir. R15 ve L7 nöronları Ach'e uygun şekilde yanıt verdi. Bu gangliyon preparat 8-10 saate kadar sürdürülebilir ve elektrofizyolojik aktivite sürekli olarak izlenebilir. Böylece, kısa nörotransmitter maruziyetinin elektrofizyolojik etkileri (belirli bir nörona veya banyoya lokal olarak maruz kalır) uzun bir süre incelenebilir. Ayrıca, birden fazla nörotransmittere maruz kalmanın (aynı anda veya birlikte) aynı nöron üzerindeki etkilerini, kendisinin veya takipçi nöronun veya her ikisinin ateşleme özellikleri üzerinde inceleyebilme.
qPCR ile gen ekspresyon ölçümlerine bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. Tek bir nöronun RNA içeriği düşük olduğundan, birden fazla genin nicel ekspresyonu için yeterli miktarda RNA elde etmek için in vitro amplifikasyon gereklidir. Tüp bebek transkripsiyon işlemi için ticari kitler mevcuttur. CREB1 transkriptinin amplifikasyonu, standartlaştırılmış bir floresan sinyali elde etmek için gereken döngü sayısı ile doğrudan ölçüldü, Ct yöntemi31. Tek bir nörondan güçlendirilmiş RNA, mikroarray32 kullanarak çok sayıda gendeki gen ekspresyon değişikliklerini belirlemek için çalışmalar için ve RNAseq analizleri ile tüm transkriptom içinyeterlidir 33.
Bu tekniğin bir sınırlaması, bu preparatın abdominal gangliyonların nöronlarının tüm sinaptik bağlantılarını koruyamayabileceğidir. Nöronların bazıları diğer gangliyonlarda nöronlarla sinaps oluşturur ve gangliyon preparatında bu uzun mesafeli bağlantılar kaçırılacaktır. Bununla birlikte, burada açıklanan metodoloji tüm CNS'yi içerecek şekilde kolayca değiştirilebilir veya solungaç ve sifon çekme refleksinde hücresel ve elektrofizyolojik değişiklikleri incelemek için tanımlanan yarı bozulmamış preparat13,14,16'ya kolayca entegre edilebilir.
Genomik tekniklerdeki son gelişmeler artık kodlama ve kodlamayan RNA'ların ifade dinamikleri hakkında derin bir fikir edinmemizi sağlıyorRNA'lar 34. Burada açıklanan azaltılmış preparat, elektrofizyolojik ölçümlerle birlikte gen ekspresyonunun zamansal değişikliklerini incelemek için idealdir. Örneğin, farmakolojik ajanlar uygulanabilir ve etkilerini aynı sinir devresinin bir parçası olan bireysel nöronların veya birden fazla nöronun elektriksel özellikleri üzerinde ölçebilir ve RNA izolasyonu için farklı zamanlarda bireysel nöronları izole edebilirsiniz. Tek bir nöronun manipülasyonunun (elektriksel stimülasyon veya farmakolojik ajanlara maruz kalma gibi) tanımlanan devrelerin tamamı üzerindeki etkisi, tek nöronlarda belirli genlerin ekspresyasyonundaki değişiklikler düzeyinde incelenebilir. Bu nedenle bu metodoloji, Aplysia'dakisinir devrelerini incelemek için elektrofizyolojik ve genomik metodolojilerin başarılı bir şekilde entegrasyonunu kolaylaştırır.
Bu yaklaşım, sinir sistemleri tanımlanmış birkaç nöron içeren nudibranch yumuşakça Tritonia, gölet salyangozu Lymnaea ve karasal salyangoz Helix gibi diğer omurgasız modellerin çalışmasına kolaycagenişletilebilir. Bu modeller ayrıca kaçış yüzme, manyetik alan yönelimi, sinaps oluşumu, öğrenme ve hafıza depolama gibi davranışların sinir kontrolünün incelenmesi için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Tarif ettiğimiz metodoloji, genomik analizin tek hücre düzeyinde nöronal aktivitenin fizyolojik ölçümleriyle basit bir entegrasyonudur. Bu tür çalışmalardan, davranışın nöral kontrolünün moleküler ve fizyolojik temeli hakkında daha derin bir içgörü elde edilebilir.

İnsan beyni, neredeyse 100 milyar nöron ve trilyonlarca sinaptik bağlantı ile olağanüstü karmaşıktır. Nöronlarla etkileşime giren ve beyindeki işlevlerini düzenleyen neredeyse eşit sayıda nonneuronal hücre vardır. Nöronlar belirli davranışları düzenleyen devreler halinde düzenlenir. Beyin fonksiyonlarını ve sinir devrelerini anlamamızdaki gelişmelere rağmen, belirli bir davranışı kontrol eden devre bileşenlerinin kimliği hakkında çok az şey bilinmektedir. Bir devrenin çeşitli bileşenlerinin kimliklerinin bilgisi, davranışın hem hücresel hem de moleküler temelini anlamamızı büyük ölçüde kolaylaştıracak ve nöropsikiyatrik bozukluklar için yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır.
Deniz salyangozu Aplysia californica, belirli davranışların altında kalan nöronal devreleri belirlemek için bir çalışma atı olmuştur1-14. Aplysia sinir sistemi, 9 farklı gangliyon halinde organize edilmiş yaklaşık 20.000 nöron içerir. Aplysia'nın nöronları büyüktür ve boyutlarına, elektriksel özelliklerine ve gangliyondaki konumlarına göre kolayca tanımlanabilir. Aplysia, çalışılabilen zengin bir davranış repertuarına sahiptir. İyi çalışılmış davranışlardan biri solungaç çekme refleksidir (GWR). Bu refleksin merkezi bileşenleri abdominal gangliyonlarda bulunur. GWR devresinin bileşenleri haritalandı ve çeşitli bileşenlerin katkıları belirlendi. Daha da önemlisi, GWR devresi ilişkilendirilebilir ve ilişkisiz öğrenmeden geçer5,6,15-19. Bu refleks üzerinde onlarca yıllık çalışma da öğrenme ve hafızada kilit bir role sahip birkaç sinyal yolu tanımlamıştır20-24.
Hafıza depolamanın hücresel ve moleküler temelini incelemek için Aplysia'nın birkaç farklı preparatı kullanıldı. Bunlar arasında sağlam hayvan2,3, yarı bozulmamış hazırlık1,7,13,14,16 ve nöral devrenin ana bileşenlerinin yeniden25-29. Tanımlanan nöronal devrelerin elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia gangliyonlarını keşfetmeye yönelik daha az hazırlık burada açıklanmıştır. Tespit edilen dört nöron incelendi. R15, patlayan bir nöron, L7 ve L11, iki farklı motor nöron ve bir kolinerjik nöron olan R2 incelendi. R2 omurgasız sinir sisteminde tanımlanan en büyük nörondur. Kısaca, bu metodoloji gangliyonların proteaz tedavisini, farmakolojik tedavilerden önce ve sonra elektrofizyolojik ölçümleri ve gen ekspresyonunun nicel analizi için tek nöronların izolasyonu içerir. Bu metodoloji, moleküler analizleri birden fazla nörondan eşzamanlı kayıtla birleştirmemizi sağlar. Bu metodoloji, R15 ve L7 nöronlarının asetilkoline (Ach) eşleştirilmiş hücre içi kayıtlarla verdiği yanıtları incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümler sonrasında R15 ve L7 ve L11 ve R2 gibi tanımlanan diğer nöronlar, bellek depolama için önemli bir transkripsiyon faktörü olan CREB1 ekspresyonunun nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için izole edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Nörobiyolojide önemli bir zorluk, belirli bir davranışı yöneten sinir devrelerinin moleküler temellerini anlamaktır. Spesifik moleküler mekanizmalar belirlendikten sonra, dejeneratif hastalıkların veya sinir sisteminin yaşlanmasının neden olduğu belirli davranışlardaki anormallikleri tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler geliştirilebilir. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelinin araştırılması için çok uygundur, çünkü belirli bir davranışın altında kalan sinir devreleri kolayca belirlenebilir ve devrenin bireysel bileşenleri kolayca manipüle edilebilir. Aplysia'nın bu avantajları, öğrenme ve hafıza nörobiyolojisinin birkaç temel keşifine yol açmıştır. Burada, aplysia sinir sisteminin bireysel nöronların elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için bir hazırlığını açıklıyoruz. Kısaca, sinir sisteminden parçalanan ganglion, ganglion kılıfını çıkarmak için proteazlara maruz kalır, böylece nöronlar maruz kalır, ancak bozulmamış hayvanda olduğu gibi nöronal aktiviteyi korur. Bu preparat, tek veya birden fazla nöronun elektrofizyolojik ölçümlerini yapmak için kullanılır. Daha da önemlisi, basit bir metodoloji kullanılarak kaydı takiben, nöronlar gen ekspresyon analizi için doğrudan gangliyondan izole edilebilir. Bu protokoller, L7 ve R15 nöronlarından eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmek, aplysia'nınizole tek L7, L11, R15 ve R2 nöronlarında CREB1 geninin asetilkolin ve nicel ekspresyonlarına yanıtlarını incelemek için kullanıldı.

Bu çalışmada kullanılan hayvanların ağırlıkları 100-200 g arasında değişmektedir. Açıklanan protokollerin ardından 2-5 g ile 200-300 g arasında değişen hayvanlardan izole edilmiş abdominal gangliyon nöronlarının elektrofizyolojik ölçümlerini ve moleküler analizlerini yaptık.
Proteaz tedavisinin standardizasyonu, gangliyonlardaki nöronların başarılı elektrofizyolojik ölçümleri için önemlidir. Başlangıçta, birden fazla proteaz (Dispase) konsantrasyonu ve süresi kullanıldı ve R15 nörondan patlama eylem potansiyellerikaydedildi 26,31. Bu ölçümler bozulmamış gangliyondan doğrudan (proteaz tedavisi olmadan) kayıtla karşılaştırıldı. Sonraki deneylerde, proteaz olmadan maruz kalan ganglionlardan elde edilenlerle karşılaştırılabilir patlama potansiyelleri üreten proteaz konsantrasyonu (%0.1 proteaz, bkz. adım 1.3) kullanılmıştır.
Açıklanan protokol kullanılarak, Ach'ın kolinerjik bir nöron olan R15'e ve Ach'a yanıt vermeyen bir motor nöron olan L7'ye maruz kalmasına yanıt olarak eylem potansiyelleri (AP) kaydedildi. Beklendiği gibi, eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtlar, Ach'ın R15'te depolarizasyona neden olduğunu, L7'nin ateşlenmesinde bir değişiklik olmadığını göstermektedir. Şekil 2, Asetilkolin (Ach) uygulamasını doğrudan hücre odasına gösterir. Odanın içinde son 1 mM konsantrasyon elde etmek için mikropipette kullanılarak doğrudan odaya 1 M Ach (hacim 0,3 μl) uygulandı.
Ach perfüzyon ile banyodan yıkandı ve R15 nöronlarından tekrar kaydedildi. Şekil 3, Ach etkisinin geri döndürülebilir olduğunu gösteren dalga formlarını göstermektedir. Ap parametrelerinin analizi kontrol altında, depolarizasyon sırasında ve yıkamadan sonra gösterilir. Depolarizasyon sırasında genlik azalır ve AP süresi önemli ölçüde artar.
Elektrofizyolojik ölçümler sonrasında R15 ve L7 nöronları izole edildi ve QPCR analizleri için RNA'lar hazırlandı. Ambion'dan MessageAmp II aRNA Amplifikasyon Kiti kullanılarak doğrusal bir T7 RNA Polimeraz tahrikli transkripsiyon, RNA'ları tek nöronlardan yükseltmek için kullanıldı. Karşılaştırma için, tanımlanan nöronlar R2 ve L11 ve yetişkin (6-9 aylık) ve genç hayvanlardan (1-2 aylık) tüm abdominal gangliyonlar da çalışıldı. qPCR amplifikasyonu aşağıdaki koşullar altında 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sisteminde gerçekleştirildi: 10 dakika için 95 °C, ardından 15 sn için 95 °C 40 döngü, 1 dakika için 60 °C. Deneyde dört biyolojik kopya vardı. Her biyolojik kopyanın qPCR kurulumunda dört teknik çoğaltması vardı. Dört kopyadan CT değerleri ortalama alındı ve her örnekte CREB1'in mutlak ifade düzeyini bulmak için 1/Ct hesaplandı (Şekil 4). Genç ve yetişkin Aplysia gangliyonlarında CREB1 geninin mutlak ekspresyon seviyelerinin tahmini ve tanımlanan dört tek nöronda qPCR ölçümlerinden elde edilen Ct değeri ile izlendi.
Başlangıç mRNA konsantrasyonu hem genç hem de yetişkin abdominal gangliyonlarda aynıydı. Aynı ileri ve ters CREB1 astar seti, hem gangliyon hem de tek nöronların kullanıldığı çalışmalarda tüm qPCR'lerde kullanılmıştır. Ct değerleri genç ve yetişkin abdominal gangliyon arasında çok benzerdir. Benzer şekilde, başlangıç toplam mRNA konsantrasyonlarının düşük olduğu ve iki tur amplifikasyonun cDNA sentezi için iyi miktarda RNA verdiği tek nöronlarda Bt değerleri ölçüldü. CREB1 amplifikasyonunun Bt değerleri, R15 ve L7 nöronlarındaki CREB1 ekspresyonunun karşılaştırılabilir olduğunu, R2 ve L11'in ise L7 veya R15 ile karşılaştırıldığında ifadede önemli farklılıklar gösterdiğini ileri sürmektedir (Öğrencinin T testi, s<0.05) (Şekil 4).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig1.jpg"> Şekil 1. Gangliyon elektrofizyolojisi için mikroskop aşaması ve perfüzyon sistemi. Perfüzyon sistemi ve aşaması Pleksiglas kullanılarak yapılmıştır ve şeffaftır. Bu kurulum, konumu korumak için metal bir bloğa (gösterilmez) monte edilir. Metal blok, numunelerin alttan aydınlatılabilmesi için tasarlanmıştır. R15 nörondan kaydedilen örnek bir elektrofizyolojik patlama paterni gösterilmiştir.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig2.jpg"> Şekil 2. Karın gangliyonunun L7 ve R15 nöronlarından eşzamanlı kayıt. (A) L7 ve R15 nöronlarının konumunu gösteren abdominal gangliyon karikatürü (Kandel 2001'den değiştirildi, AAAS'den izin atılmış olarak yeniden basıldı). Ayrıca karın gangliyonunda R2 ve L11 pozisyonları gösterilmiştir. (B) L7 ve R15'ten temsili hücre içi kayıtlar. Ok, Ach uygulamasının zamanını gösterir. Bu ölçümlere 8-10 saat devam edilebilir.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig3.jpg"> Şekil 3. R15'in eylem potansiyelinde (AP) ach kaynaklı değişiklikler. AP dalga formları Ach maruziyeti öncesinde, sırasında ve sonrasında analiz edildi. Temsili dalga formları gösterilir. ms: milisaniye, mV: milivolt.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51075/51075fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51075/51075fig4.jpg"> Şekil 4. abdominal gangliyonlarda CREB1 ekspresyonunun qPCR analizi ve tek tanımlanmış nöronlar. (A) Aplysia'nıngenç ve yetişkin abdominal gangliyonlarında CREB1 transkriptinin mutlak nicelemesi . Toplam RNA, yöntemlerde açıklandığı gibi standart Trizol protokolü kullanılarak izole edilmiştir. CDNA sentezlemek için 1 μg toplam RNA kullanıldı, ardından CREB1 astarları kullanılarak gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu yapıldı. (B) Creb1 transkriptinin eski Aplysia'nıntanımlanmış tek nöronlarında mutlak nicelemesi . Total RNA, cDNA sentezi öncesinde iki tur in vitro amplifikasyona maruz kaldı. CDNA sentezlemek için 1 μg aRNA kullanıldı, ardından CREB1 astarları kullanılarak gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu yapıldı.

Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Görüntüleme.  The Scripps Research Institute, Florida. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Video: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Tek Parçacıklar için mikroakışkan tabanlı Hidrodinamik Tuzak

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Biyomühendislik

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Moleküler Dolaşıklık Biyopolimerlerin Electrospinnability

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Sıkıştırılmış Kolajen kıyılmış Doku: Tek aşamalı Rekonstrüktif Onarım için Cep içeren Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Doku Mühendisliği Thermoresponsive Nanostructured Yüzeylerin Hazırlanması

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

Kimya ve Biyoalgılayıcı Uygulamaları için Silikon Nanotel Alan etkili Transistör hazırlanması

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

Baculum diseksiyonu, mikroBT Tarama ve Morfometrik Analizleri

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...